真核翻譯起始因子4γ2調(diào)控N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶1 mRNA對胃癌細(xì)胞惡性表型的影響

李海洋, 張 淼, 陸 峰, 戴素華, 李芳芳, 魚紅亮, 后 博, 張 偉, 張明雷, 尹曉東

(江蘇省濱?？h人民醫(yī)院, 1. 放療科, 2. 消化內(nèi)科, 3. 普外科, 4. 腫瘤科, 6. 血液科, 江蘇 鹽城, 224500; 5. 江蘇省腫瘤醫(yī)院 腫瘤科, 江蘇 南京, 210009)

胃癌起源于胃黏膜上皮細(xì)胞，是消化道常見的侵襲性惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率均很高[1]。研究[2]認(rèn)為，胃癌可能是環(huán)境、飲食、幽門螺桿菌感染、遺傳等多種因素共同作用的結(jié)果。目前，手術(shù)聯(lián)合放療、化療是胃癌的主要治療手段[3-4], 但胃癌早期發(fā)病隱匿，診斷較為困難，往往不能及時(shí)治療，導(dǎo)致患者治療效果差和預(yù)后不良[5]。因此，探究胃癌進(jìn)展相關(guān)的分子靶標(biāo)可為改善胃癌患者預(yù)后提供重要的理論依據(jù)。N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶1(GALNT1)是N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶(GALNT)家族的一員，其主要功能是參與O-糖基化合成[6]。異常的糖基化是多種人類腫瘤發(fā)生的標(biāo)志，且與細(xì)胞多種生物學(xué)行為密切相關(guān)[7]。相關(guān)研究[8]報(bào)道, GALNT1在胃腸道腫瘤中主要充當(dāng)致癌因子，可促進(jìn)結(jié)直腸癌腫瘤生成及肝轉(zhuǎn)移。然而, GALNT1是否在胃癌中異常表達(dá)并參與疾病進(jìn)展尚未明確。真核翻譯起始因子4γ2(EIF4G2)是真核翻譯起始因子4γ(EIF4G)的一種亞型，其在大鼠胃黏膜中的高表達(dá)可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞體外增殖[9]。然而, EIF4G2表達(dá)對胃癌進(jìn)展的影響及其可能的調(diào)控機(jī)制仍需深入探究。本研究探討GALNT1對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的具體影響，并分析GALNT1mRNA與EIF4G2的相互關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

