基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)研究高原低氧對(duì)小鼠脾臟組織的影響①

李慧倩 胡 英 許玉珍 李積東 郭玉靜 永 勝 （青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 西寧 810016）

高海拔地區(qū)稀薄的氧氣環(huán)境對(duì)高原居民和進(jìn)駐者的身心健康產(chǎn)生很大影響。海拔上升3 000 m以上的高原地區(qū)后，大氣中的氧分壓會(huì)隨著海拔的升高急劇下降，進(jìn)而造成人體組織細(xì)胞缺氧，嚴(yán)重影響機(jī)體的新陳代謝和正常生理功能。由于海拔高度的變化引發(fā)的持續(xù)性低氧刺激會(huì)導(dǎo)致急進(jìn) 高原人群出現(xiàn)高原肺水腫（high altitude pulmonary edema，HAPE）和高原腦水腫（high altitude cerebral edema，HACE）等急性高原反應(yīng)，也會(huì)加劇高原常駐人群罹患多囊血癥和各種慢性心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)［1-2］。因此，機(jī)體在高原低氧暴露下的變化狀況以及各組織系統(tǒng)響應(yīng)低氧脅迫的分子機(jī)制成為近年來(lái)高原醫(yī)學(xué)研究備受關(guān)注的課題。眾所周知，免疫系統(tǒng)是機(jī)體重要的防御系統(tǒng)，對(duì)于維持組織穩(wěn)態(tài)平衡和機(jī)體各項(xiàng)功能的正常運(yùn)作有著不可替代的作用。研究發(fā)現(xiàn)，低氧可以通過(guò)低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factors，HIFs）驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的增殖、發(fā)育和效應(yīng)因子功能［3-4］。有報(bào)道稱(chēng)，缺氧可增加大鼠各器官的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥反應(yīng)，進(jìn)而參與急性高原疾病的發(fā)生、發(fā)展［5-6］。此外，也有研究顯示高原低氧暴露可導(dǎo)致免疫系統(tǒng)功能異常，從而加劇HAPE、HACE等急性高原反應(yīng)［7-8］。由此可見(jiàn)，高原低氧環(huán)境對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的相關(guān)影響亟待引起廣泛重視。

隨著新一代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)以及各種生物信息學(xué)工具的發(fā)展，基于RNA測(cè)序（RNA-sequencing， RNA-seq）的轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)日趨成熟。RNA-seq為基因組研究、免疫和發(fā)育基因鑒定以及數(shù)字基因表達(dá)分析奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，成為組學(xué)范圍內(nèi)分析差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）和闡明各種復(fù)雜性疾病潛在機(jī)制的不可或缺的工具［9］。目前，RNA-Seq技術(shù)已廣泛應(yīng)用在機(jī)體各個(gè)組織系統(tǒng)響應(yīng)低氧脅迫的研究中，揭示了一系列適應(yīng)低氧脅迫的分子變化。如XU等［10］發(fā)現(xiàn)低壓低氧暴露的大鼠肝臟模型中細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和半乳糖代謝等免疫相關(guān)代謝途徑在KEGG通路分析中得到了高度富集，提供了大鼠對(duì)應(yīng)激環(huán)境做出反應(yīng)的重要生理線索。在高原低氧暴露的大鼠肺組織中發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的NOD樣受體信號(hào)通路顯著上調(diào)，結(jié)合進(jìn)一步的炎癥因子檢測(cè)結(jié)果提示高原低氧暴露可能激活肺組織中的NF-κBp65和p38MAPK信號(hào)通路以促進(jìn)下游炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，從而加重肺組織重塑的發(fā)生和發(fā)展［11］。以上研究為揭示大鼠適應(yīng)高原低氧暴露的分子機(jī)制提供了新的思路。此外，高海拔牦牛與低海拔黃牛在心、腎、肝和肺4個(gè)主要器官的比較轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果提示牦牛在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中優(yōu)化了其抗低氧代謝系統(tǒng)以適應(yīng)高海拔環(huán)境［12］。有報(bào)道稱(chēng)，對(duì)來(lái)自不同海拔高度的山羊群體進(jìn)行心、肺和骨骼肌組織的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后，發(fā)現(xiàn)大量DEGs和單核苷酸變體基因在低氧相關(guān)的功能基因類(lèi)別中過(guò)度表達(dá)，且不同海拔山羊群體的心、肺和骨骼肌等不同組織中DEGs普遍在核糖體和蛋白質(zhì)合成等生物類(lèi)別富集，提示核糖體和蛋白質(zhì)生物合成過(guò)程的變化可能是山羊低氧習(xí)服的重要機(jī)制［13］；以上結(jié)果為探索哺乳動(dòng)物高原習(xí)服的復(fù)雜基因表達(dá)及其相關(guān)調(diào)控機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)。然而，利用RNA-Seq技術(shù)探究免疫組織響應(yīng)低氧應(yīng)激調(diào)控機(jī)制的報(bào)道仍然有限。

