兒童脊髓性肌萎縮癥2型患者血漿中環(huán)狀RNA的表達(dá)譜分析

胡學(xué)會(huì), 閆 紅, 吳計(jì)劃, 趙忠禮, 汪曉翠, 楊 斌

(1. 安徽省兒童醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科, 安徽 合肥, 230000; 2. 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)第一附屬醫(yī)院 臨床病理中心, 安徽 合肥, 230001)

脊髓性肌萎縮癥(SMA)是一種常染色體隱性遺傳性疾病，由5號(hào)染色體運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生存基因(SMN)突變導(dǎo)致。2018年, SMA被列入中國(guó)《第一批罕見(jiàn)病目錄》，發(fā)生率僅約1/10 000[1]。人類SMN基因有SMN1和SMN2,SMN1基因主要編碼蛋白基因,SMN2是備用基因，也是SMA的主要疾病修飾因子[2]。根據(jù)發(fā)病年齡和達(dá)到的最大運(yùn)動(dòng)里程碑, SMA分為0、1、2、3、4共5型[3]。SMA患者的肌無(wú)力、肌萎縮癥狀，主要是由于患者體內(nèi)不能編碼產(chǎn)生足夠的SMN蛋白，其缺失導(dǎo)致脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元逐漸丟失，進(jìn)而引發(fā)一系列臨床表現(xiàn)，重型可導(dǎo)致死亡。

環(huán)狀RNA(circRNA)是一類內(nèi)源性非編碼RNA分子(ncRNA), 具有高度保守、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、自然抵抗外切酶的降解和組織特異性等優(yōu)點(diǎn)，有成為生物標(biāo)志物的巨大潛力[4-6]。多項(xiàng)研究[7-11]表明circRNA參與了神經(jīng)退行性疾病并扮演了重要的角色，例如顳葉癲癇、阿爾茲海默癥、帕金森病、多發(fā)性硬化癥以及肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥。本研究通過(guò)芯片技術(shù)篩選兒童SMA2型患者和健康人群血漿中顯著差異表達(dá)的circRNA, 并分析這些circRNA可能參與的生物學(xué)過(guò)程及通路，同時(shí)構(gòu)建circRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)，從circRNA的視角探討SMA的發(fā)病機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021年9月—2022年3月安徽省兒童醫(yī)院收治的5例SMA2型患兒作為SMA組。收集患兒的性別、就診年齡、發(fā)病年齡、肌張力、骨密度以及遺傳學(xué)等臨床資料。所有患兒按照《脊髓性肌萎縮癥遺傳學(xué)診斷專家共識(shí)》[12]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷及分型。另選取同期年齡匹配的5例健康兒童作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)為: 患兒就診時(shí)年齡不超過(guò)18歲，未接受基因修飾治療; 排除合并其他系統(tǒng)性疾病者，排除SMN1基因外顯子發(fā)生純合性缺失及拷貝數(shù)異常者。本研究已通過(guò)安徽省兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批件號(hào): EYLL-2020-015), 全部受試者及其監(jiān)護(hù)人均知曉并簽訂知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

1.2.1 RNA樣品抽提和上機(jī)測(cè)序: 采集2組受試者的空腹靜脈血各5 mL置于抗凝管中, 4 ℃低溫下1 200轉(zhuǎn)/min離心10 min, 吸取上層液體分離出血漿，保存于-80 ℃冰箱中。采用Trizol法對(duì)血漿中游離RNA進(jìn)行抽提。采用NanoDrop檢測(cè)方法測(cè)定RNA濃度和純度。采用Agilent 2100 Bioanalyzer檢測(cè)RNA的完整性。樣品質(zhì)檢合格后，取1～10 ng RNA, 使用Clontech SMARTer Stranded Total RNA seq kit V2 pico input試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，所有樣品的互補(bǔ)DNA文庫(kù)均采用Illumina HiSeq 2000測(cè)序平臺(tái)(廣州吉賽生物科技股份有限公司)進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 差異circRNAs的篩選: 對(duì)獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，同時(shí)刪掉接頭序列、含N較多的序列及低質(zhì)量的reads, 獲得高質(zhì)量數(shù)據(jù)(clean reads); 將clean reads與參考基因組進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果用于下一步 circRNA的鑒定。采用 DCC軟件綜合鑒定circRNA, 得到高可信circRNA。應(yīng)用edgeR工具進(jìn)一步對(duì)鑒定到的circRNA進(jìn)行序列預(yù)測(cè)、表達(dá)值計(jì)算和表達(dá)差異分析。顯著差異表達(dá)的circRNA進(jìn)行熱圖(Heatmap)和聚類分析(差異倍數(shù)≥1.5, 統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性P<0.05), 用于后續(xù)功能的挖掘。