永生化人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1和人胃癌細(xì)胞HGC-27(北納生物); 人胃癌細(xì)胞KE-39(上海酶研生物科技有限公司); 人胃癌細(xì)胞AGS、SNU-1、SNU-16(美國菌種保藏中心); RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基(美國思拓凡公司); 胎牛血清(FBS)(浙江天杭生物科技股份有限公司); Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑、分光光度計(jì)、PierceTM磁性RNA-蛋白Pull-Down試劑盒(美國賽默飛世爾科技公司); sh-GALNT1-1、sh-GALNT1-2、shRNA-EIF4G2-1、shRNA-EIF4G2-2重組慢病毒和陰性對照sh-NC、shRNA-NC(廣州市銳博生物科技有限公司); oe-EIF4G2和oe-NC質(zhì)粒(北京義翹神州科技股份有限公司); RNAiso Plus試劑[寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司]; ReverTraAce實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)試劑盒[東洋紡(上海)生物科技有限公司]; FastStart Universal SYBR Master Mix、CCK-8試劑(德國羅氏診斷有限公司); GoTaq?實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)(美國普洛麥格公司); RIPA裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司); 兔源GALNT1、Bcl-2、Bax、cleaved-caspase3、caspase3、caspase9、MMP2、MMP9、GPADH抗體和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)(英國Abcam公司); 兔源EIF4G2、cleaved-caspase9抗體(美國Cell Signaling Technology公司); ECL發(fā)光液(北京酷來搏科技有限公司); TUNEL染色試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司); 基質(zhì)膠和Transwell小室(美國BD公司); 鏈霉親和素磁珠、放線菌素D(美國MedChemExpress公司); Magna RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀試劑盒(美國密理博公司); Image J軟件(美國國立衛(wèi)生研究院); 熒光顯微鏡(德國歐蒙醫(yī)學(xué)診斷有限公司); 倒置顯微鏡(日本奧林巴斯)。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析: 利用CCLE數(shù)據(jù)庫(https://sites.broadinstitute.org/ccle)分析GALNT1、EIF4G2在胃癌細(xì)胞和正常細(xì)胞中的表達(dá)情況; 利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析GALNT1、EIF4G2在胃癌組織和正常組織中的表達(dá)情況，并預(yù)測GALNT1、EIF4G2在胃癌組織中的相關(guān)性。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng): 永生化人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1和人胃癌細(xì)胞AGS、KE-39常規(guī)培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中; 人胃癌細(xì)胞SNU-1、HGC-27、SNU-16均用RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行孵育。除了HGC-27細(xì)胞的培養(yǎng)基含有20%FBS以外，其余細(xì)胞的培養(yǎng)基含有10%FBS, 均置于37 ℃、5%CO2的孵育箱中。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染: 當(dāng)接種于6孔板中的細(xì)胞(5×104個(gè)/孔)融合度達(dá)到60%～70%時(shí)，嚴(yán)格按照Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑使用說明將sh-GALNT1-1、sh-GALNT1-2、sh-NC、shRNA-EIF4G2-1、shRNA-EIF4G2-2、shRNA-NC、oe-EIF4G2和oe-NC瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至各組細(xì)胞中，分別設(shè)為sh-GALNT1-1組、sh-GALNT1-2組、sh-NC組、shRNA-EIF4G2-1組、shRNA-EIF4G2-2組、shRNA-NC組、oe-EIF4G2組和oe-NC組，另取未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞設(shè)為對照組; 在AGS細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)染sh-GALNT1-1+oe-NC和sh-GALNT1-1+oe-EIF4G2, 并分別設(shè)為sh-GALNT1-1+oe-NC組和sh-GALNT1-1+oe-EIF4G2組, 48 h后轉(zhuǎn)染完成，檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4 RT-qPCR檢測GALNT1和EIF4G2表達(dá): 使用RNAiso Plus試劑從各組細(xì)胞中提取總RNA。向每10 cm2的培養(yǎng)細(xì)胞中加入1 mL RNAiso Plus后勻漿，室溫靜置5 min, 加入RNAiso Plus試劑1/5體積量的氯仿，劇烈震蕩混勻，室溫靜置5 min, 12 000 ×g 4 ℃離心15 min, 將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入與上清液等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10 min, 12 000×g 4 ℃離心10 min, 棄上清，向沉淀中加入1 mL的75%乙醇清洗沉淀，棄上清保留沉淀，干燥，并加入適量的RNase-free水溶解沉淀。隨后按照ReverTraAce RT-qPCR試劑盒說明書進(jìn)行cDNA合成。以cDNA為模板，加入FastStart Universal SYBR Master Mix在GoTaq?實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)中進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot): 使用RIPA裂解液對蛋白進(jìn)行提取，并用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度檢測。將行10%SDS-PAGE電泳的等量蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜并在5%脫脂牛奶中進(jìn)行室溫封閉，加入一抗于4 ℃下進(jìn)行孵育，并加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗于室溫下進(jìn)行孵育。加入ECL發(fā)光液對蛋白條帶進(jìn)行顯影，用Image J軟件記錄灰度值。

1.2.6 CCK-8法檢測細(xì)胞活性: 將轉(zhuǎn)染后的AGS細(xì)胞種植于96孔板中進(jìn)行培養(yǎng)(5×103個(gè)細(xì)胞/孔)，分別于24、48、72 h后，加入體積分?jǐn)?shù)為10%的CCK-8試劑。2 h后，使用分光光度計(jì)于450 nm處檢測光密度值，并繪制增殖曲線。

1.2.7 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成能力: 將轉(zhuǎn)染后的AGS細(xì)胞接種于直徑6 cm培養(yǎng)皿中，每皿1×104個(gè)細(xì)胞。2周后終止培養(yǎng)，以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后用多聚甲醛固定細(xì)胞，室溫下用0.5%結(jié)晶紫染色10 min。拍照保存并計(jì)算細(xì)胞克隆形成數(shù)目。

