受體酪氨酸激酶對子宮內(nèi)膜異位癥患者哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路的影響

易金玲, 吐比克孜·依比力, 古麗胡馬爾·艾尼瓦爾, 臘曉琳

(1. 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 生殖助孕中心, 新疆 烏魯木齊, 830053; 2. 新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院 婦科, 新疆 烏魯木齊, 830011)

子宮內(nèi)膜異位癥(EMS)是一種具有惡性腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移特點(diǎn)的常見婦科疾病[1], 在全球育齡期女性中的患病率為5%～10%[2]。EMS的臨床表現(xiàn)包括盆腔疼痛、痛經(jīng)和不孕癥等，近期研究[3]表明EMS是一種全身性慢性疾病，發(fā)病機(jī)制涉及多種因素，目前尚無早期診斷的標(biāo)志物，藥物治療以激素治療為主，但個(gè)體療效差異大，長期管理較為困難。研究[4]證實(shí)卵巢透明細(xì)胞癌和卵巢子宮內(nèi)膜樣癌在組織學(xué)方面與EMS密切相關(guān)。受體酪氨酸激酶(Axl)參與細(xì)胞生長、增殖、分化、黏附和遷移等過程的調(diào)節(jié)，而生長停滯特異性蛋白6(Gas6)作為Axl的配體，則具有高度結(jié)合親和力[5]。當(dāng)Axl與Gas6A結(jié)合觸發(fā)下游PI3K/AKT信號(hào)通路，則能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，因此Axl作為癌癥治療的新靶點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注[6]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是多種信號(hào)通路的樞紐，可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、細(xì)胞周期和營養(yǎng)代謝過程[7]，是PI3K/AKT信號(hào)通路的下游激酶之一[8]。研究[9]發(fā)現(xiàn)EMS患者異位內(nèi)膜Gas6表達(dá)上調(diào)，但Axl在EMS患者中的表達(dá)水平卻鮮有報(bào)道。本研究探討Axl對EMS患者mTOR信號(hào)通路的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年1月—2021年12月新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院確診卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫患者5例為研究對象，年齡35～50歲，中位年齡38.9歲，術(shù)中切除卵巢EMS病灶取得異位子宮內(nèi)膜組織，同時(shí)刮宮取得患者在位子宮內(nèi)膜組織。對照組為5例健康者，年齡23～45歲，中位年齡31.4歲，也獲得正常子宮內(nèi)膜組織。所有患者均有規(guī)律的月經(jīng)周期(27～35 d)。納入標(biāo)準(zhǔn): 明確診斷為卵巢EMS者，且術(shù)后病理學(xué)確診為EMS。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 不明原因的不孕癥者; ② 合并惡性腫瘤者; ③ 6個(gè)月內(nèi)使用類固醇激素者; ④ 合并自身免疫性疾病者; ⑤ 孕婦和哺乳期婦女; ⑥ 病理標(biāo)本采集不全者。本研究已通過新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核 (倫理審批號(hào): XYDWFYLSK-2022-17), 所有患者入組前均被明確告知其臨床信息的使用情況、標(biāo)本采集的過程、實(shí)驗(yàn)的目的及個(gè)人信息的風(fēng)險(xiǎn)保護(hù)等，并簽署知情同意書。

1.2 樣本的采集與保存

手術(shù)切除即刻收集5例異位子宮內(nèi)膜組織最典型部位組織以及在位內(nèi)膜組織，刮取5例正常子宮內(nèi)膜組織，并立即投入4 ℃滅菌盛有含青霉素、鏈霉素及兩性霉素B的Ham′s F12/DMEM培養(yǎng)液的離心管中，置于干冰壺, 2 h內(nèi)送入實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

1.3 分離和培養(yǎng)

將收集的新鮮異位子宮內(nèi)膜組織、在位子宮內(nèi)膜組織和正常子宮內(nèi)膜組織切碎，并分別在含有HEPES(25 mmol/mL)、1%青霉素/鏈霉素、膠原酶(1 g/L，酶活單位15 U/mg)和DNAse(0.1 g/L, 酶活單位1 500 U/mg)的Hank平衡鹽溶液中消化?；旌衔镌?7 ℃下?lián)u晃60 min。采用40 μm細(xì)胞過濾器過濾溶液并分離細(xì)胞，然后接種在培養(yǎng)瓶中，并置于含10%FBS和抗生素(100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素和0.25 μg/mL兩性霉素B)的Ham′s F12/DMEM培養(yǎng)基中，細(xì)胞在37 ℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟使用第3～5代培養(yǎng)細(xì)胞。

