二甲雙胍調(diào)節(jié)mTOR/HIF-1α通路對(duì)子癇前期大鼠免疫反應(yīng)的影響及作用機(jī)制

魯小紅 黃麗瓊 賀 藝 瞿小祥 （咸寧市中心醫(yī)院產(chǎn)科，咸寧437100）

子癇前期（pre-eclampsia，PE）是一種妊娠特異性的、免疫介導(dǎo)的綜合征，其特征是高血壓發(fā)作，并在妊娠20周后常常伴有尿蛋白增加［1］。免疫在PE發(fā)生中起到關(guān)鍵作用，研究顯示蛻膜中的免疫細(xì)胞主要由蛻膜自然殺傷細(xì)胞和T細(xì)胞（約10%）等組成，研究顯示Th17細(xì)胞水平的升高和Treg水平的降低會(huì)影響滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲和血管生成［2-3］。免疫細(xì)胞的分化受到哺乳動(dòng)物雷帕霉素受體（mammalian target of rapamycin，mTOR）的調(diào)控，mTOR可通過(guò)調(diào)節(jié)缺 氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α） 的表達(dá)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的分化［4］。mTOR/HIF-1α可以通過(guò)調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和遷移參與PE的發(fā)生，但是該通路是否可通過(guò)調(diào)節(jié)免疫水平參與PE尚不明確。最新有研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以治療妊娠糖尿病，并且具有預(yù)防PE的作用，但是其機(jī)制仍不清楚［5-6］。本文主要基于mTOR/HIF-1α途徑探討二甲雙胍對(duì)PE的影響以及對(duì)免疫水平的影響，為臨床更好地治療PE提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級(jí)SD大鼠（雌性和雄性，240～260 g，8～12周，南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，中國(guó)）；L-硝基精氨酸甲酯（Q110297，上海雅吉生物，中國(guó)）；無(wú)創(chuàng)血壓檢測(cè)系統(tǒng)（Kent Scientific公司，美國(guó)）；二脲試劑（HPBIO-R1253，鵬派生物技術(shù)公司，中國(guó)）；生化試劑盒（Neyotime公司，中國(guó)）；標(biāo)準(zhǔn)Ficoll Hypaque梯度離心試劑（Axis Shield公司，英國(guó)）；蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑（Invitrogen，Carlsbad，CA，美國(guó)）；CD4+、CD25、FOXP3和IL-17抗體以及BD Aria IIY熒光活細(xì)胞分選儀（BD公司，美國(guó)）；RNAspin Mini試劑盒（GE Healthcare，美國(guó)）；Bestar qPCR RT和BestarTMqPCR試劑盒（DBI Bioscience公司，德國(guó)）；Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測(cè)系統(tǒng)（Santa公司，美國(guó)）；免疫組化染色I(xiàn)L-17抗體、FOXP3抗體和二抗（ab168194，ab75763）、一抗和山羊抗兔HRP-IgG二抗（ab205718，Abcam公司，美國(guó)）；PVDF膜（JS0344，JSENB公司，中國(guó)香港）；ECL顯色試劑盒（Thermo Fisher公司，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組、建模和干預(yù) 使大鼠適應(yīng)環(huán)境 1周，并置于25～26 ℃通風(fēng)良好的籠中，相對(duì)濕度為50%～70%，定期進(jìn)行紫外線消毒，在6：00 至18：00 進(jìn)行光照，并自由攝入食物和水。將大鼠交配（雌性∶雄性2∶1），并在第2天早晨收集陰道涂片置于顯微鏡下觀察。在涂片上觀察到精子存在的日期為妊娠第0天。在妊娠第5天至第10天，將總共45只妊娠大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、PE組和PE+二甲雙胍組（n=15）。從妊娠第10天開始，PE組和PE+二甲雙胍組大鼠連續(xù)皮下注射劑量為250 mg/（kg·d）的L-硝基精氨酸甲酯構(gòu)建PE模型，連續(xù)7 d［7］。對(duì)照組大鼠注射等體積的生理鹽水。PE+二甲雙胍組大鼠在妊娠第10 天通過(guò)二甲雙胍灌胃，劑量為200 mg/（kg·d），連續(xù)7 d。