脾臟作為哺乳動(dòng)物最大的外周免疫器官，它不僅是免疫細(xì)胞（包括T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）定居與發(fā)生免疫應(yīng)答的部位、也是淋巴系統(tǒng)參與再循環(huán)與抗原識(shí)別的部位［14］，是機(jī)體免疫系統(tǒng)不可或缺的組成部分。因此，本次實(shí)驗(yàn)選取小鼠的脾臟組織作為研究對(duì)象，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，比較其在不同海拔暴露下的差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本，以篩選低氧脅迫適應(yīng)DEGs，并重點(diǎn)關(guān)注免疫相關(guān)DEGs集在高原低氧暴露下的變化，探究機(jī)體免疫系統(tǒng)響應(yīng)低氧應(yīng)激的分子機(jī)制，為相關(guān)高原病的病因?qū)W研究提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡的SPF級(jí)C57BL/6健康雄性小鼠（許可證號(hào)：SYXK（陜）2020-005）購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，保持環(huán)境衛(wèi)生，采用自由采食飲水方式飼養(yǎng)。待小鼠適應(yīng)周?chē)h(huán)境后，隨機(jī)分成兩組，5只/組。對(duì)照組即平原常氧組（PSC）：飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（海拔400 m）；②實(shí)驗(yàn)組即高原低氧組（HST）：飼養(yǎng)于青海省果洛藏族自治州瑪多縣人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房（海拔4 200 m）。兩組小鼠均在溫度為18～22 ℃，濕度為45%～55%的受控環(huán)境中分籠常規(guī)喂養(yǎng)，期間自由飲水、進(jìn)食。30 d后無(wú)菌采集小鼠脾臟，一部分置于10%中性甲醛溶液中固定保存，另一部分置于液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 Trizol裂解液（美國(guó)Invitrogen公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser）（RR047A），qPCR試劑盒（TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）（RR820A，TaKaRa，日本）；Illumina測(cè)序（北京諾禾致源有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取、cDNA文庫(kù)構(gòu)建以及Illumina測(cè)序 采用常規(guī)Trizol法提取各組小鼠脾臟總RNA，DNase I（RNase-free）消化殘余DNA。通過(guò)安捷倫2100生物分析儀檢測(cè)RNA完整性和質(zhì)量。經(jīng)富集、打斷、合成cDNA、末端修復(fù)、PCR擴(kuò)增等過(guò)程制備測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行Illumina測(cè)序。

1.2.2 RNA-Seq質(zhì)量評(píng)估和序列比對(duì) 對(duì)測(cè)序平臺(tái)得到的原始數(shù)據(jù)（Raw Reads）進(jìn)行質(zhì)量控制及過(guò)濾。對(duì)Clean Data進(jìn)行Q20、Q30和GC含量計(jì)算，同時(shí)選擇錯(cuò)誤率＜1%的數(shù)據(jù)用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組分析，更嚴(yán)格過(guò)濾得到High Quality Clean Reads。選用HISAT2軟件將Clean Reads與參考基因組進(jìn)行快速精確的比對(duì)，樣本之間（包括5個(gè)生物學(xué)重復(fù)）的基因表達(dá)水平采用皮爾遜相關(guān)性檢測(cè)進(jìn)行分析。

1.2.3 DEGs分析 采用Subread軟件中的Feature Counts工具對(duì)每個(gè)樣本分別進(jìn)行基因表達(dá)水平的定量分析，并利用FPKM（Fragments Per Kilobase per Million）先后對(duì)測(cè)序深度和基因長(zhǎng)度進(jìn)行了校正。

