假性蛋白激酶3及微小RNA-1827在結(jié)直腸癌中的表達及意義

盧 平, 周大剛, 張萬飛, 黃宇珮, 胡 婕

(1. 成都市郫都區(qū)中醫(yī)醫(yī)院/成都中醫(yī)藥大學附屬第三醫(yī)院 病理科, 四川 成都, 611730; 2. 成都醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院·成都核工業(yè)四一六醫(yī)院 病理科, 四川 成都, 611730)

結(jié)直腸癌是最常見的消化道腫瘤之一，其發(fā)病率及致死率逐年增高[1]。研究[2]表明，結(jié)直腸腺瘤性息肉是結(jié)直腸癌的癌前病變。早期發(fā)現(xiàn)、早期阻斷腺瘤的惡性病變，對降低結(jié)直腸癌的發(fā)病率有重要意義。假性蛋白激酶3(Trib3)廣泛參與癌癥、代謝性疾病、心血管疾病等疾病的發(fā)生發(fā)展過程[3]。SNEZHKINA A V等[4]研究結(jié)果顯示, Trib3在結(jié)直腸癌中表達上調(diào)。本研究課題組前期通過生物信息學預(yù)測網(wǎng)站(http://www.mirbase.org/index.shtml)發(fā)現(xiàn)微小RNA-1827(miR-1827)與Trib3存在靶向結(jié)合位點，推測Trib3、miR-1827可能通過相互作用影響結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。然而，目前仍缺乏Trib3、miR-1827與結(jié)腸息肉的進一步相關(guān)性研究。本研究通過檢測正常結(jié)直腸組織、結(jié)直腸息肉組織及結(jié)直腸癌組織中Trib3、miR-1827表達水平的變化，探討Trib3、miR-1827在癌變過程中的意義，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2019年12月—2021年3月住院的97例結(jié)直腸癌患者癌組織作為結(jié)直腸癌組，年齡40～71歲，平均(50.08±9.33)歲，男53例，女44例。選取同期86例結(jié)直腸息肉患者息肉組織作為息肉組，年齡41～75歲，平均(50.13±10.02)歲，男46例，女40例。選取同期行結(jié)直腸鏡檢查的92例健康體檢者正常結(jié)直腸黏膜組織作為對照組，年齡41～74歲，平均(50.26±10.31)歲，男49例，女43例。收集并整理所有受試者臨床資料，包括性別、年齡，結(jié)直腸息肉患者黏膜狀態(tài)、分葉、蒂形態(tài)、息肉直徑、組織病理學分型、息肉數(shù)目，以及結(jié)直腸癌患者大體類型、浸潤程度、腫瘤直徑、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度。

納入標準: ① 結(jié)直腸癌及結(jié)直腸息肉經(jīng)病理確診者，符合診療規(guī)范[5-6]; ② 受試者臨床資料及組織標本保存完整; ③ 入組前未進行過放化療、細胞分子靶向治療等治療者; ④ 經(jīng)本院臨床研究倫理委員會批準，符合倫理學標準，所有受試者均為自愿參加。排除標準: ① 有炎癥性腸病、家族性息肉病者; ② 有嚴重心、肝、腎等臟器病變者; ③ 孕期、哺乳期婦女; ④ 有其他惡性腫瘤或惡性腫瘤史者。

1.2 研究方法

1.2.1 樣品采集及保存: 采集健康體檢者結(jié)腸鏡檢查時的正常結(jié)直腸黏膜組織以及結(jié)直腸息肉患者、結(jié)直腸癌患者手術(shù)時切除的息肉組織、癌組織，液氮中速凍，保存待測。