1.2.2 觀察指標(biāo)及方法

1.2.2.1 血壓檢測(cè) 在妊娠的第9天和第18天，通過(guò)尾氣袖帶法使用無(wú)創(chuàng)血壓檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)量大鼠的收縮壓。血壓測(cè)量在上午8：00進(jìn)行，在測(cè)量前將大鼠禁食2 h，在測(cè)量前測(cè)量器置于預(yù)熱的恒溫器（37 ℃）中10 min。隨后，在測(cè)量過(guò)程中，將室溫保持在25 ℃。使用預(yù)調(diào)節(jié)的尾袖裝置在大鼠心律穩(wěn)定時(shí)將夾子置于大鼠尾巴的根部，以測(cè)量大鼠的血壓。測(cè)量每只大鼠的血壓3次，取其平均值。

1.2.2.2 24 h尿蛋白 在妊娠第9天和第18天從每組大鼠中收集尿液，在717 g和4 ℃下將尿液離心10 min去除沉淀物。將縮二脲試劑添加到尿液樣本中以檢測(cè)24 h尿蛋白。

1.2.2.3 免疫組化染色檢測(cè)蛻膜組織中免疫細(xì)胞浸潤(rùn) 通過(guò)免疫組化染色檢測(cè)子宮蛻膜組織中Th17細(xì)胞標(biāo)志蛋白IL-17評(píng)估Th17細(xì)胞浸潤(rùn)情況［8］，通過(guò)檢測(cè)Treg細(xì)胞標(biāo)志蛋白叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子 （FOXP3）評(píng)估Treg細(xì)胞浸潤(rùn)情況。將蛻膜組織用4%的聚甲醛固定并用梯度乙醇脫水，包埋在石蠟中，制成厚度為5 μm的組織玻片標(biāo)本，將切片置于-20 ℃的冷丙酮中固定15 min。然后在37 ℃下分別與抗大鼠IL-17和FOXP3抗體孵育1 h，然后加入二抗進(jìn)行顯色，最后利用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，棕色和黃色染色代表陽(yáng)性細(xì)胞。隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞比例（%）=IL-17或FOXP3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17和Treg細(xì)胞比例 大鼠處死前抽取尾靜脈血液，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)Ficoll Hypaque梯度離心試劑分離外周血單個(gè)核細(xì)胞。將所得的單個(gè)核細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液以500 μg/g洗滌兩次，每次持續(xù)5 min。通過(guò)磁激活細(xì)胞分選試劑從外周血單個(gè)核細(xì)胞中分離出CD4+T細(xì)胞。為了分析Treg細(xì)胞，單個(gè)核細(xì)胞通過(guò)與大鼠抗CD25（5 μg/ml）和抗大鼠FOXP3（5 μg/ml）在黑暗中孵育20 min進(jìn)行表面標(biāo)記染色。為了分析Th17細(xì)胞，在24孔板中用含有蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑的細(xì)胞刺激混合物孵育4 h。然后將細(xì)胞收獲至5 μl的無(wú)菌試管中，洗滌后加入大鼠抗CD4（5 μg/ml）和抗大鼠IL-17（5 μg/ml）在黑暗中孵育20 min進(jìn)行表面標(biāo)記染色。使用BD Aria Ⅱ活細(xì)胞分選儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析。

1.2.2.5 RT-qPCR 使用RNAspin Mini試劑盒從收集到的CD4+T細(xì)胞中提取RNA，然后使用Bestar qPCR RT試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，條件如下：37 ℃ /15 min；98 ℃ /5 min。使用BestarTMqPCR預(yù)混液進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)，條件如下：95 ℃/2 min， 94 ℃/20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃/20 s，40個(gè)循環(huán)，最后在72 ℃下延伸4 min。使用Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行RT-qPCR分析。mTOR正向引物：5'-ATGACGAGACCCAGGCTAAG-3'，反 向 引 物：5'-GCCAGTCCATGCCATCAG-3'；HIF-1α正 向 引 物：5'- GTTTACTAAAGGACAAGTCACC-3'，反向引物：5'- TTCTGTTTGTTGAAGGGAG-3'；GAPDH正向引物：5'-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3'，反向引物：5'- CAAAGTTGTCATGGATGHACC-3'。GAPDH作為內(nèi)源參照，通過(guò)比較循環(huán)閾值評(píng)估m(xù)RNA水平。

