β-胡蘿卜素生產(chǎn)、提取及功能的研究進展

任冰倩,汪鋒*,陸姝歡,馬凡提

(1.武漢工程大學 化工與制藥學院,湖北 武漢 430205;2.嘉必優(yōu)生物技術(武漢)股份有限公司,湖北 武漢 430073)

β-胡蘿卜素(C40H56)是一種類胡蘿卜素,是一種橘黃色的脂溶性化合物,廣泛存在于各種植物、藻類、真菌和細菌中,是一種的天然的色素[1-2]。β-胡蘿卜素純品的外觀呈現(xiàn)深紅紫至暗紅色,帶有輕微異臭或異味[3]。β-胡蘿卜素遇氧、熱及光不穩(wěn)定,易溶于石油醚、乙酸乙酯、氯仿、己烷及植物油等,幾乎不溶于甲醇和乙醇,也不溶于水、丙二酮、甘油、酸和堿[4-5]。β-胡蘿卜素不僅僅是良好的維生素A源,還具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、增強機體免疫能力等功能,被廣泛應用于醫(yī)藥、食品、化妝品等領域[6]。因為天然β-胡蘿卜素生理活性高,所以市場上合成的β-胡蘿卜素的價格僅為天然β-胡蘿卜素的1/3左右,并且天然β-胡蘿卜素取得了美國食品藥物管理局(FDA)的認可,已列入美國藥典[7],并在50多個國家和地區(qū)被批準使用。全球β-胡蘿卜素年生產(chǎn)量從2003年的600 t,增長至2020年的1 000 t,產(chǎn)業(yè)規(guī)模也不斷擴大[6,8]。隨著全球居民對健康越來越重視,天然β-胡蘿卜市場需求將繼續(xù)增長。隨著發(fā)展中國家對β-胡蘿卜素需求的不斷增大,以及保健品行業(yè)和健康食品產(chǎn)業(yè)的快速蓬勃發(fā)展,全球β-胡蘿卜素行業(yè)仍將繼續(xù)擴大?，F(xiàn)就β-胡蘿卜素的生產(chǎn)、提取和功能作一綜述。

1 β-胡蘿卜素的生產(chǎn)方法

1.1 化學合成法

化學合成法是通過化學反應人工合成β-胡蘿卜素的一種方法[9]。β-胡蘿卜素的產(chǎn)業(yè)規(guī)模自1953年實現(xiàn)工業(yè)化合成開始不斷發(fā)展擴大,如今主要的生產(chǎn)商有羅氏公司和巴斯夫公司[10]。C16+C8+C16,C19+C2+C19,C20+C20,C15+C10+C15是目前合成β-胡蘿卜素4種主要路線[11]。湯丹丹[12]以紫羅蘭酮為原料,對C15+C10+C15合成β-胡蘿卜素的路線進行優(yōu)化,得到純度為96%的β-胡蘿卜素固體。與天然β-胡蘿卜素相比,化學合成的β-胡蘿卜素在光照、加熱、空氣氧化條件下較穩(wěn)定。李昆明[13]改進β-胡蘿卜素的中試工藝條件,解決了殘留溶媒處及甲苯套用等一系列問題,有效減少后處理次數(shù),提高產(chǎn)品收率和純度。雖然化學合成方法已從步驟繁多、反應條件苛刻、原料危險系數(shù)高和污染大向反應簡單、易操作、反應條件溫和、原材料價廉易得和收率高等方面轉變[10],但是化學合成的β-胡蘿卜素不具備天然β-胡蘿卜素的許多生理功能[14],不能被人體完全吸收,會給人體帶來一定的毒副作用,長期服用還可能會產(chǎn)生病變[10,15]。在我國,只有C20+C20路線合成的β-胡蘿卜素,也就是從維生素A乙酸酯為原料化學合成的β-胡蘿卜素能作為食品添加劑使用,賦予食品色澤。

