幽門螺桿菌的耐藥機(jī)制及應(yīng)對策略

邵慧娟, 李初誼, 于曉輝, 張久聰

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué), 甘肅 蘭州, 730000; 2. 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院 消化內(nèi)科, 甘肅 蘭州, 730050)

幽門螺桿菌(Hp)是一種螺旋形、微需氧、有鞭毛的革蘭氏陰性桿菌，主要定植于胃的黏液層，部分也可附著于分泌黏液的胃上皮細(xì)胞表面。2015年《京都全球幽門螺桿菌胃炎共識報告》[1]將Hp引起的胃炎定義為一種感染性疾病，具有傳染性和致病性。機(jī)體感染Hp可引起慢性胃炎、消化性潰瘍、黏膜相關(guān)淋巴組織(MALT)淋巴瘤、胃癌等疾病[2], 根除Hp不僅可減輕患者的癥狀，最大限度地降低感染嚴(yán)重并發(fā)癥的風(fēng)險，同時降低胃癌發(fā)生率[3-4]。Maastricht V/Florence共識[5]已將Hp感染者的根除治療范圍擴(kuò)大至無癥狀感染者。目前，中國Hp的根除治療以至少2種抗生素為主，主要有克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星、阿莫西林、呋喃唑酮、四環(huán)素等，但隨著抗生素的廣泛使用, Hp對抗生素的耐藥性也易導(dǎo)致治療失敗，研究[6]發(fā)現(xiàn)主要耐藥機(jī)制為抗菌靶基因發(fā)生突變可使細(xì)菌逃避抗菌藥物的作用。本研究就Hp對抗生素耐藥的分子機(jī)制、新型檢測及治療方案進(jìn)行綜述。

1 Hp耐藥機(jī)制

目前報道Hp的感染率在全球范圍內(nèi)超過50%[7], 同時Hp對抗生素的耐藥率逐年上升，以克拉霉素、左氧氟沙星、甲硝唑最為顯著，研究[8]表明印度和中國在亞洲地區(qū)都出現(xiàn)了克拉霉素的高水平耐藥，中國對克拉霉素的耐藥率普遍較高，多在20%以上。KOCSMR é等[9]發(fā)現(xiàn)在克拉霉素初治的Hp感染者中, 5.5%的患者出現(xiàn)耐藥; 在原發(fā)性耐藥中, 98.7%起源于耐藥菌株的感染, 1.3%來自于耐藥基因的突變，并且性別差異不顯著; 在繼發(fā)性耐藥中，克拉霉素的耐藥率與患者的性別、年齡相關(guān)。由于甲硝唑可廣泛用于治療各種感染，如厭氧菌和寄生蟲感染、腹瀉、牙科和婦科疾病等，導(dǎo)致甲硝唑出現(xiàn)高耐藥率，多數(shù)地區(qū)高達(dá)40%以上[8]。中國的一項多中心研究[10]得出，2010—2016年Hp對甲硝唑、克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林和四環(huán)素的初次耐藥率分別為78.2%、22.1%、19.2%、3.4%和1.9%, 由于克拉霉素、甲硝唑和左氧氟沙星的高耐藥率，使得標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)療法的效果大大降低[11]。因此，對Hp感染者耐藥狀況進(jìn)行監(jiān)測并實施個體化治療已成為必要，但目前對中國人群Hp耐藥的大規(guī)模、多區(qū)域研究還不夠充分。

2 耐藥基因突變位點

2.1 克拉霉素

克拉霉素屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，其抑菌機(jī)制主要是與細(xì)菌核糖體50 s亞基結(jié)合，通過阻斷轉(zhuǎn)肽作用及mRNA的移位而抑制Hp蛋白質(zhì)的合成。近年來Hp對克拉霉素產(chǎn)生耐藥，且多為Hp的23SrRNA的V區(qū)發(fā)生點突變，使核糖體的構(gòu)象發(fā)生變化，進(jìn)而改變結(jié)合位點，使二者親和力減弱，不能很好地抑制Hp蛋白質(zhì)的合成，導(dǎo)致根除治療失敗。