1.2.2.6 Western blot 將CD4+T細(xì)胞裂解后提取總蛋白并檢測(cè)濃度。然后分別取總量為40 μg的總蛋白進(jìn)行分離，分離條件為10%的聚丙烯酰胺凝膠、80～120 V、90 min。濕法轉(zhuǎn)膜，在100 mV下將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將一抗稀釋500倍后分別加入膜中并在4 ℃下孵育過(guò)夜。洗滌后加入山羊抗兔HRP-IgG二抗室溫孵育1 h。本研究?jī)?nèi)參為GAPDH，分析目標(biāo)蛋白條帶相對(duì)于GAPDH的灰度值分析蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以±s表示。統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS19.0軟件。組間比較分別使用方差檢驗(yàn)和SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍對(duì)PE大鼠收縮壓的影響 妊娠第 9天三組小鼠血壓均正常（P＞0.05）。在妊娠第18天三組的血壓比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PE組的收縮壓（148.23±11.96） mmHg和舒張壓（104.42±9.67） mmHg均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），PE+二甲雙胍組的收縮壓（128.74±10.35） mmHg和舒張壓（91.28±8.61） mmHg均顯著低于PE組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 二甲雙胍對(duì)PE大鼠血壓的影響（±s，n=15，mmHg）Tab.1 Effect of metformin on blood pressure of PE rats （±s，n=15，mmHg）

表1 二甲雙胍對(duì)PE大鼠血壓的影響（±s，n=15，mmHg）Tab.1 Effect of metformin on blood pressure of PE rats （±s，n=15，mmHg）

Note：1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs PE group.

2.2 二甲雙胍對(duì)PE大鼠24 h尿蛋白的影響 在妊娠第9天各組大鼠24 h尿蛋白均為0.09 g左右，處于正常范圍。在妊娠第18天三組的24 h尿蛋白比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PE組的24 h尿蛋白0.145±0.013 g顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），PE+二甲雙胍組的24 h尿蛋白（0.118±0.011 g顯著低于PE組（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 二甲雙胍對(duì)PE大鼠24 h尿蛋白的影響（±s，n=15， g/24 h）Tab.2 Effect of metformin on 24 h urine protein in PE rats（±s，n=15，g/24 h）

表2 二甲雙胍對(duì)PE大鼠24 h尿蛋白的影響（±s，n=15， g/24 h）Tab.2 Effect of metformin on 24 h urine protein in PE rats（±s，n=15，g/24 h）

Note：1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs PE group.

2.3 二甲雙胍對(duì)PE大鼠胎盤蛻膜組織中Th17和Treg細(xì)胞浸潤(rùn)的影響 如圖1所示，藍(lán)色為染色的細(xì)胞核，棕色為IL-17或FOXP3陽(yáng)性細(xì)胞。結(jié)果顯示，三組PE大鼠胎盤蛻膜組織中Th17和Treg細(xì)胞浸潤(rùn)情況比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PE組的Th17細(xì)胞比例（14.36±1.53）%和Th17/Treg比值（13.81±1.21）顯著高于對(duì)照組，Treg比例（1.04±0.12）%顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。PE+二甲雙胍組 的Th17細(xì) 胞 比例（9.83±1.06）%和Th17/Treg（4.31±0.45）顯 著 低 于PE組，Treg比 例（2.28±0.31）%顯著高于PE組（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 二甲雙胍對(duì)PE大鼠胎盤蛻膜組織中Th17和Treg細(xì)胞浸潤(rùn)的影響（±s，n=15）Tab.3 Effect of metformin on Th17 and Treg cell infiltration in placenta and decidua of PE rats （±s，n=15）

表3 二甲雙胍對(duì)PE大鼠胎盤蛻膜組織中Th17和Treg細(xì)胞浸潤(rùn)的影響（±s，n=15）Tab.3 Effect of metformin on Th17 and Treg cell infiltration in placenta and decidua of PE rats （±s，n=15）

Note：1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs PE group.