使用DESeq2軟件（1.20.0）進(jìn)行PSC組和HST組之間的DEGs分析，使用Benjamini & Hochberg 的方法校正P值。將校正后的P值（P-adjust）＜0.05且|log2FoldChange|＞0作為顯著差異表達(dá)的閾值。

1.2.4 GO注釋和KEGG分析 Gene Ontology（簡(jiǎn)稱(chēng)GO，http://www.geneontology.org/）即基因本體數(shù)據(jù)庫(kù)，包括分子功能（molecular function，MF）、生物過(guò)程（biological process，BP）和細(xì)胞組成（cellular component，CC）3個(gè)部分。富集分析采用軟件為clusterProfiler （3.4.4），找出DEGs顯著富集的GO條目并計(jì)算P-value。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http://www.kegg.jp/）是系統(tǒng)分析基因功能、基因組信息的數(shù)據(jù)庫(kù)。采用Blast GO軟件分析得到DEGs通路注釋信息，同時(shí)使用R軟件對(duì)注釋結(jié)果進(jìn)行通路顯著性富集分析并計(jì)算P-value，P＜0.05視為顯著富集。

1.2.5 基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA） 常規(guī)基于超幾何分布的富集分析依賴(lài)于顯著上調(diào)或下調(diào)的基因，容易遺漏部分差異表達(dá)不顯著但有重要生物學(xué)意義的基因。GSEA不需要指定明確的DEGs閾值，從基因集富集分析的角度出發(fā)，更容易囊括細(xì)微但協(xié)調(diào)性的變化對(duì)生物通路的影響。本研究通過(guò)Broad Institute提供的GSEA工具對(duì)KEGG數(shù)據(jù)集進(jìn)行GSEA（http://www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp），并 以NominalP-value＜0.05為閾值對(duì)結(jié)果進(jìn)行篩選，對(duì)此前的功能富集分析結(jié)果做出補(bǔ)充。

1.2.6 RT-qPCR驗(yàn)證與檢測(cè) 隨機(jī)選擇15個(gè)表達(dá)模式不同的上下調(diào)DEGs驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性。以β-actin作為內(nèi)參，進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證。采用2-ΔΔCt法測(cè)定實(shí)驗(yàn)組基因表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組的倍數(shù)變化，引物序列詳見(jiàn)表1。RT-qPCR反應(yīng)體系為20 μl，各試劑反應(yīng)量為：TB Green?Premix Ex TaqTMII 10 μl，RNase Free H2O 6.4 μl，cDNA 2 μl，PCR正反向引物各0.8 μl。反應(yīng)進(jìn)行條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 60 s；40個(gè)循環(huán)。通過(guò)SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果以±s表示。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 RT-qPCR引物信息Tab.1 Primers information of genes for RT-qPCR

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)處理與質(zhì)量評(píng)估 通過(guò)雙端測(cè)序法分別對(duì)PSC組和HST組的5個(gè)重復(fù)樣本進(jìn)行測(cè)序，構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)，并對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，獲得 了41.47 M（PSC）和40.68 M（HST）的Clean Reads。測(cè)序所得數(shù)據(jù)堿基錯(cuò)誤率均為0.02%，且各個(gè)樣本Q20均＞98.10%、Q30均＞94.64%，GC含量在48.30%～50.36%之間。這表明本次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較高、結(jié)果可靠，可用于后續(xù)分析（表2）。

表2 過(guò)濾后的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Tab.2 Statistics of filtered data

2.2 DEGs分析 在進(jìn)行4周的高原低氧處理后，比較PSC和HST的基因表達(dá)情況。共鑒定出4 218個(gè)DEGs，其中1 950個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，2 268個(gè)基因表達(dá)下調(diào)（|log2FC|≥0和P-adjust＜0.05）（圖1）。隨后對(duì)各組樣品進(jìn)行了皮爾遜相關(guān)性分析，結(jié)果顯示樣本間基因表達(dá)量的相關(guān)系數(shù)R2均＞0.953，表明樣品表達(dá)模式的相似程度較高，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠。為了研究高原低氧和平原常氧處理的脾臟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)之間的樣本異質(zhì)性，對(duì)所得DEGs進(jìn)行了層次聚類(lèi)分析。結(jié)果表明（圖2），生物學(xué)重復(fù)樣品之間基因表達(dá)情況較為一致（縱坐標(biāo)），不同海拔高度下小鼠脾臟組織對(duì)低氧的反應(yīng)較為不同（橫坐標(biāo)）。