研究[12]進(jìn)一步證實Hp對克拉霉素耐藥最常見的點突變是23SrRNA基因V區(qū)的A2142G和A2143G。在一項回顧性研究[13]中發(fā)現(xiàn)A2142G點突變率為37.7%, 其中A2143G單突變最常見，其次是A2142G和雙點突變，并指出在A2142G突變組中三聯(lián)與四聯(lián)療法的有效率無顯著差異，但在A2143G或A2142G和A2143G同時突變時，三聯(lián)和四聯(lián)療法的根治率分別為25.8%和92.1%(P<0.001), 可見針對A2143G突變者，四聯(lián)療法顯著優(yōu)于三聯(lián)療法[14]。PARK C G等[15]對295例Hp感染者菌株的23SrRNA行DNA測序分析，發(fā)現(xiàn)A2143G是最常見的點突變(24.7%), 其次是A2182T突變(11.5%), 攜帶A2143G者克拉霉素三聯(lián)療法根除失敗率高達(dá)60%, 表明A2143G是Hp根除失敗的高危突變基因，并且A2143G的存在與既往根除病史和性別有關(guān)，因此提出基于23SrRNA基因的個體化治療可提高根除成功率。

2.2 甲硝唑

甲硝唑?qū)儆谙趸溥蝾愃幬?，研究[16-17]表明Hp對甲硝唑產(chǎn)生耐藥性主要與RdxA和FrxA基因失活有關(guān)，其中RdxA基因編碼對氧不敏感的NADPH硝基還原酶,FrxA基因編碼黃素氧化還原酶。LEE S M等[18]研究發(fā)現(xiàn), RdxA的無義突變降低了Hp的根除效果(P=0.009), 并且與RdxA(+)FrxA(+)相比，在二者基因均不表達(dá)的耐藥菌株中, hefA表達(dá)顯著升高 (P<0.001), 這表明hefA可能參與甲硝唑的耐藥。有研究[19]發(fā)現(xiàn)RpsU基因參與Hp菌體蛋白質(zhì)合成的同時也與甲硝唑耐藥相關(guān)。

此外，在甲硝唑耐藥和敏感的菌株中均發(fā)現(xiàn)大量RdxA的錯義突變，且FrxA突變僅在RdxA突變存在時增強(qiáng)Hp的耐藥性[20]。值得注意的是，除了無義突變和移碼突變外, RdxA中的氨基酸替換包括R16H、Y46H、P51L和A67V, 已被報道為可能導(dǎo)致甲硝唑耐藥的原因[21], 這表明很難通過檢測基因突變位點來識別甲硝唑的耐藥性，限制了PCR在檢測甲硝唑耐藥方面的應(yīng)用。因此, Hp對甲硝唑耐藥可能還存在其他未知的突變位點[22], 對其耐藥基因還需進(jìn)一步深入研究。

2.3 左氧氟沙星

左氧氟沙星是一種廣譜抗生素，屬于第3代喹諾酮類藥物，主要通過抑制細(xì)菌DNA回旋酶的活性來抗Hp, 阻斷細(xì)菌DNA的合成和復(fù)制，從而產(chǎn)生殺菌作用。DNA回旋酶由2個亞基組成，即gyrA和gyrB, 且分別由gyrA基因和gyrB基因編碼。研究[23]報道gyrA發(fā)生點突變導(dǎo)致gyrA空間構(gòu)象改變，使左氧氟沙星不能結(jié)合gyrA, 阻斷了抑制Hp基因組的復(fù)制而導(dǎo)致耐藥。目前已確定gyrA基因喹諾酮耐藥決定區(qū)(QRDR)的Asn87和Asp91點突變與左氧氟沙星產(chǎn)生耐藥相關(guān)[24-26]。另外，還有g(shù)yrA的其他突變位點包括Ala88、Ala97和Met191, 以及gyrB的Phe438、Glu463、Asp481和Arg484突變[27]。YE L P等[28]發(fā)現(xiàn)gyrA的Asn87較Asp91突變對左氧氟沙星可產(chǎn)生更強(qiáng)的耐藥性，二者同時突變進(jìn)一步增強(qiáng)耐藥性，而gyrB中Asp481和Arg484同時突變則不會明顯增強(qiáng)耐藥性。

2.4 阿莫西林

阿莫西林通過與青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)結(jié)合來抑制Hp細(xì)胞壁的合成，從而抑制細(xì)菌的生長[29]。近年來隨著阿莫西林用量的逐漸增加，根除治療失敗后全球Hp菌株對阿莫西林耐藥性有所增加[30]。研究[31]報道導(dǎo)致阿莫西林對Hp產(chǎn)生低到中等耐藥性的主要機(jī)制是PBP1基因的點突變。KUO C J等[32]研究發(fā)現(xiàn)PBP-1A的C末端區(qū)域存在多個突變。研究[33]表明多數(shù)胃黏膜標(biāo)本在-80 ℃超低溫保存3個月后可檢測出Hp對阿莫西林的耐藥率有所下降，而超低溫保存后PBP1和HEFC基因均未發(fā)現(xiàn)突變，可能與編碼膜結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)運功能的相關(guān)基因下調(diào)有關(guān)。值得注意的是, rfaF保守序列的突變率很高，可通過降低細(xì)胞膜對藥物的通透性，從而使Hp對抗生素產(chǎn)生耐藥, rfaF突變可導(dǎo)致Hp對阿莫西林、四環(huán)素和克拉霉素耐藥，其中以K331R突變最常見(占突變總數(shù)的44.44%)[34]。