圖1 免疫組化染色檢測(cè)二甲雙胍對(duì)PE大鼠胎盤蛻膜組織中Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞浸潤(rùn)的影響（×200）Fig.1 Immunohistochemical staining to detect effect of metformin on infiltration of Treg cells and Th17 cells in placenta and decidua of PE rats （×200）

2.4 二甲雙胍對(duì)PE大鼠Th17和Treg細(xì)胞分化的影響 如圖2所示，CD4+IL17+為Th17細(xì)胞。CD25+FOXP3+為Treg細(xì)胞。三組大鼠外周血中Th17和Treg細(xì)胞比例比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PE組的Th17細(xì)胞比例（1.94±0.21）%和Th17/Treg（0.64±0.07）顯著高于對(duì)照組，Treg比例（3.02±0.36）%顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。PE+二甲雙胍組的Th17細(xì)胞比例（1.53±0.16）%和Th17/Treg（0.36±0.04）顯著低于PE組，Treg比例（4.21±0.51）%顯著高于PE組（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 二甲雙胍對(duì)PE大鼠Th17和Treg細(xì)胞分化的影響 （±s，n=15）Tab.4 Effect of metformin ondifferentiation of Th17 and Treg cells in PE rats （±s，n=15）

表4 二甲雙胍對(duì)PE大鼠Th17和Treg細(xì)胞分化的影響 （±s，n=15）Tab.4 Effect of metformin ondifferentiation of Th17 and Treg cells in PE rats （±s，n=15）

Note：1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs PE group.

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)二甲雙胍對(duì)PE大鼠Th17細(xì)胞分化的影響Fig.2 Flow cytometry detection of effect of metformin on differentiation of Th17 cells in PE rats

2.5 二甲雙胍對(duì)PE大鼠mTOR和HIF-1α mRNA表達(dá)水平的影響 三組的mTOR/HIF-1α 通路中基因轉(zhuǎn)錄水平比較差具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PE組的mTOR和HIF-1α mRNA顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），PE+二甲雙胍組的mTOR和HIF-1α mRNA水平顯著低于PE組（P＜0.05），見(jiàn)表5。

表5 二甲雙胍對(duì)PE大鼠mTOR和HIF-1α mRNA表達(dá)水平的影響（±s，n=15）Tab.5 Effect of metformin on expression levels of mTOR and HIF-1α mRNA in PE rats （±s，n=15）

表5 二甲雙胍對(duì)PE大鼠mTOR和HIF-1α mRNA表達(dá)水平的影響（±s，n=15）Tab.5 Effect of metformin on expression levels of mTOR and HIF-1α mRNA in PE rats （±s，n=15）

Note：1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs PE group.

2.6 二甲雙胍對(duì)PE大鼠mTOR/HIF-1α通路中蛋白表達(dá)水平的影響 三組的mTOR/HIF-1α通路中蛋白表達(dá)水平比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PE組的mTOR和HIF-1α蛋白水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），PE+二甲雙胍組的mTOR和HIF-1α蛋白水平顯著低于PE組（P＜0.05），見(jiàn)圖3、表6。

圖3 Western blot檢測(cè)二甲雙胍對(duì)PE大鼠mTOR和HIF-1α蛋白表達(dá)水平的影響Fig.3 Western blot detection of effect of metformin on expression of mTOR and HIF-1α protein in PE rats

表6 二甲雙胍對(duì)PE大鼠mTOR和HIF-1α蛋白表達(dá)水平的影響（±s，n=15）Tab.6 Effect of metformin on expression level of mTOR and HIF-1α protein in PE rats （±s，n=15）

表6 二甲雙胍對(duì)PE大鼠mTOR和HIF-1α蛋白表達(dá)水平的影響（±s，n=15）Tab.6 Effect of metformin on expression level of mTOR and HIF-1α protein in PE rats （±s，n=15）

Note：1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs PE group.

3 討論

PE是孕產(chǎn)婦病死和發(fā)病的主要原因，給醫(yī)療保健系統(tǒng)帶來(lái)了沉重負(fù)擔(dān)。據(jù)估計(jì)，全球PE的患病率約為所有妊娠婦女的5%～8%，在發(fā)展中國(guó)家可能更高［9］。PE是孕產(chǎn)婦和產(chǎn)前病死和發(fā)病的主要原因，并且目前臨床上缺乏有效的治療方法。二甲雙胍是雙胍類抗糖尿病，可防止肝臟糖異生并增加外周組織對(duì)胰島素的敏感性［10］。近年來(lái)研究顯示二甲雙胍在產(chǎn)科中廣泛應(yīng)用。研究證明二甲雙胍可有效治療妊娠糖尿病，并可能預(yù)防PE［11］。但是二甲雙胍對(duì)PE發(fā)展的影響隨機(jī)試驗(yàn)尚待進(jìn)行。