1.2.8 TUNEL染色法檢測細(xì)胞凋亡: 將轉(zhuǎn)染后的AGS細(xì)胞接種于96孔板中，經(jīng)4%多聚甲醛和0.5% Triton X-100進(jìn)行固定和透化處理后，添加TUNEL試劑，嚴(yán)格按照試劑盒說明書于37 ℃下反應(yīng)45 min, 隨后用DAPI對細(xì)胞核進(jìn)行染色，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.2.9 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移: 在6孔板中加入處于生長對數(shù)期的AGS細(xì)胞，細(xì)胞達(dá)到90%融合度時(shí)，使用200 μL無菌槍頭劃1條線, PBS洗滌3次后，加入無血清DMEM培養(yǎng)基。于倒置顯微鏡下測量0、48 h時(shí)的傷口寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移數(shù)。

1.2.10 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力: 將轉(zhuǎn)染后的AGS細(xì)胞接種于含有基質(zhì)膠的Transwell上室內(nèi)，向Transwell下室加入500 μL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。24 h后，用棉簽擦去上室膜表層細(xì)胞，并分別用多聚甲醛和結(jié)晶紫進(jìn)行固定和染色處理，最后使用倒置顯微鏡對侵襲細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.11 RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀: 嚴(yán)格根據(jù)制造商的說明，使用Magna RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀試劑盒進(jìn)行RIP實(shí)驗(yàn)。將羊抗兔IgG或EIF4G2抗體包被的磁珠與制備好的細(xì)胞裂解物于4 ℃下孵育過夜，然后洗滌RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物并與蛋白酶K緩沖液一起孵育，最后對RNA進(jìn)行提取并純化，利用RT-qPCR進(jìn)行富集度分析。

1.2.12 RNA下拉實(shí)驗(yàn): 嚴(yán)格根據(jù)說明書要求使用PierceTM磁性RNA-蛋白Pull-Down試劑盒進(jìn)行RNA下拉實(shí)驗(yàn)。使用生物素標(biāo)記的DNA探針與鏈霉親和素磁珠在室溫下孵育30 min, 并將細(xì)胞裂解物與鏈霉親和素磁珠于4 ℃下孵育過夜。清洗磁珠，分離與磁珠結(jié)合的蛋白質(zhì)，進(jìn)行Western blot分析。

1.2.13 RNA穩(wěn)定性檢測: 將細(xì)胞接種于6孔板(6×105個(gè)細(xì)胞/孔)中, 37 ℃孵育過夜，然后用5 μg/mL放線菌素D對細(xì)胞進(jìn)行處理(0、3、6、9、12 h)，通過RT-qPCR檢測mRNA穩(wěn)定性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 GALNT1在胃癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)并與患者不良預(yù)后相關(guān)

CCLE數(shù)據(jù)庫檢測結(jié)果顯示,GALNT1在胃癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，見圖1A; GEPIA數(shù)據(jù)庫檢測結(jié)果顯示，與正常組織比較,GALNT1在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見圖1B; GEPIA數(shù)據(jù)庫檢測結(jié)果顯示,GALNT1高表達(dá)與胃癌患者低總體生存率相關(guān)，見圖1C。RT-qPCR、Western blot檢測結(jié)果顯示，與永生化人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1比較,GALNT1mRNA、GALNT1蛋白在人胃癌細(xì)胞(HGC-27、AGS、SNU-1、SNU-16、KE-39)中的表達(dá)水平更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001), 見圖1D、圖1E。本研究選用GALNT1相對表達(dá)量最高的AGS細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

A: 基于CCLE數(shù)據(jù)庫檢測GALNT1在胃癌細(xì)胞中的表達(dá); B: 基于GEPIA數(shù)據(jù)庫檢測GALNT1在胃癌組織、正常組織中的表達(dá)(不同組織比較,*P<0.05); C: 基于GEPIA數(shù)據(jù)庫檢測GALNT1表達(dá)與胃癌患者生存率的相關(guān)性; D、E: RT-qPCR檢測GALNT1 mRNA、Western blot檢測GALNT1蛋白在永生化人胃黏膜上皮細(xì)胞系和人胃癌細(xì)胞中的表達(dá)(與GES-1比較, ***P<0.001)。圖1 GALNT1在胃癌組織和胃癌細(xì)胞中的表達(dá)及與患者不良預(yù)后的關(guān)系