圖1 DEGs火山圖Fig.1 Volcano plot of DEGs

圖2 DEGs熱圖Fig.2 DEGs heat map

2.3 DEGs的GO注釋分析 為了解DEGs在低氧脅迫反應(yīng)中的生物學(xué)功能，對(duì)先前所得的差異基因集進(jìn)行了GO注釋分析。結(jié)果顯示，DEGs主要分布在生物過(guò)程的B細(xì)胞激活、免疫應(yīng)答-激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)信號(hào)通路，細(xì)胞組分的免疫球蛋白復(fù)合體和免疫球蛋白復(fù)合體循環(huán)，以及分子功能的抗原結(jié)合和免疫球蛋白受體結(jié)合等分類(lèi)（圖3A）。因此，GO富集分析結(jié)果提示高原低氧脅迫條件下，機(jī)體的免疫系統(tǒng)發(fā)生了重要變化。

圖3 DEGs的GO注釋分析和KEGG通路富集分析Fig.3 GO annotation analysis and KEGG pathway enrichment diagram of DEGs

2.4 DEGs的KEGG富集分析 為了確定與低氧脅迫適應(yīng)相關(guān)的生物通路，并深入探討免疫系統(tǒng)響應(yīng)低氧應(yīng)激的分子機(jī)制，將兩組的免疫相關(guān)DEGs集映射到KEGG通路數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行富集分析，共富集到178個(gè)信號(hào)通路（P＜0.05），其中顯著富集的通路，如圖3B。結(jié)果顯示，DEGs在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、NOD樣受體信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路以及TNF信號(hào)通路等多個(gè)免疫炎癥相關(guān)信號(hào)通路中高度富集，說(shuō)明面對(duì)低氧脅迫，機(jī)體可能發(fā)生了免疫失衡和炎癥反應(yīng)。2.5 基于KEGG功能注釋的GSEA GSEA結(jié)果顯示（表3），HST組NOD樣受體信號(hào)通路富集，且表達(dá)趨勢(shì)上調(diào)，這與KEGG通路富集分析的結(jié)果一致，說(shuō)明NOD樣受體信號(hào)通路在低氧脅迫下發(fā)生了重要變化。

表3 DEGs的基因集富集分析Tab.3 Gene set enrichment analysis of DEGs

2.6 RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖4），15個(gè)隨機(jī)選擇的基因在HST組與PSC組之間均有顯著差異，且基因變化趨勢(shì)與RNA-seq的結(jié)果完全一致，進(jìn)一步證實(shí)了本次測(cè)序結(jié)果的可靠性。

圖4 RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果Fig.4 RT-qPCR validation results

3 討論

高原低氧脅迫影響機(jī)體免疫功能。本研究通過(guò)比較不同海拔暴露下的小鼠脾臟組織轉(zhuǎn)錄組譜，旨在找出與低氧脅迫適應(yīng)相關(guān)的DEGs及其表達(dá)模式，深入了解低氧脅迫影響免疫系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)制。