蛻膜中的免疫細(xì)胞主要由蛻膜自然殺傷細(xì)胞、Th17、Treg、巨噬細(xì)胞等組成。這些細(xì)胞分泌的各種免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子參與調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲、血管生成和螺旋動(dòng)脈重塑并誘導(dǎo)免疫耐受［12-13］。但是二甲雙胍是否可以調(diào)節(jié)PE免疫仍不清楚。本研究結(jié)果提示二甲雙胍可以顯著抑制PE大鼠的血壓，降低尿蛋白水平。此外，PE模型大鼠胎盤蛻膜組織中Th17細(xì)胞比例升高而Treg細(xì)胞比例明顯降低，二甲雙胍可以調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡。Th17細(xì)胞會(huì)分泌促炎因子從而誘發(fā)免疫炎癥反應(yīng)導(dǎo)致血壓升高和影響胎盤植入，Treg細(xì)胞會(huì)拮抗Th17功能，并起到免疫抑制作用，參與免疫耐受［14-15］。妊娠高血壓是PE的重要誘因，一項(xiàng)薈萃分析結(jié)果顯示二甲雙胍可以有效抑制血壓升高，并對(duì)PE具有緩解作用［16］。研究顯示二甲雙胍可能通過(guò)抑制Th17誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)改善自噬和線粒體功能，從而緩解糖尿病相關(guān)炎癥［17］。二甲雙胍也可以通過(guò)調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞減少脾臟生發(fā)中心的形成來(lái)減輕博來(lái)霉素誘導(dǎo)的硬皮?。?8］。LEE等［19］研究結(jié)果顯示二甲雙胍可抑制T細(xì)胞增殖并抑制Th1和Th17細(xì)胞分化，并可劑量依賴性方式促進(jìn)Treg的水平，從而緩解自身免疫性胰島炎。這提示二甲雙胍可能通過(guò)提高胎盤組織中Treg細(xì)胞水平，減少Th17細(xì)胞浸潤(rùn)，從而恢復(fù)母體對(duì)胎盤的免疫耐受，緩解PE。

為進(jìn)一步分析二甲雙胍緩解PE以及免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的機(jī)制，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了外周血中Th17和Treg的水平，以及CD4+細(xì)胞中mTOR/HIF-1α通路的表達(dá)水平。胎盤組織中的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)來(lái)源于外周血，而外周血的T細(xì)胞分化受到mTOR/HIF-1α通路的調(diào)控，研究提示mTOR會(huì)激活HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄水平誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，并減少Treg細(xì)胞的生成［20-21］。本次研究結(jié)果顯示二甲雙胍可使PE大鼠外周血中Th17/Treg平衡向Treg移動(dòng)，并抑制T淋巴細(xì)胞中mTOR和HIF-1α的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平。研究顯示二甲雙胍可以通過(guò)抑制mTOR/HIF-1α途徑抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌的增殖和運(yùn)動(dòng)能力［22］。二甲雙胍也可以通過(guò)抑制mTOR/HIF-1α 通路水平調(diào)節(jié)肝細(xì)胞癌患者異常的代謝功能［23］。AL-HASHEM等［24］的研究結(jié)果表明二甲雙胍可通過(guò)抑制mTOR/HIF-1α軸緩解硫代乙酰胺誘導(dǎo)的肝組織纖維化和炎癥。這提示二甲雙胍可能通過(guò)抑制mTOR/HIF-1α通路減少T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化并促進(jìn)Treg細(xì)胞分化，從而改善胎盤組織浸潤(rùn)的Th17/Treg平衡，恢復(fù)母體和胎兒正常的免疫水平，從而緩解PE。

綜上所述，二甲雙胍可能通過(guò)抑制mTOR/HIF-1α通路緩解調(diào)控外周血和胎盤組織中Th17/Treg平衡，恢復(fù)免疫耐受水平，從而緩解PE。關(guān)于二甲雙胍對(duì)PE的治療作用、安全性和對(duì)胎兒的影響仍需要臨床試驗(yàn)研究，并且其調(diào)控mTOR/HIF-1α通路的分子機(jī)制也需要進(jìn)一步研究。