2.2 干擾GALNT1對胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

為闡明GALNT1對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的具體影響，本研究將sh-GALNT1-1、sh-GALNT1-2干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至AGS細(xì)胞并檢測轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，與sh-NC組比較, sh-GALNT1-1組、sh-GALNT1-2組GALNT1mRNA、GALNT1蛋白表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001), 見圖2A、圖2B, 本研究后續(xù)選擇轉(zhuǎn)染效率較高的sh-GALNT1-1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。CCK-8法檢測結(jié)果顯示，與sh-NC組比較, sh-GALNT1-1組中細(xì)胞活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001), 見圖2C?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果表明, sh-GALNT1-1組細(xì)胞克隆形成率低于sh-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001), 見圖2D。TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與sh-NC組相較, sh-GALNT1-1組細(xì)胞凋亡率上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001), 見圖2E。凋亡相關(guān)蛋白的Western blot測定結(jié)果表明, sh-GALNT1-1組中Bcl-2蛋白表達(dá)低于sh-NC組, Bax、cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表達(dá)高于sh-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001), 2組caspase3、caspase9蛋白表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 見圖2F。

A、B: RT-qPCR、Western blot檢測GALNT1干擾質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率; C: CCK-8法檢測AGS細(xì)胞活力; D: 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測AGS細(xì)胞克隆形成能力; E: TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測AGS細(xì)胞凋亡情況; F: Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況。與sh-NC組比較, ***P<0.001。圖2 干擾GALNT1對胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.3 干擾GALNT1對胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，與sh-NC組比較, sh-GALNT1-1組劃痕相對愈合率降低，遷移細(xì)胞數(shù)目減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001), 見圖3A。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，與sh-NC組比較, sh-GALNT1-1組侵襲細(xì)胞數(shù)目減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001), 見圖3B。Western blot結(jié)果表明, sh-GALNT1-1組MMP2、MMP9蛋白表達(dá)水平低于sh-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001), 見圖3C。

A: 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測AGS細(xì)胞遷移能力; B: Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測AGS細(xì)胞侵襲能力; C: Western blot檢測轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)。與sh-NC組比較, ***P<0.001。圖3 干擾GALNT1對胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

2.4 EIF4G2在胃癌組織和胃癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)并與患者不良預(yù)后相關(guān)

CCLE數(shù)據(jù)庫檢測結(jié)果顯示,EIF4G2在胃癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，見圖4A; GEPIA數(shù)據(jù)庫檢測結(jié)果顯示，與正常組織比較,EIF4G2在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見圖4B; GEPIA數(shù)據(jù)庫檢測結(jié)果顯示,EIF4G2高表達(dá)與胃癌患者低總體生存率相關(guān)，見圖4C。GEPIA預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn),EIF4G2與GALNT1在胃癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)，見圖4D。RT-qPCR、Western blot檢測結(jié)果顯示，與GES-1細(xì)胞比較,EIF4G2mRNA、EIF4G2蛋白在AGS細(xì)胞中的表達(dá)水平更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001), 見圖4E、圖4F。

A: 基于CCLE數(shù)據(jù)庫檢測EIF4G2在胃癌細(xì)胞中的表達(dá); B: 基于GEPIA數(shù)據(jù)庫檢測EIF4G2在胃癌組織與正常組織中的表達(dá)(不同組織比較, *P<0.05); C: 基于GEPIA數(shù)據(jù)庫檢測EIF4G2表達(dá)與胃癌患者生存率的相關(guān)性; D: 基于GEPIA數(shù)據(jù)庫檢測GALNT1與EIF4G2在胃癌組織中表達(dá)的相關(guān)性; E、F: RT-qPCR檢測EIF4G2 mRNA、Western blot檢測EIF4G2蛋白在人胃黏膜上皮永生細(xì)胞系和胃癌細(xì)胞中的表達(dá)(與GES-1比較, ***P<0.001)。圖4 EIF4G2在胃癌組織和胃癌細(xì)胞中的表達(dá)及與患者不良預(yù)后的關(guān)系