1.4 免疫組化法鑒定細(xì)胞

將細(xì)胞用4%多聚甲醛(PFA)固定在黏合玻璃載玻片中20 min, 采用0.5%Txition-100處理5 min, 然后用3%H2O2處理15 min, 再用5%正常山羊血清封閉1 min作為一級(jí)抗體; 將波形蛋白(1∶100，ab92547, Abcam)和CK19(1∶100)孵育過夜，然后將酶標(biāo)記的山羊抗小鼠/兔IgG聚合物在室溫下孵育20 min, 再次用PBS洗滌。加入新制備的DAB顯色溶液，將載玻片在室溫下孵育5 min, 然后用自來水洗滌。細(xì)胞用蘇木精染色20 s, 然后在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5 Axl-siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染及雷帕霉素干預(yù)mTOR

Axl的siRNA購自GeneChem Corporation. Si-Axl, 序列為5′-GCGGTCTGCATGAAGGAATTT-3′。使用Lipo8000TM(Beyotime Biotechnology, 上海，中國)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。雷帕霉素干預(yù)子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞濃度為1 mmol/L, 干預(yù)時(shí)間為4 h, 用DMSO溶解。

1.6 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組

選擇融合率高達(dá)90%的異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞，分為以下4組: ① 異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞組(空白對照)，細(xì)胞正常培養(yǎng)48 h; ② 異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞+雷帕霉素組，細(xì)胞正常培養(yǎng)44 h后，采用1 mmol/L雷帕霉素干預(yù)4 h; ③ 異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞+陰性對照組，細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA NC (0.1 μmol/L) 48 h; ④ 異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞+AXL-siRNA組，細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-AXL (0.1 μmol/L) 48 h。

1.7 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)進(jìn)行基因表達(dá)分析

根據(jù)制造商的說明，采用TRIzol(Thermo Fisher Scientific)從細(xì)胞中提取總RNA。使用PrimeScript RT Master Mix(日本Shija Takara Biotechnology Co. Ltd.)將提取的RNA反向轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA(cDNA)。根據(jù)制造商(Takara)的說明，使用TB Green Premix Ex Taq進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對基因表達(dá)倍數(shù)的變化。購自上海生物工程公司的引物序列見表1。

表1 PCR的引物序列

1.8 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測蛋白質(zhì)表達(dá)

使用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液分離細(xì)胞中的總蛋白。Western blot方法參考文獻(xiàn)[7]?？笰xl抗體(1∶1 000, ab219652)、抗p-mTOR抗體(1∶11 000, ab109268)、抗mTOR(1∶1 000, ab32028)和抗CyclinD1抗體(1∶100，ab16663)購自Abcam Biotechnology。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 5.0軟件和SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布時(shí)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，比較采用t檢驗(yàn)，不服從正態(tài)分布時(shí)采用中位數(shù)描述，組間分析采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定結(jié)果

顯微鏡下觀察到子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的大小不一，形態(tài)不規(guī)則，多為圓形或多邊形。培養(yǎng)24 h后，橢圓形子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞基本黏附在培養(yǎng)板壁上，有些細(xì)胞變?yōu)榧忓N形; 培養(yǎng)第7天后，細(xì)胞增殖速度加快(圖1A); 傳代3代后，細(xì)胞呈紡錘形，均勻健康; 培養(yǎng)至第5代后，細(xì)胞增殖率降低，成簇生長形狀變?yōu)榧?xì)長的紡錘形(圖1B)。選擇第3代細(xì)胞進(jìn)行免疫組化鑒定，染色結(jié)果顯示，波形蛋白在細(xì)胞漿呈深淺不一的棕褐色，表示其呈陽性(陽性率為100%); 細(xì)胞呈角蛋白(CK19)陰性，細(xì)胞質(zhì)中未觀察到棕色顆粒，顯示出間充質(zhì)細(xì)胞的特征(圖1C)。