1.2 植物提取法

自然界中存在大量的β-胡蘿卜素資源,但其在生物體內的含量一般僅占生物體干重的0.2%左右[16-17]。天然的β-胡蘿卜素的主要來源是植物、藻類中提取以及微生物發(fā)酵[18]。從β-胡蘿卜素含量豐富的天然植物或其下腳料,利用有機溶劑萃取、超聲提取、超臨界流萃取等方法,可提取到天然的β-胡蘿卜素[2,19]。張巖等[20]通過高效液相色譜法分析白蓮花粉中的β-胡蘿卜素,確定白蓮花粉中的β-胡蘿卜素含量較豐富,并采用有機溶劑法對白蓮花粉中β-胡蘿卜素進行提取,提取量為596.22 μg/g。藻類特別是杜氏鹽藻富含β-胡蘿卜素,且藻類的適應能力強[21],所以經(jīng)常被用于β-胡蘿卜素的生產(chǎn)研究。但藻類的生長繁殖易受到產(chǎn)地、氣候等因素的影響,導致以藻類為原料提取β-胡蘿卜素的成本較高、提取收率差異大,難以實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)[22]。虞海天等[23]將杜氏鹽藻綜合利用,不僅從杜氏鹽藻中提取β-胡蘿卜素,還利用杜氏鹽藻中的油脂制成生物柴油。

1.3 微生物發(fā)酵法

隨著生物技術的發(fā)展,β-胡蘿卜素的發(fā)酵生產(chǎn)技術基于現(xiàn)代發(fā)酵技術和生物反應器技術的進步得到了快速發(fā)展[22]。目前常用的微生物有紅酵母、布拉克須霉菌、三孢布拉氏霉菌等[24]。唐玲[25]優(yōu)化了三抱布拉氏霉菌種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基,將β-胡蘿卜素的產(chǎn)量提高至13.79 mg/L。張磊[22]先建立了絲狀真菌分離單菌落的方法,穩(wěn)定菌株性能,同時也提高了三孢布拉霉單菌落發(fā)酵β-胡蘿卜素的能力,再將高通量篩選技術與三孢布拉霉誘變選育技術相結合得到高產(chǎn)突變株,最后通過單因素和響應面優(yōu)化研究確定高產(chǎn)β-胡蘿卜素的工藝條件,奠定了三孢布拉霉發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素產(chǎn)業(yè)化的基礎。微生物發(fā)酵得到的β-胡蘿卜素有生物活性,且生產(chǎn)β-胡蘿卜素不受外界環(huán)境的限制,生產(chǎn)周期短,生產(chǎn)安全性高,成本低廉[6]。

1.4 基因工程法

微生物合成β-胡蘿卜素需由法尼基焦磷酸先后經(jīng)過六氫番茄紅素合酶、六氫番茄紅素脫氫酶,番茄紅素環(huán)化酶的催化轉化而成[26],所以基因工程法利用的工程菌是一些能合成法尼基焦磷酸的微生物[2]。研究發(fā)現(xiàn)4個crt基因(crtE、crtB、crtI、crtY)控制FPP合成β-胡蘿卜素[2]。尹升明[27]在耶羅維解脂酵母導入β-胡蘿卜素合成基因,使β-胡蘿卜素的產(chǎn)量達到613.63 mg/L。王巖巖[28]構建的生產(chǎn)β-胡蘿卜素的基因工程菌株是具有成團泛菌P.agglomerans的基因簇crtEYIB的大腸桿菌。利用轉基因技術減少了發(fā)酵過程中的副產(chǎn)物,優(yōu)化菌株代謝路徑,提高了生物體內β-胡蘿卜素的含量并增加了β-胡蘿卜素的產(chǎn)量,已成為當前研究的熱點。