2.5 EIF4G2對GALNT1 mRNA穩(wěn)定性的影響

為探究GALNT1mRNA與EIF4G2在胃癌組織中的結(jié)合關(guān)系，本研究利用RIP實(shí)驗(yàn)和RNA下拉實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，相較于IgG中,GALNT1在EIF4G2抗體中的富集度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001), 見圖5A、圖5B。為檢測EIF4G2對GALNT1mRNA的調(diào)控關(guān)系，分別轉(zhuǎn)染EIF4G2過表達(dá)和EIF4G2 shRNA干擾質(zhì)粒, RT-qPCR和Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn), oe-EIF4G2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染導(dǎo)致EIF4G2mRNA和EIF4G2蛋白表達(dá)增加, shRNA-EIF4G2-1、shRNA-EIF4G2-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染導(dǎo)致EIF4G2mRNA和EIF4G2蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.001), 見圖5C、圖5D, 后續(xù)選擇干擾效率較高的shRNA-EIF4G2-2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，與shRNA-NC組比較, shRNA-EIF4G2-2組GALNT1mRNA穩(wěn)定性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001), 見圖5E。與oe-NC組比較, oe-EIF4G2組GALNT1mRNA和GALNT1蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.001), 見圖5F、圖5G。

A、B: RIP實(shí)驗(yàn)、RNA下拉實(shí)驗(yàn)檢測EIF4G2與GALNT1 mRNA間的結(jié)合關(guān)系(兩者比較, ***P<0.001); C、D: RT-qPCR、Western blot檢測EIF4G2過表達(dá)和干擾質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率(與oe-NC組比較, ***P<0.001; 與shRNA-NC組比較, ##P<0.01, ###P<0.001); E: RT-qPCR檢測GALNT1 mRNA的穩(wěn)定性(與shRNA-NC組比較, ***P<0.001); F、G: RT-qPCR和Western blot檢測過表達(dá)EIF4G2后的GALNT1 mRNA和GALNT1蛋白表達(dá)情況(與oe-NC組比較, **P<0.01, ***P<0.001)。圖5 EIF4G2對GALNT1 mRNA穩(wěn)定性的影響

2.6 過表達(dá)EIF4G2能夠部分逆轉(zhuǎn)GALNT1敲低對胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的作用

CCK-8和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與sh-NC組比較, sh-GALNT1-1組AGS細(xì)胞增殖能力減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001); 與sh-GALNT1-1+oe-NC組比較, sh-GALNT1-1+oe-EIF4G2組AGS細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.001), 見圖6A、圖6B。TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, sh-GALNT1-1組細(xì)胞凋亡率高于sh-NC組，而sh-GALNT1-1+oe-EIF4G2組細(xì)胞凋亡率低于sh-GALNT1-1+oe-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001), 見圖6C。Western blot檢測結(jié)果顯示, sh-GALNT1-1組Bcl-2蛋白表達(dá)低于sh-NC組, Bax、cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表達(dá)高于sh-NC組，而sh-GALNT1-1+oe-EIF4G2組Bcl-2蛋白表達(dá)高于sh-GALNT1-1+oe-NC組，Bax、cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表達(dá)低于sh-GALNT1-1+oe-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001), 見圖6D。

A: CCK-8法檢測AGS細(xì)胞活力; B: 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測AGS細(xì)胞克隆形成能力; C: TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測AGS細(xì)胞凋亡率; D: Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。與sh-NC組比較, ***P<0.001; 與sh-GALNT1-1+oe-NC組比較, #P<0.05, ###P<0.001。圖6 過表達(dá)EIF4G2能夠部分逆轉(zhuǎn)GALNT1敲低對胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的作用

2.7 過表達(dá)EIF4G2能夠部分逆轉(zhuǎn)GALNT1敲低對胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的作用

與sh-NC組比較, sh-GALNT1-1組細(xì)胞遷移和侵襲能力降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001); 與sh-GALNT1-1+oe-NC組比較, sh-GALNT1-1+oe-EIF4G2組細(xì)胞遷移和侵襲能力提升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.001), 見圖7A、圖7B。sh-GALNT1-1組MMP2、MMP9蛋白表達(dá)低于sh-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001); sh-GALNT1-1+oe-EIF4G2組MMP2、MMP9蛋白表達(dá)高于sh-GALNT1-1+oe-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.001), 見圖7C。