A: 第3、7、10天的細(xì)胞形態(tài); B: P3的細(xì)胞形態(tài); C: 通過免疫組化法檢測波形蛋白(Vimentin)和角蛋白(CK19)的表達(dá)(放大40倍)。圖1 子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定

2.2 3組內(nèi)膜細(xì)胞中Axl mRNA、mTOR mRNA的表達(dá)

采用qRT-PCR進(jìn)行檢測，與正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞比較，在位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞、異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中AxlmRNA、mTORmRNA的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組內(nèi)膜細(xì)胞中Axl mRNA、mTOR mRNA表達(dá)水平比較

2.3 異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞最佳轉(zhuǎn)染條件

選擇生長狀態(tài)良好、匯合率保持90%的子宮內(nèi)膜異位間質(zhì)細(xì)胞，按照90%灰褐綠分析異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞，在充分的胰蛋白酶消化下，單細(xì)胞懸浮液可以在無抗生素情況下進(jìn)行培養(yǎng)，并接種至24孔板中, 500 μL/孔，隨后在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h, 條件為37 ℃、飽和濕度、5%CO2。配制siRNA/lipofectamin RNAiMAX復(fù)合物，混合后的復(fù)合物加入細(xì)胞培養(yǎng)板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37 ℃、飽和濕度、5%CO2), 最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間為48 h。見圖2。

圖2 轉(zhuǎn)染熒光圖片(放大100倍)

2.4 調(diào)控Axl對異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中mTOR通路及凋亡的影響

2.4.1 4組細(xì)胞中AxlmRNA、mTORmRNA、CyclinD1mRNA比較: 與異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞組比較，異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞+雷帕霉素組、異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞+Axl-siRNA組AxlmRNA、CyclinD1mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05); 與異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞+雷帕霉素組比較，異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞+Axl-siRNA組AxlmRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05); 與異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞+陰性對照組比較，異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞+雷帕霉素組AxlmRNA、CyclinD1mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05); 與異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞+陰性對照組比較，異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞+Axl-siRNA組中AxlmRNA、CyclinD1mRNA的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05); 與異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞組比較，異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞+雷帕霉素組中mTORmRNA相對表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見表3、圖3A。

表3 4組細(xì)胞中Axl mRNA、mTOR mRNA、CyclinD1 mRNA比較

A: 采用qRT-PCR檢測Axl mRNA、mTOR mRNA、CyclinD1 mRNA表達(dá); B: Western blot檢測Axl、mTOR、p-mTOR、CyclinD1的蛋白表達(dá); C: 灰度值的定量分析。圖3 調(diào)控Axl對異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中mTOR通路及凋亡的影響

2.4.2 4組細(xì)胞中Axl、mTOR、磷酸化mTOR(p-mTOR)、CyclinD1蛋白比較: 與異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞組比較，異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞+雷帕霉素組p-mTOR、CyclinD1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05); 與異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞組比較，異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞+Axl-siRNA組Axl、p-mTOR、CyclinD1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05); 與異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞+陰性對照組比較，異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞+Axl-siRNA組Axl、p-mTOR、CyclinD1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05); 4組細(xì)胞中mTOR蛋白表達(dá)無顯著差異(P>0.05)。見表4、圖3B及圖3C。