2 β-胡蘿卜素的提取方法

2.1 有機溶劑提取法

有機溶劑提取法是一種傳統(tǒng)的提取活性物質的方法,其原理是利用溶劑與活性物質相似相溶性,使活性物質從原料內部轉移到溶劑中。提取β-胡蘿卜素常用的有機溶劑有乙酸乙酯、石油醚、正己烷等[29]。王海英等[30]進行了萃取劑、溫度、時間、固液比對β-胡蘿卜素提取率影響的單因素實驗優(yōu)化提取工藝,確定最佳提取工藝件為: 乙酸乙酯為萃取劑,65 ℃下恒溫處理6 h,固液比為1∶10(mg∶mL)。陳玉萍等[31]通過單因素實驗,確定以石油醚為溶劑提取辣椒中的色素時,適宜的提取條件為: 溫度為50 ℃、料液比為1∶15(g∶mL)、浸提時間 1.5 h。有機溶劑提取法操作簡單、工藝成熟、設備及投資成本較低,普遍應用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn),但是溶劑的選擇性不高、提取率比較低,而且產(chǎn)品中存在有機溶劑殘留,會影響產(chǎn)品的質量[19-29]。β-胡蘿卜素對氧氣、熱、光不穩(wěn)定,該提純方法還可能導致β-胡蘿卜素的異構、氧化和降解[19]。

2.2 柱層析法

柱層析法是利用吸附劑對混合樣品中各組分的吸附能力不同,使各個組分分離的方法,該法能有效分離多重組分的混合物,采用柱層析法對β-胡蘿卜素進行提取純化一般用吸附樹脂、硅膠、中性氧化鋁作為吸附劑[32]。聶艷玲[33]將牛蒡根中超聲波輔助有機溶劑浸提所得的β-胡蘿卜素提取液通過氧化鋁柱純化,確定洗脫劑為石油醚-丙酮(體積比6∶1)時,洗脫效果最佳。陳驍熠[34]通過正交設計試驗,確定從胡蘿卜中提取的β-胡蘿卜素最佳工藝條件是:石油醚-丙酮的體積比為4∶1,氧化鋁目數(shù)為200目(粒徑0.075 mm),柱高為10 cm,加入穩(wěn)定劑后提取率可達91.72%。與其他方法相比,柱層析法耗能低、溶劑易于回收再利用、產(chǎn)品純度高[35],但是此法提取工藝復雜、耗時長且溶劑用量大,β-胡蘿卜素還難以快速洗脫,所以在實際應用中,該法不適用于工業(yè)化生產(chǎn)[19]。

2.3 超臨界CO2萃取法

超臨界CO2(supercritical dioxide,SC-CO2)萃取法是一種常見的超臨界流體萃取方法,利用處于臨界壓力和臨界溫度以上的流體的特性,使萃取物和萃取劑得到有效的分離,更有利于萃取[36]。姚萍等[37]將菠菜作為原料,采用超臨界CO2萃取技術提取β-胡蘿卜素,通過正交試驗設計,確定最佳工藝條件為:萃取溫度40 ℃,萃取壓力20 MPa,萃取時間120 min,夾帶劑用量10%,在此條件下,β-胡蘿卜素的提取量達5.04 mg/100 g。孫瑞瑞[29]利用超臨界CO2萃取紫蘇油粕β-胡蘿卜素,在單因素試驗的基礎上,采用Box-Behnken試驗設計方法和響應面分析法,確定最佳提取工藝為:萃取溫度43 ℃、萃取壓力38 MPa、萃取時間3 h,在此條件下,β-胡蘿卜素得率為91.57%。超臨界CO2萃取法具有更高效快速、無溶劑殘留、無溶劑丟失、選擇性強、操作條件溫和,可以有效的保留萃取物中的易揮發(fā)性和熱敏性成分等優(yōu)點,并滿足無溶劑β-胡蘿卜素日益增長的需求[36,38-40]。然而,在實際操作過程中,需使用夾帶劑來提高β-胡蘿卜素在CO2中溶解度[19],而且超臨界CO2萃取技術由于要求有一定的壓力環(huán)境,其設備的成本較高,運行和維護的費用也多[38]。