1.2.3 競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(ceRNA)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建: circRNA可作為ceRNA來(lái)保護(hù)mRNA免受微小RNA(miRNA)的降解，進(jìn)而調(diào)控mRNA的表達(dá)豐度。利用TargetScan和miRanda軟件預(yù)測(cè)circRNAs可能結(jié)合的miRNA, 以及所有對(duì)應(yīng)物種的miRNA與差異表達(dá) circRNA 的關(guān)系，判斷兩者關(guān)系的主要依據(jù)包括序列匹配、circRNA-miRNA雙鏈結(jié)合熱穩(wěn)定性等。根據(jù) miRanda比對(duì)得分>140, 自由能<-15構(gòu)建circRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)關(guān)系調(diào)控圖。

1.2.4 功能富集分析: 使用R軟件clusterProfiler對(duì)差異表達(dá)的circRNA分別進(jìn)行基因本體論(GO)功能分析、京都基因和基因組百科全書(shū)(KEGG)通路富集以及Reactome通路富集分析，以查看可能參與的生物學(xué)過(guò)程和通路。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

為了獲得表達(dá)更準(zhǔn)確的差異表達(dá)circRNA轉(zhuǎn)錄本，對(duì)circRNA進(jìn)行了M-值的加權(quán)截尾均值(TMM)標(biāo)準(zhǔn)化并過(guò)濾表達(dá)過(guò)低的circRNA(基因表達(dá)譜CPM值>0.1), 隨后根據(jù)分組信息采用edgeR對(duì)circRNA進(jìn)行了差異表達(dá)分析(差異倍數(shù)≥1.5,P<0.05, FDR<1)。差異表達(dá)基因集合是否顯著富集到GO/KEGG/Reactome term, 不僅僅要看P值，還需要關(guān)注overlap Gene Count, 如果其太小(<3), 即使P值很顯著，也沒(méi)有太大的生物學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床資料

結(jié)合發(fā)病年齡和運(yùn)動(dòng)里程碑, SMA組5例均為SMA2型，其中男2例，中位年齡3歲，女3例，中位年齡10歲。見(jiàn)表1。對(duì)照組性別及年齡均按1∶1匹配入組。

表1 SMA組5例SMA患兒臨床資料

2.2 SMA患者血漿中差異circRNA表達(dá)譜

層次聚類分析顯示了SMA組與對(duì)照組circRNA的差異表達(dá)譜。相對(duì)表達(dá)較高的circRNA用紅色表示，表達(dá)較低的用藍(lán)色表示，見(jiàn)圖1, 熱圖展示將SMA患者與健康對(duì)照組區(qū)分開(kāi)來(lái)。以差異倍數(shù)絕對(duì)值≥1.5、統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，相較于對(duì)照組, SMA組中共鑒定出136個(gè)顯著差異表達(dá)的circRNA, 其中55個(gè)circRNA表達(dá)上調(diào), 81個(gè)circRNA表達(dá)下調(diào)，見(jiàn)圖2。根據(jù)變化差異倍數(shù)和P值，分別選取上升和下降排名前10位的circRNAs, 見(jiàn)表2。

圖1 SMA組與對(duì)照組差異表達(dá)的circRNA熱圖(S為SMA組, N為對(duì)照組)