2.5 多重耐藥

Hp的多重耐藥問題日益嚴(yán)重，其中亞洲國家的多重耐藥率普遍高于西方國家[35]。研究[36]發(fā)現(xiàn)HP0939、HP0497和HP0471轉(zhuǎn)運蛋白在多重耐藥菌株中高表達(dá)，導(dǎo)致Hp對抗生素的外排能力增強(qiáng)，同時抑制生物膜的形成，當(dāng)這3種轉(zhuǎn)運蛋白基因敲除時，會增加Hp對多種抗生素的敏感性，說明他們與多重耐藥密切相關(guān)。胃黏膜表面形成生物膜是Hp難以根除的重要原因, ZHAO Y C等[37]研究表明中性粒細(xì)胞激活蛋白(NAPA、HP0243)促進(jìn)過氧化氫誘導(dǎo)的生物被膜形成，進(jìn)而參與Hp的多重耐藥。Hp菌株生物被膜的形成降低了其對阿莫西林和甲硝唑的敏感性[38]。因此，針對Hp生物被膜最低抑菌濃度的研究對開發(fā)根除方案具有重要意義。

此外，藥物外排泵的過度表達(dá)也是Hp多重耐藥的原因。外排泵是一種存在于Hp細(xì)胞膜上的多藥轉(zhuǎn)運蛋白，該泵將抗菌藥物輸送出細(xì)胞，降低了細(xì)胞內(nèi)抗菌藥物的濃度，從而增加了耐藥性[39]。值得注意的是，研究[40]表明外排泵基因Hp605、Hp971、Hp1327、Hp1489、Hp118和Hp1174的表達(dá)在可形成生物膜的Hp中顯著高于浮游細(xì)菌，這意味著外排泵和生物膜協(xié)同作用增加Hp的耐藥性。

3 耐藥基因突變位點的檢測

通過檢測Hp耐藥基因突變位點可替代耗時的藥敏試驗。一項利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-高分辨熔解曲線(HRM-PCR)對甘肅地區(qū)Hp克拉霉素耐藥表型的檢測發(fā)現(xiàn)，其與傳統(tǒng)E-Test藥敏方法一致性高達(dá)96.23%, 或可代替E-Test成為一種便捷、快速的新方法，從而指導(dǎo)臨床用藥。黃聲雷等[41]對上海80例胃黏膜組織標(biāo)本使用HRM-PCR檢測得出的Hp陽性率為86.2%, 克拉霉素的突變位點主要為23SrRNA第2142或2143位，突變率34.8%, DNA測序法得出Hp陽性率為80.0%, 突變位點主要為A2143G, 兩種方法檢測Hp耐藥基因突變的陽性符合率、陰性符合率和總符合率分別為87.0%、95.1%和92.2%, Kappa系數(shù)為0.829, 進(jìn)一步證明兩者一致性較好。

環(huán)介導(dǎo)的等溫擴(kuò)增法(LAMP)靈敏度高、反應(yīng)時間短，與快速尿素酶法(RUT)在檢測Hp方面一致性較高(Kappa值為0.923,P<0.001), 并且LAMP檢測A2182C點突變與DNA測序符合率達(dá)97.7%(42/43)[42]。ZHAO Y等[43]研究發(fā)現(xiàn)操作簡便的TaqMan-MGB探針多重實時PCR法在診斷Hp感染的同時可檢測左氧氟沙星和克拉霉素的16SrDNA、23SrDNA、gyrA基因的部分序列和突變位點，結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)Sanger測序的Kappa值均超過90%, 表明該法更適合缺乏技術(shù)人員的基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)。此外，基因芯片法診斷Hp感染的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性分別為96.1%、85.0%和93.6%, 同時檢測克拉霉素、左氧氟沙星以及阿莫西林耐藥基因突變位點與DNA測序的一致率均在95%以上[44]。這些新型的、操作簡單的檢測方法有助于臨床醫(yī)生為患者提供個體化的治療，將為耐藥Hp的檢測提供新的視角，有利于避免抗生素濫用，進(jìn)而抗擊Hp的全球流行。