1.2.2 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測各組織miR-1827表達水平: 采用試劑盒(RNA提取試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自海基生物科技有限公司)提取組織總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA, 采用7700型qRT-PCR儀(美國Applied Biosystems公司)擴增miR-1827及其內(nèi)參U6。反應(yīng)體系為: cDNA模板(50 ng/μL)1 μL, 上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL, SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)5 μL, Rox reference dye(50×)(南京北魚生物科技有限公司)0.2 μL, ddH2O 3.0 μL, 重復(fù)3次。采用2-△△CT法計算正常結(jié)直腸黏膜組織、結(jié)直腸息肉組織、結(jié)直腸癌組織中miR-1827的相對表達量。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3 免疫組織化學法檢測各組織Trib3表達水平: 將采集的組織進行10%中性多聚甲醛固定、切片等一系列操作。采用免疫組織化學法(試劑盒購自德國羅氏公司)檢測組織Trib3表達水平，操作步驟參考試劑盒說明。染色結(jié)束后每張切片選取癌細胞多的5個視野，每個視野計數(shù)100個細胞，判定Trib3陽性表達率。按照染色強度評分: 無著色為0分，棕黃色為1分，棕褐色為2分。按照陽性細胞百分率評分: 無陽性細胞為0分，陽性細胞數(shù)<25%為1分，陽性細胞數(shù)為25%～50%為2分，陽性細胞數(shù)>50%為3分。總分為兩項評分相乘，總分≤2分為Trib3低表達，總分>2分為Trib3高表達。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 對照組、息肉組和結(jié)直腸癌組Trib3、miR-1827表達水平比較

結(jié)直腸癌組Trib3高表達比率高于息肉組和對照組, miR-1827水平低于息肉組和對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01); 息肉組Trib3高表達比率高于對照組, miR-1827水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表2、圖1。

表2 對照組、息肉組和結(jié)直腸癌組Trib3、miR-1827表達水平比較

A: 正常結(jié)直腸黏膜組織; B: 結(jié)直腸息肉組織; C: 結(jié)直腸癌組織。圖1 不同組織中Trib3陽性表達(免疫組化法,放大400倍)

2.2 Trib3、miR-1827表達水平與結(jié)直腸息肉患者臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)結(jié)直腸息肉患者息肉組織Trib3高表達情況及miR-1827表達水平均值(0.69), 將患者分為Trib3高表達組41例和Trib3低表達組45例, miR-1827高表達組43例和miR-1827低表達組43例。結(jié)果顯示，Trib3、miR-1827表達水平與結(jié)直腸息肉患者性別、年齡、黏膜狀態(tài)、分葉、蒂形態(tài)無相關(guān)性(P>0.05), 與息肉直徑、組織病理學分型、息肉數(shù)目有相關(guān)性(P<0.01)。見表3。

表3 Trib3、miR-1827表達水平與結(jié)直腸息肉患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 Trib3、miR-1827表達水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)結(jié)直腸癌患者癌組織Trib3高表達情況及miR-1827表達水平均值(0.39), 將患者分為Trib3高表達組84例和Trib3低表達組13例, miR-1827高表達組48例和miR-1827低表達組49例。結(jié)果顯示, Trib3、miR-1827表達水平與結(jié)直腸癌患者性別、年齡、大體類型、浸潤程度無相關(guān)性(P>0.05), 與結(jié)直腸癌患者腫瘤直徑、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度有相關(guān)性(P<0.05)。見表4。

表4 Trib3、miR-1827表達水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.4 Trib3、miR-1827在結(jié)直腸息肉組織及結(jié)直腸癌組織中的相關(guān)性

經(jīng)Spearman等級相關(guān)分析顯示，Trib3、miR-1827在結(jié)直腸息肉組織及結(jié)直腸癌組織中均呈負相關(guān)(r=-0.349、-0.397,P<0.05)。見表5、表6。

表5 Trib3、miR-1827在結(jié)直腸息肉組織中的相關(guān)性

表6 Trib3、miR-1827在結(jié)直腸癌組織中的相關(guān)性

2.5 影響結(jié)直腸息肉患者和結(jié)直腸癌患者預(yù)后的多因素回歸分析

以結(jié)直腸息肉患者治療后是否無效為因變量，以Trib3、miR-1827、息肉直徑、組織病理學分型、息肉數(shù)目為自變量，進行多因素COX回歸分析，結(jié)果顯示Trib3是結(jié)直腸息肉患者治療無效的獨立危險因素(P<0.05), miR-1827是結(jié)直腸息肉患者治療無效的保護因素(P<0.05)。見表7。