圖2 SMA組與對(duì)照組差異表達(dá)的circRNA火山圖

表2 SMA組與正常對(duì)照組差異表達(dá)的circRNA

2.3 circRNA-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

使用TargetScan和miRanda數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)差異表達(dá)circRNA的靶向miRNA, circRNA序列上的miRNA結(jié)合位點(diǎn)數(shù)目越多, miRNA越有可能結(jié)合到circRNA上。根據(jù)差異倍數(shù)排序，各選取前5位的上調(diào)、下調(diào)circRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)，篩選出匹配值較高的5個(gè)miRNA進(jìn)行注釋，見(jiàn)表3。通過(guò)對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果過(guò)濾，保留總分最大的前1 000個(gè)miRNA, 應(yīng)用Cytoscape軟件繪制circRNA-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖3。

表3 差異表達(dá)的circRNA與miRNA結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)結(jié)果

紅色節(jié)點(diǎn)代表上調(diào)circRNA, 綠色節(jié)點(diǎn)代表下調(diào)circRNA, 藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表miRNA。圖3 circRNA-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 差異circRNA的生物信息學(xué)分析

根據(jù)差異表達(dá)的circRNA進(jìn)行GO功能注釋，結(jié)果顯示主要富集于去磷酸化作用、DNA復(fù)制、有絲分裂等生物過(guò)程。細(xì)胞成分的定位主要在高爾基外側(cè)網(wǎng)絡(luò)、紡錘體和細(xì)胞質(zhì)膜側(cè)等，其主要分子功能為ATP酶活性、磷酸酶、磷酸酯水解酶活性和組蛋白結(jié)合等，見(jiàn)圖4。KEGG分析發(fā)現(xiàn)，差異的circRNA可能涉及的通路包括MAPK信號(hào)通路、HIV病毒感染、VEGF信號(hào)通路、同源重組修復(fù)、DNA復(fù)制等，見(jiàn)圖5。Reactome分析結(jié)果顯示，差異的circRNA主要富集在高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的運(yùn)輸、DNA雙鏈斷裂修復(fù)、同源重組和非同源末端連接等信號(hào)通路，見(jiàn)圖6。

圖4 差異表達(dá)的circRNA的GO富集分析

圖5 KEGG通路分析條形圖

圖6 Reactome通路分析條形圖

3 討 論

SMA是最常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病之一，與兒童的死亡率有關(guān)。目前診斷SMA的金標(biāo)準(zhǔn)是基因檢測(cè)，但仍需結(jié)合典型的臨床癥狀和家族史[13]。近年來(lái)，基因療法成為第2種被批準(zhǔn)治療SMA的方法，其能夠恢復(fù)SMN2外顯子7的小分子化合物，進(jìn)一步擴(kuò)展了用于SMA治療的RNA靶向分子類別，除SMN2pre-mRNA外，內(nèi)源性RNA靶標(biāo)如miRNA和circRNA, 也可能被用于開(kāi)發(fā)額外的SMA療法[14]。

研究[15]顯示, circRNA具有獨(dú)特的閉環(huán)結(jié)構(gòu)，使其可以高度穩(wěn)定地存在于血清、血漿等細(xì)胞外壞境中，這也提高了circRNA作為miRNA海綿通過(guò)ceRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)親本基因表達(dá)的有效性[16]。目前已有多項(xiàng)研究[17-18]表明，血漿circRNA分子能夠作為診斷疾病和腫瘤的分子標(biāo)志物，不僅與治療敏感性密切相關(guān)，還可作為預(yù)后相關(guān)的重要分子標(biāo)志物，具有很強(qiáng)的臨床診斷意義[19-20]。然而，目前circRNA在兒童SMA患者中的研究仍較少。本研究首次使用來(lái)自兒童SMA2型患者和健康對(duì)照組血漿中circRNA的表達(dá)譜進(jìn)行多層綜合分析，發(fā)現(xiàn)共有136個(gè)顯著差異表達(dá)的circRNA, 其中55個(gè)在SMA組表達(dá)上調(diào), 81個(gè)表達(dá)下調(diào)，這些circRNA可以在血漿樣本中作為SMA的候選生物標(biāo)志物，同時(shí)高通量數(shù)據(jù)為SMA可能的致病作用也提供了線索。