2.4 超聲輔助提取法

超聲波產(chǎn)生的空化、振動、粉碎、攪拌等綜合效應可輔助提取天然產(chǎn)物成分,不僅破壞了細胞壁使得有效成分溶出,還增加溶劑和產(chǎn)物之間的接觸表面積,增強傳質,促進了細胞內可溶性化合物的釋放,便于提取[41-44]。房明[32]利用超聲波輔助提取螺旋藻中的β-胡蘿卜素,通過響應面分析試驗,確定最佳提取工藝參數(shù)為:甲醇-丙酮混合液4∶6(體積比)為提取劑,固液比1∶25(mg∶mL),超聲功率51%,超聲17 min,在該條件下β-胡蘿卜素提取率為1 942.14 μg/L。Soumen Dey等[45]利用超聲輔助從螺旋藻中提取β-胡蘿卜素,研究了提取時間、溶劑類型、料液比、溫度、電聲強度、探針尖端長度、占空比、預處理時間等參數(shù),確定最佳條件是1.5 g螺旋藻(2 min預浸泡在甲醇)在50 mL正庚烷于30 ℃,167 W/cm2電聲強度和61.5%占空比,超聲時間為8 min,探針尖端長度為0.5 cm,浸入表面提取溶劑中,在述最優(yōu)參數(shù)下,最大提取量為47.10%,預處理時間為甲醇預處理,超聲處理2 min后,β-胡蘿卜素的提取率提高了12倍。超聲波輔助提取法能節(jié)省提取溶劑,縮短提取時間,提高提取率,減少高溫對有效成分的破壞,故對天然產(chǎn)物的提取常采用該法[45-46]。盡管有上述優(yōu)點,但超聲波輔助提取法應用于提取β-胡蘿卜素時也存在一定的局限性,在實際應用中該法對原料的粒度大小、含水量等方面有諸多限制,還可能在提取過程中發(fā)生過熱和熱解降解,所以在將超聲輔助提取應用于β-胡蘿卜素時需控制好實驗參數(shù)[43,46]。

2.5 微波輔助提取法

微波輔助提取是利用微波能加熱來提高萃取效率的一種新技術,與導電加熱不同[47],它可以同時均勻而迅速地加熱整個樣品,通過促進分子偶極子的旋轉來破壞弱氫鍵,可以在短時間內破壞細胞壁,使溶劑非常容易地進入細胞內,溶解并釋放細胞內的物質[31-36]。在微波場中,根據(jù)不同物質對微波能的吸收程度不同,可以選擇性加熱基體物質的某些區(qū)域或萃取體系中的某些組分,從而呈現(xiàn)出較好的選擇性[48-49]。王穎等[50]以胡蘿卜為原料微波輔助提取β-胡蘿卜素,乙酸乙酯/無水乙醇混合液作為提取溶劑,通過單因素試驗確定最佳工藝條件為:料液比1∶5(g∶mL),微波功率400 W、微波時間40 s,在此條件下,β-胡蘿卜素的收率可達47.8%。孫協(xié)軍等[51]從鹽藻粉中采用微波輔助提取β-胡蘿卜素,確定最佳工藝條件為:乙酸乙酯為溶劑,液固比232 mL/g,微波功率500 W,提取溫度42 ℃,萃取時間7 min,攪拌轉速180 r/min,在此條件下,β-胡蘿卜素的收率為1.03%。微波輔助提取法提取β-胡蘿卜素等天然產(chǎn)物可以節(jié)省時間,減少溶劑用量,提取效率高,設備簡單且成本低,對環(huán)境的污染小[19]。但是微波加熱的升溫速率很快,難以控制,可能會導致β-胡蘿卜素發(fā)生異構化[48-49]。

3 β-胡蘿卜素功能

3.1 維生素A源

維生素A是主要包括視黃醇、視網(wǎng)膜、視黃酸和β-胡蘿卜素的一組不飽和的有機化合物,其中最重要的是β-胡蘿卜素[52]。維生素A不僅參與人體正常視覺的維持,而且在生長發(fā)育、細胞增殖分化、特異性和非特異性免疫、造血及調節(jié)代謝等方面發(fā)揮著廣泛的調控作用,是人體不可或缺的微量營養(yǎng)元素[53]。

1919年,Steenkbock發(fā)現(xiàn)了β-胡蘿卜素可能具有維生A素的生物活性,到1928年,Moore通過實驗進一步證實了β-胡蘿卜素可以在體內轉化為維生素A[54]。在代謝過程中,機體內維生素A的含量變化是改變β-胡蘿卜素的生物利用率的原因,當機體缺乏維生素A時,β-胡蘿卜素的生物轉化率升高,同時,該生物轉化過程還會在體內有充足β-胡蘿卜素時被抑制,避免了體內因維生素A過量而導致的中毒現(xiàn)象[54]。