表4 4組細(xì)胞中Axl、mTOR、p-mTOR、CyclinD1蛋白比較

3 討 論

EMS是一種常見的雌激素依賴性慢性炎性疾病，約50%不孕癥及50%～80%盆腔痛患者最終會(huì)確診EMS。目前國內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為應(yīng)從全身疾病的角度出發(fā)，研究EMS的發(fā)病機(jī)制[3], 其中異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的增殖、侵襲和黏附以及新血管的形成特性與惡性腫瘤的生物學(xué)行為相似[10]。Axl是TAM家族的成員, Axl蛋白位于PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的上游，該通路被認(rèn)為是調(diào)節(jié)一系列生理活動(dòng)如細(xì)胞增殖、存活和凋亡的經(jīng)典信號(hào)通路[11]。EMS小鼠模型的體外和體內(nèi)研究[12]表明, AKT/mTOR抑制劑可減少異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖。因此，研究[13]認(rèn)為PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路可能在EMS的發(fā)生和發(fā)展中起作用。Axl是一種具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的跨膜蛋白，由Gas6編碼[14]。Axl具有黏附分子的性質(zhì)和酪氨酸激酶的活性，而酪氨酸激酶通常在正常人體組織中表達(dá)。在Gas6誘導(dǎo)下Axl二聚化后, Axl受體自身發(fā)生磷酸化，激活的Ax1受體本身具有催化下游分子的酪氨酸蛋白酶活性，從而誘導(dǎo)相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在Axl受體的作用下, PI3K被激活，其產(chǎn)物在蛋白激酶的參與下進(jìn)一步激活A(yù)KT, 從而影響下游因子的激活，其中一些下游因子參與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)[15]。AKT活化后，由于結(jié)構(gòu)域的改變, PI3K與AKT結(jié)合, AKT產(chǎn)生催化活性并轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的下一個(gè)分子。催化活性AKT從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，而后繼續(xù)靶向調(diào)節(jié)下游信號(hào)分子，如mTOR、Bad、細(xì)胞周期蛋白D1和核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)[16], 而mTOR是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、細(xì)胞周期和營養(yǎng)代謝的多種信號(hào)通路匯聚的中樞。

本研究結(jié)果表明，與正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞相比，在位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞和異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞之間的Axl和mTOR基因表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 這可能表明EMS患者的異位子宮內(nèi)膜和在位子宮內(nèi)膜具有一定相似的生物學(xué)特征，并且可能在組織學(xué)上相關(guān)，這支持了“在位內(nèi)膜決定論”理論。本研究結(jié)果還表明，在分子水平上，子宮內(nèi)膜異位間質(zhì)細(xì)胞中Axl和mTOR基因表達(dá)水平增加，這可能與該疾病的炎癥和激素依賴性特征有關(guān)。這種過度表達(dá)也可能導(dǎo)致異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞在子宮腔外持續(xù)增殖，參與子宮內(nèi)膜異位病灶的形成。本研究結(jié)果還表明，異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞組中Axl、mTOR和CyclinD1基因表達(dá)無顯著差異; 與異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞組相比，異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞+雷帕霉素組中Axl、mTOR和CyclinD1基因的表達(dá)存在顯著差異; 與異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞+雷帕霉素組相比，異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞+陰性對照組的mTOR基因表達(dá)無顯著差異; 與異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞組相比，異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞+雷帕霉素組中p-mTOR和CyclinD1基因的表達(dá)顯著不同，這也證實(shí)了mTOR是Axl信號(hào)通路下游的關(guān)鍵因子。Axl被激活后，繼續(xù)靶向調(diào)節(jié)下游信號(hào)分子mTOR, 從而最終調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及其營養(yǎng)代謝。本研究還發(fā)現(xiàn)，與異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞+雷帕霉素組相比，異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞+Axl siRNA組中Axl、p-mTOR和CyclinD1基因表達(dá)水平顯著不同，同時(shí)證實(shí)了mTOR信號(hào)的作用是通過PI3K/AKT/mTOR通路激活而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)下游蛋白的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、自噬和凋亡等生理功能[17]。這一結(jié)果也支持了PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路可能在EMS的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮作用的結(jié)論?？傊?Axl和mTOR基因在異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中高度表達(dá)，使用雷帕霉素破壞調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的mTOR可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而對異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路和其他相關(guān)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)參與EMS的發(fā)病機(jī)制。Axl通過介導(dǎo)PI3K/AKT信號(hào)通路參與了異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的活化與增殖, mTOR可能通過PI3K/AKT信號(hào)通路以外的其他機(jī)制與Axl共同參與EMS的發(fā)生。調(diào)控Axl、mTOR可促進(jìn)異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞凋亡, Axl、mTOR激酶可成為非激素靶點(diǎn)藥物的研究思路之一，需開展更深入的體內(nèi)研究驗(yàn)證。

總之, EMS的發(fā)病機(jī)制涉及許多方面，例如異常的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)、自噬、氧化應(yīng)激、新生血管和細(xì)胞凋亡。深入研究EMS發(fā)病機(jī)制涉及的完整信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，并更準(zhǔn)確地在分子水平上篩選出有研究價(jià)值的治療靶點(diǎn)，是非激素靶點(diǎn)藥物的研究思路之一。