研究[21]表明miRNA在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的發(fā)生發(fā)展、SMA發(fā)病機(jī)制方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，識(shí)別潛在的SMA相關(guān)miRNA及其相應(yīng)的伴侶RNA結(jié)合蛋白，不僅可以提供監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展的生物標(biāo)記物，還可以代表潛在的治療靶點(diǎn)。ABIUSI E等[22]發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p、miR-324-5p和miR-451a在SMA患者血清中顯著上調(diào)，并提高了SMA的表型預(yù)測(cè)價(jià)值。本研究對(duì)SMA患者血漿中差異表達(dá)的circRNA進(jìn)行了miRNA位點(diǎn)的預(yù)測(cè)，篩選出匹配值較高的5個(gè)circRNA, 并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了circRNA-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。初步分析發(fā)現(xiàn)除了上述3種miRNA均在預(yù)測(cè)范圍內(nèi)，這些差異表達(dá)的circRNA還具有與神經(jīng)元發(fā)育相關(guān)miRNAs(miR-9、miR-124 和 miR-133)、富含運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元miRNAs(miR-183和miR-218)、肌肉特異性miR-206以及星形細(xì)胞產(chǎn)生的miR-146等在SMA的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要調(diào)控作用的miRNA的結(jié)合位點(diǎn)[23-26]。因此，這些circRNA可能通過(guò)靶向吸附miRNA調(diào)控SMA的發(fā)生和發(fā)展。此外，本研究繪制的ceRNA調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)也為SMA中circRNA-miRNA級(jí)聯(lián)放大協(xié)同效應(yīng)的調(diào)控途徑提供了線索。

GO功能富集分析顯示，多數(shù)差異表達(dá)的circRNA參與了ATP酶活性以及磷酸酶活性。研究[27]表明, SMN蛋白的缺失影響了線粒體穩(wěn)態(tài)的維持以及能量代謝的調(diào)控，其中包括ATP酶活性。PTEN是一種磷酸酶和張力蛋白同源物，其缺失可激活抗凋亡因子，該通路在許多神經(jīng)退行性疾病中起著重要的保護(hù)作用[28]。因此,PTEN基因的敲除、缺失或突變通過(guò)調(diào)節(jié)其磷酸酶活性可能是促進(jìn)SMA運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活的重要治療策略。此外, KEGG及Reactome通路富集分析均顯示，候選circRNA的靶基因在同源重組修復(fù)(HR)、非同源末端連接(NHEJ)以及DNA復(fù)制途徑中富集。KANNAN A等[29]研究指出長(zhǎng)期低水平的SMN蛋白會(huì)導(dǎo)致感覺(jué)神經(jīng)毒素(SETX)缺乏，誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂(DSB)增加，以及DNA活化蛋白激酶催化亞單位(DNA-PKcs)的缺乏，從而損害DSB修復(fù)。因此, DNA損傷在SMA患者脊髓組織中積累，在細(xì)胞分裂過(guò)程中, DSB通過(guò)HR和NHEJ途徑修復(fù)[30]。另外, TAY S H等[31]利用同源重組修復(fù)機(jī)制產(chǎn)生了一個(gè)具有中等水平SMN蛋白的斑馬魚(yú)突變體，用于研究晚期SMN蛋白的缺失對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和肌肉的影響。據(jù)此推測(cè)，這些circRNA可能通過(guò)同源重組修復(fù)參與調(diào)控SMA的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)兒童SMA2型患者血漿中提取的circRNA的差異表達(dá)進(jìn)行詳細(xì)的生物信息學(xué)分析，并基于該假設(shè)構(gòu)建了circRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)，這些結(jié)果可能有助于闡明SMA的發(fā)病機(jī)制，以指導(dǎo)治療策略的制訂。鑒于SMA發(fā)病率低，臨床罕見(jiàn)，本研究納入病例量較少，后續(xù)仍需進(jìn)一步擴(kuò)充臨床樣本，考慮在其他亞型SMA患者、肌肉活檢組織或細(xì)胞水平進(jìn)行驗(yàn)證，以期為SMA的早期檢測(cè)、精確診斷以及靶向治療提供新的策略方向和更多的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。