30 d的高原低氧暴露處理之后，與平原常氧處理相比，小鼠脾臟組織中多個(gè)基因發(fā)生了差異表達(dá)。其中差異最顯著且表達(dá)量較高的基因主要包括ANXA1、S100A8、S100A9和HSPB1等。ANXA1是一種糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)的蛋白，具有強(qiáng)大的抗炎和促分解功能。研究發(fā)現(xiàn)，ANXA1缺失的小鼠在實(shí)驗(yàn)性狼瘡性腎炎和結(jié)膜炎模型中表現(xiàn)出炎癥反應(yīng)加?。?5-16］；YANG等［17］證明缺氧可通過(guò)穩(wěn)定HIF-1α上調(diào)ANXA1的表達(dá)，而抑制HIF-1α?xí)钄嗳毖跽T導(dǎo)的ANXA1表達(dá)。低氧主要通過(guò)HIFs激活下游信號(hào)發(fā)揮各種調(diào)控功能，本研究中ANXA1基因的上調(diào)表達(dá)結(jié)合以上研究結(jié)果提示高原低氧脅迫激活了抗炎反應(yīng)過(guò)程。另外兩個(gè)表達(dá)顯著上調(diào)的因子是S100A8和S100A9，它們均是S100家族中的炎癥介質(zhì)，主要存在于中性粒細(xì)胞與單核細(xì)胞等先天免疫細(xì)胞之中。S100A8/A9主要通過(guò)與模式識(shí)別受體Toll樣受體4（TLR4）和晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）等結(jié)合激活下游信號(hào)通路從而誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞向炎癥部位遷移并釋放大量炎癥細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用［18-19］。有報(bào)道稱(chēng)，S100A8/A9在創(chuàng)傷、感染、應(yīng)激和許多其他炎癥過(guò)程中都強(qiáng)烈上調(diào)［20］。比如缺氧應(yīng)激條件下骨髓細(xì)胞中的HIF-1轉(zhuǎn)錄活化，并通過(guò)刺激VEGF和S100A8表達(dá)促進(jìn)血管生成［21］；持續(xù)的缺氧缺血可顯著增加急性心梗患者外周血中的S100A8/A9表達(dá)水平，從而加速炎癥反應(yīng)進(jìn)程和細(xì)胞外基質(zhì)降解更易觸發(fā)心臟破裂［18］。因此，本研究結(jié)果提示，高原地區(qū)持續(xù)的低氧刺激誘發(fā)體內(nèi)S100A8、S100A9因子過(guò)表達(dá)可能會(huì)進(jìn)一步觸發(fā)體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。HSPB1又稱(chēng)HSP27，是熱休克蛋白家族中的一種多功能蛋白質(zhì)。多項(xiàng)研究表明，HSP27可以通過(guò)不同的方式發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。比如，ZHANG等［22］與TIAN等［23］發(fā)現(xiàn)HSP27可以降低氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)活性氧和基質(zhì)金屬蛋白酶的生成，從而抑制細(xì)胞色素c或其他促凋亡因子的釋放，發(fā)揮抗凋亡作用；TATSUKI等［24］發(fā)現(xiàn)在大鼠急性腎損傷中，HSP27的表達(dá)上調(diào)增加自噬通量，抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。此外，也有報(bào)道顯示，HSP27具有調(diào)節(jié)谷胱甘肽水平、穩(wěn)定細(xì)胞骨架和抗氧化損傷等生物功能［25］。機(jī)體細(xì)胞的自噬、凋亡及抗氧化作用是維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要保障，本研究中，高原低氧實(shí)驗(yàn)組基因HSP27的表達(dá)顯著低于平原常氧對(duì)照組，提示長(zhǎng)期的低氧暴露可能導(dǎo)致機(jī)體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)發(fā)生紊亂。

通過(guò)對(duì)DEGs集進(jìn)行GO注釋分析發(fā)現(xiàn)，三大功能分類(lèi)中占比最高的GO條目均與免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，這提示高原低氧脅迫導(dǎo)致機(jī)體的免疫系統(tǒng)發(fā)生重要變化。隨后對(duì)免疫相關(guān)基因集進(jìn)行了KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)包括細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、JAK-STAT信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路等多個(gè)通路發(fā)生了顯著變化。JAK-STAT信號(hào)通路是多數(shù)細(xì)胞因子發(fā)揮效應(yīng)功能的重要通路。據(jù)報(bào)道，JAK-STAT信號(hào)通路參與機(jī)體造血、免疫平衡、炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡等生物事件的發(fā)生［26-27］。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)對(duì)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（LMVEC）進(jìn)行低氧處理，LMVEC上清中IL-6的分泌、JAK激酶與STAT的磷酸化均顯著增強(qiáng)，提示低氧激活了LMVEC中IL-6介導(dǎo)的JAK/STAT炎癥通路，參與肺內(nèi)皮損傷［28］。高原低氧組小鼠脾臟JAK-STAT信號(hào)通路中IL-7與IL-7R基因顯著上調(diào)。IL-7主要通過(guò)其受體IL-7R發(fā)揮作用，二者的有效結(jié)合是T、B淋巴細(xì)胞正常發(fā)育過(guò)程中必不可少的環(huán)節(jié)。然而， IL-7/IL-7R信號(hào)軸的過(guò)度激活會(huì)導(dǎo)致免疫平衡的失調(diào)。比如，研究發(fā)現(xiàn)炎癥性腸病患者的結(jié)腸黏膜中，IL-7和IL-7R表達(dá)顯著增高［29］；IL-7過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠腸道模型中，腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和固有層淋巴細(xì)胞表型和功能受到顯著影響［30］。結(jié)合以上研究結(jié)果推測(cè)，高原低氧暴露下IL-7及IL-7R表達(dá)顯著增強(qiáng)可能致使機(jī)體免疫調(diào)節(jié)失衡。