4 Hp新型治療方案

Hp的根除治療方案主要由抗生素和質(zhì)子泵抑制劑組成，抗生素在根除病原體方面起主要作用，而PPI則抑制胃酸分泌，從而增強(qiáng)抗生素的效果。三聯(lián)療法由PPI聯(lián)合甲硝唑和阿莫西林或克拉霉素組成，由于Hp對克拉霉素的耐藥率增加，導(dǎo)致該方案療效下降，含鉍劑四聯(lián)療法已被證實是根除Hp的有效方案，特別是在抗生素耐藥的菌株中，大劑量質(zhì)子泵抑制劑與阿莫西林聯(lián)合治療可減少抗生素的使用。目前隨著抗生素耐藥率的不斷上升，尋找具有抗Hp活性的新型藥物可作為其輔助治療。

標(biāo)準(zhǔn)抗生素聯(lián)合益生菌在治療Hp感染中起重要作用, KEIKHA M等[45]研究表明，益生菌除了可以減輕胃腸道癥狀外，還可以通過改變腸道微生物群來減少抗生素的副作用(尤其是腹瀉)，干酪乳桿菌、瑞氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和布氏酵母菌均能有效抑制Hp感染。乳酸桿菌作為三聯(lián)療法的補(bǔ)充，可提高其療效，減少成人和兒童與療法相關(guān)腹瀉的發(fā)生率[46], 路氏乳桿菌作為單一治療可抑制Hp的生長，作為抗生素的佐劑，在提高治愈率的同時減輕胃腸道癥狀[47], 根除Hp可能導(dǎo)致腸道微生物群的多重轉(zhuǎn)移和改變。然而，補(bǔ)充枯草芽孢桿菌和屎腸球菌則可以保護(hù)和恢復(fù)腸道微生物群[48]。

一項在體外觀察溫度對Hp和甲硝唑的研究[49]發(fā)現(xiàn)，在41 ℃時, Hp的生長開始受到抑制，并且隨著培養(yǎng)時間延長，抑制作用更加顯著，同時降低了Hp對甲硝唑的耐藥性，其中氧化還原途徑可能是溫度誘導(dǎo)甲硝唑耐藥性變化的潛在驅(qū)動因素，同時測序證實了關(guān)鍵的耐藥基因RdxA、FrxA和FdxB不會隨著溫度的升高而發(fā)生突變。研究[50-52]表明哺乳動物的胃黏膜可以耐受高達(dá)46 ℃的溫度，局部溫度的升高有助于在體內(nèi)根除Hp, 以此來輔助抗生素的治療。因此，可使用納米材料進(jìn)行局部光熱/磁熱治療。研究[53]報道了一種口服發(fā)熱納米探針可以在紅外激光照射下靶向殺死動物胃黏膜中的Hp菌株。

磷霉素是一種廣譜抗生素，可抑制Hp細(xì)胞壁的合成，對多重耐藥的致病菌株有抗菌活性，磷霉素與克拉霉素、阿莫西林，特別是與甲硝唑聯(lián)合作用于多重耐藥的Hp菌株，可明顯提高抗菌作用[54]。值得注意的是，將罌粟科植物提取物與抗生素相結(jié)合，吸附到有機(jī)體細(xì)菌纖維素載體上，觀察到Hp的生物膜水平顯著下降，表明該化合物可抑制其生物膜的生長[55]。研究[56]發(fā)現(xiàn)芳香鏈霉菌甲醇提取物可作用于Hp耐藥菌株的細(xì)胞毒素相關(guān)基因，并顯著抑制Hp生長，這為根除Hp的治療提供了一種新的方案。

5 小 結(jié)

綜上所述, Hp具有傳染性和致病性, Hp根除治療失敗主要因抗生素耐藥導(dǎo)致，其機(jī)制包括抗生素耐藥基因突變、藥物外排泵及生物膜的作用，具體的機(jī)制尚不明確。目前治療方案主要以三聯(lián)/四聯(lián)方案為主，益生菌、中藥成分等可作為輔助治療。由于Hp耐藥率的逐年上升，基于藥敏試驗及新型檢測手段來進(jìn)一步明確Hp耐藥的分子機(jī)制十分重要，有助于臨床醫(yī)生為Hp感染者制訂個體化的診療方案。