A: 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測AGS細(xì)胞遷移能力; B: Transwell實(shí)驗(yàn)檢測AGS細(xì)胞侵襲能力; C: Western blot檢測轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)。與sh-NC組比較, ***P<0.001; 與sh-GALNT1-1+oe-NC組比較, #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001。圖7 過表達(dá)EIF4G2能夠部分逆轉(zhuǎn)GALNT1敲低對胃癌細(xì)胞侵襲和遷移的作用

3 討 論

胃癌是臨床常見的胃腸道惡性腫瘤[1], 而腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是胃癌患者生存率低、預(yù)后不良的重要因素[10]。由于胃癌缺乏明顯的癥狀和敏感的生物標(biāo)志物，大多患者確診時(shí)病程已進(jìn)入晚期，腫瘤細(xì)胞易侵入血液或淋巴管并向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[11]。研究[10]報(bào)道，胃癌的發(fā)生發(fā)展通常與癌基因的激活或腫瘤抑制因子的失活有關(guān)。因此，揭示胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制并探尋新的生物標(biāo)志物對于提高早期胃癌診斷率及治療效果具有重要意義。

蛋白糖基化修飾是常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，在多數(shù)生物過程中起著廣泛且高度特異的作用[7]。GALNT水平的改變與乳腺癌[12]、膠質(zhì)瘤[13]、胃癌[14]等癌癥有關(guān)，而GALNT家族成員GALNT6在胃癌組織中表達(dá)升高且與TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)[14]。GALNT1作為常見的癌基因，可通過調(diào)控癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等惡性表型而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[15]。本研究通過CCLE、GEPIA數(shù)據(jù)庫分析和RT-qPCR、Western blot檢測發(fā)現(xiàn), GALNT1在胃癌組織和胃癌細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)，且GALNT1高表達(dá)與胃癌患者低總體生存率密切相關(guān)。此外, GALNT1不足可導(dǎo)致胃癌細(xì)胞增殖能力降低和凋亡能力提升，并下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，上調(diào)促凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase3、cleaved-caspase9表達(dá)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GALNT1敲低后，胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著減弱，且轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP2、MMP9活性降低。由此表明, GALNT1缺失可能通過抑制細(xì)胞增殖、遷移、侵襲并促進(jìn)細(xì)胞凋亡而延緩胃癌進(jìn)展。

EIF4F作為翻譯起始復(fù)合體，可影響mRNA翻譯，參與蛋白質(zhì)合成[16]。EIF4G2是EIF4F復(fù)合物的關(guān)鍵組成成分，可參與PCBP2mRNA翻譯[17]。本研究基于CCLE、GEPIA數(shù)據(jù)庫分析和RT-qPCR、Western blot檢測發(fā)現(xiàn), EIF4G2在胃癌組織和胃癌細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào),EIF4G2高表達(dá)與胃癌患者不良預(yù)后密切相關(guān)，且胃癌組織中EIF4G2表達(dá)與GALNT1表達(dá)呈正相關(guān)。機(jī)制實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí), EIF4G2蛋白可與GALNT1mRNA結(jié)合并增強(qiáng)GALNT1mRNA穩(wěn)定性。相關(guān)研究[18]表明, EIF4G2在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。另有研究[12]發(fā)現(xiàn)，瘦素可能通過誘導(dǎo)EIF4G2在大鼠胃黏膜中表達(dá)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)EIF4G2可部分恢復(fù)GALNT1缺失所致胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力降低和細(xì)胞凋亡能力提升。

綜上所述, EIF4G2可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲并抑制細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與增強(qiáng)GALNT1mRNA穩(wěn)定性有關(guān)。本研究驗(yàn)證了EIF4G2、GALNT1在胃癌中的致癌作用，可為以EIF4G2和GALNT1為靶點(diǎn)的胃癌治療策略的發(fā)展提供參考。此外，本研究揭示了RNA結(jié)合蛋白EIF4G2與GALNT1mRNA間的調(diào)控新機(jī)制，對構(gòu)建RNA結(jié)合蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)具有重要意義。