為了進(jìn)一步對(duì)基因表達(dá)量的整體變化趨勢(shì)做出解釋?zhuān)狙芯窟M(jìn)行了基因集富集分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)上調(diào)的DEGs顯著富集于NOD樣受體信號(hào)通路，這與KEGG通路富集結(jié)果一致，強(qiáng)調(diào)了NOD樣受體信號(hào)通路的生物學(xué)功能。NOD樣受體蛋白家族是 一組模式識(shí)別受體（PRR），可以介導(dǎo)損傷與應(yīng)激等先天免疫反應(yīng)。當(dāng)機(jī)體內(nèi)環(huán)境受到外部刺激發(fā)生改變時(shí)，病原體相關(guān)分子模式或損失相關(guān)分子模式激活NOD樣受體進(jìn)而啟動(dòng)下游信號(hào)通路，使基因表達(dá)發(fā)生深刻變化，最終導(dǎo)致廣泛的宿主防御和炎癥因子的產(chǎn)生（如IL-1β、TNF和IL-6等）。例如，研究報(bào)道，NOD樣受體信號(hào)通路在高原低氧暴露期間介導(dǎo)炎癥性肺損傷［11］；慢性間歇性缺氧誘發(fā)的內(nèi)皮損傷與NOD樣受體信號(hào)通路有關(guān)［31］。NLRP1B是炎癥體NLRP1家族成員。與NLRP1B功能相關(guān)的多數(shù)研究都集中在炎癥調(diào)節(jié)方面，炎癥體信號(hào)的失調(diào)可能導(dǎo)致高度炎癥狀態(tài)，最終導(dǎo)致自體炎癥障礙、神經(jīng)退行性疾病和癌癥進(jìn)展［32-35］。本研究中高原低氧處理?xiàng)l件下NLRP1B的表達(dá)高度上調(diào)提示低氧處理可能激活了NOD樣受體信號(hào)通路的炎癥體信號(hào)，進(jìn)而導(dǎo)致促炎反應(yīng)的發(fā)生。

本研究通過(guò)對(duì)高低海拔暴露下小鼠的脾臟組織進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄測(cè)序分析，檢測(cè)到大量參與低氧脅迫適應(yīng)的DEGs，且GO注釋分析顯示這些DEGs大多集中在免疫相關(guān)的功能模塊。KEGG通路富集結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多個(gè)免疫炎癥相關(guān)的信號(hào)通路顯著富集。本研究結(jié)果結(jié)合上述研究報(bào)道表明，免疫調(diào)節(jié)參與機(jī)體對(duì)高原低氧脅迫的適應(yīng)機(jī)制；同時(shí)，高原低氧暴露環(huán)境下，免疫系統(tǒng)響應(yīng)低氧脅迫的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子（如IL-7、IL-7R及NLRP1B）可能致使機(jī)體內(nèi)部免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)失衡，這與JAK-STAT及NOD樣受體信號(hào)通路有關(guān)?？傊?，本研究豐富了高原醫(yī)學(xué)在醫(yī)學(xué)免疫學(xué)領(lǐng)域的研究?jī)?nèi)容，為深入探討機(jī)體免疫系統(tǒng)響應(yīng)高原低氧脅迫的分子調(diào)控機(jī)制提供了線索，也為相關(guān)高原病的病因?qū)W研究提供了新的理論依據(jù)和研究方向。