表7 影響結(jié)直腸息肉患者治療效果的多因素COX回歸分析

以結(jié)直腸癌患者治療后是否死亡為因變量，以Trib3、miR-1827、腫瘤直徑、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度為自變量，進行多因素COX回歸分析，結(jié)果顯示Trib3、臨床分期是結(jié)直腸癌患者死亡的獨立危險因素(P<0.05), miR-1827是結(jié)直腸癌患者死亡的保護因素(P<0.05)。見表8。

表8 影響結(jié)直腸癌患者死亡的多因素COX回歸分析

3 討 論

結(jié)直腸癌是指直腸和結(jié)腸黏膜上皮或腺體發(fā)生的惡性腫瘤，其發(fā)病機制仍無定論，原癌基因激活、抑癌基因失活以及基因轉(zhuǎn)錄翻譯后修飾異常均可能與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)[7-9]。結(jié)直腸息肉作為一種極易惡變的消化系統(tǒng)疾病，可能與炎癥刺激、遺傳等因素有關(guān)[10]。結(jié)直腸息肉病變早期缺乏特異性體征，極易被忽視，使得部分患者就診時已出現(xiàn)微小病灶惡變[11]。因此，探索與結(jié)直腸息肉癌變相關(guān)的分子標志物對結(jié)直腸癌早期干預(yù)具有重要意義。

Trib3是假性蛋白激酶家族中的重要成員，可參與多種信號通路，與脂肪細胞分化、細胞凋亡、腫瘤血管密度等有著密切聯(lián)系[12]。研究[13]表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激、缺氧等多種應(yīng)激反應(yīng)均可促使Trib3蛋白表達上調(diào)。miRNA是一類非編碼RNA, 可通過與靶基因mRNA的3′非編碼區(qū)結(jié)合來調(diào)控蛋白翻譯過程[14]。miR-1827是一種新興的miRNA, 可通過調(diào)控c-Myc而參與肺腺癌、甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生進展[15-16]。本研究前期生物信息學分析顯示, Trib3、miR-1827間可能存在靶向關(guān)系，且相關(guān)性結(jié)果同樣顯示結(jié)直腸息肉組織及結(jié)直腸癌組織中Trib3與miR-1827均呈負相關(guān)。本研究比較了不同結(jié)直腸組織中Trib3、miR-1827的表達水平，結(jié)果顯示在正常結(jié)直腸黏膜組織、結(jié)直腸息肉組織、結(jié)直腸癌組織中, Trib3水平逐漸升高, miR-1827表達水平逐漸降低, Trib3表達趨勢與蔡曼妮等[17]研究結(jié)果一致，提示Trib3、miR-1827可能分別是結(jié)直腸息肉發(fā)生發(fā)展及癌變進程中的重要促進因子和抑制因子。

本研究推測，從正常結(jié)直腸黏膜到結(jié)直腸息肉的病理狀態(tài)下, miR-1827表達下調(diào)，并通過靶向調(diào)控Trib3使其表達水平升高, Trib3蛋白進一步通過介導(dǎo)血管生成促進結(jié)直腸息肉向結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)變進程，但具體作用機制有待結(jié)合基礎(chǔ)實驗進一步證實。此外，本研究中Trib3、miR-1827表達水平與結(jié)直腸息肉患者息肉直徑、組織病理學分型、息肉數(shù)目以及結(jié)直腸癌患者腫瘤直徑、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度有關(guān)，且分別是結(jié)直腸息肉患者和結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良的危險因素和保護因素，提示可能是由于結(jié)直腸息肉發(fā)展為結(jié)直腸癌是一個復(fù)雜、多階段的漫長進程, Trib3、miR-1827在此過程中參與息肉的發(fā)生發(fā)展，同時在癌變發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述, Trib3、miR-1827表達水平在結(jié)直腸黏膜組織癌變進程中分別呈升高和降低趨勢，且二者均與結(jié)直腸癌腫瘤直徑、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度有關(guān), Trib3、miR-1827有望作為結(jié)直腸息肉惡變的重要監(jiān)測指標及治療靶點。檢測Trib3、miR-1827表達變化可監(jiān)測結(jié)直腸息肉惡變過程，進而進行結(jié)直腸癌的早期預(yù)防。