3.2 抗氧化

β-胡蘿卜素結構含有11個共軛多烯雙鍵和2個紫羅酮環(huán),具有較強的捕捉自由基的能力,能清除氧自由基、單線態(tài)氧,降低脂質氧化物的產(chǎn)生,緩解氧化應激帶來的不良影響[54-55]。因此,β-胡蘿卜素能夠防止細胞損傷,每個β-胡蘿卜素分子可猝滅多達1 000個自由基[56-57]。單線態(tài)氧猝滅可能僅局限于皮膚,因為皮膚是唯一含有較高水平的β-胡蘿卜素的受光照的組織。在清除自由基后,β-胡蘿卜素會分解,不能再生[58]。現(xiàn)階段發(fā)現(xiàn)的β-胡蘿卜素的抗氧化機制可能包括以下三點:(1)雙鍵結構與自由基結合,使、能降低自由基活性或清除自由基;(2)通過電子交換能量轉移,猝滅單線態(tài)氧;(3)促進核因子E2相關因子2( nuclear factor erythroid2-relatedfactor2,Nrf2) mRNA表達,通過激活Nrf2表達,促進機體合成抗氧化酶[59]。黎海利等[60]通過測定紅肉火龍果果肉中提取的β-胡蘿卜素對自由基超氧陰離子及DPPH自由基的清除率,并與維生素C對自由基超氧陰離子及DPPH自由基的清除率進行比對,證明具有較高的抗氧化活性。

3.3 抗腫瘤

β-胡蘿卜素通過不同的機制能抑制癌細胞的增殖,誘導癌細胞凋亡且減少化療的不良反應,對多種癌癥都均有防治作用[19]。人們普遍認為,食用大量富含類胡蘿卜素的水果和蔬菜的人會降低患癌癥的風險[56]。已有大量的科學研究證明β-胡蘿卜素對胃癌、結腸癌、乳腺癌以及前列腺癌等均有顯著的抑制和預防作用[32]。同時有研究發(fā)現(xiàn),β-胡蘿卜素對結腸癌、前列腺癌的抑制僅作用于不吸煙的人,對吸煙的人則不會產(chǎn)生抑制效果,反而會促進癌癥發(fā)病[6]。此外,β-胡蘿卜素對乳腺癌有著較為顯著的抑制作用,能使乳腺癌的發(fā)生率顯著降低[61]。

3.4 其他功能

李若楠等[62]選用仔豬空腸上皮( IPEC-J2)細胞系建立體外細胞模型,采用MTT法檢測細胞細胞活力,發(fā)現(xiàn)β-胡蘿卜素能夠提高脂多糖誘發(fā)的空腸上皮細胞炎癥反應中閉合蛋白(Occludin)、鈣黏蛋白(Claudin4)、帶狀閉合蛋白(ZO-1)緊密連接蛋白表達水平,推測出提高緊密連接蛋白表達水平是β-胡蘿卜素對空腸上皮細胞的抗炎作用的途徑之一。房明[32]通過建立糖尿病動物模型探究β-胡蘿卜素的降血糖生物活性,發(fā)現(xiàn)β-胡蘿卜素能有效抑制和減緩高血糖引起的病癥,且不存在低血糖等副作用。

目前越來越多的臨床試驗已經(jīng)證實了β-胡蘿卜素具有治療胃潰瘍、萎縮性胃炎、矽肺病、復發(fā)性口腔潰瘍,防治冠心病及預防心腦血管硬化,降低老年性黃斑變性和白內障的風險等功能[33]。

4 展望

β-胡蘿卜素具有多種生物學功能,在醫(yī)藥、食品、化妝品等領域具有廣泛的應用。隨著人們對于健康不斷的重視,β-胡蘿卜市場需求將持續(xù)攀升。需探究一些大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)β-胡蘿卜素的方法,并擴大β-胡蘿卜素的來源,以滿足人們對β-胡蘿卜素日益增長的需求。