甘藍DELLA基因家族鑒定及其mRNA在嫁接體中的運輸分析

李必元，趙彥婷，岳智臣，雷娟利，胡齊贊，陶鵬

研究報告

甘藍DELLA基因家族鑒定及其mRNA在嫁接體中的運輸分析

李必元，趙彥婷，岳智臣，雷娟利，胡齊贊，陶鵬

浙江省農業(yè)科學院蔬菜研究所，杭州 310021

DELLA基因家族參與植物激素信號轉導通路的調控，其中()mRNA還是植物體內長距離運輸?shù)男盘柗肿?。在全基因組范圍內鑒定甘藍(var.) DELLA基因家族成員并分析mRNA運輸特性，可為甘藍DELLA基因家族的開發(fā)應用提供基礎數(shù)據(jù)。本研究利用甘藍基因組數(shù)據(jù)和轉錄組數(shù)據(jù)，在甘藍中鑒定了5個DELLA基因家族成員(、、、和)，但甘藍基因組缺失了基因。采用劈接法將甘藍(自交系G27)接穗和菜心(L. ssp.var.Tsen et Lee)(四九菜心)砧木嫁接在一起，構建異源嫁接體。對砧木菜心花序軸和對應位置的實生苗菜心花序軸(對照)取樣進行轉錄組測序。在甘藍/菜心異源嫁接體的砧木菜心花序軸的轉錄組測序文庫中分別鑒定到8、9、3、5、1個來自甘藍、、、和的外源read。甘藍DELLA家族基因mRNA運輸并沒有提高砧木菜心中DELLA家族基因的轉錄表達水平。相關性分析顯示，甘藍DELLA家族基因mRNA運輸效率與其自身的序列和接穗甘藍中的DELLA家族基因的轉錄表達水平相關。本研究為深入探究甘藍DELLA家族基因mRNA運輸?shù)姆肿訖C制奠定了基礎。

甘藍；菜心；嫁接；DELLA基因；mRNA運輸

植物的生長發(fā)育受到多種內源、外源激素和外部環(huán)境的影響，而DELLA蛋白是多種激素信號和環(huán)境信號的主要整合者。因其蛋白N端含有高度保守的DELLA基序，而被命名為DELLA基因家族[1,2]。DELLA和VHYNP基序控制DELLA蛋白與GA-insensitive dwarf 1 (GID1)的結合能力以及DELLA蛋白的水解[3]。DELLA蛋白的C端有一個保守的GRAS功能結構域，具有調控DELLA蛋白活性的功能。DELLA蛋白可與ABA INSENSITIVE 3 (ABI3)、ABI5、AUXIN RESPONSE FACTOR 6、PHYTOCHROME INTERACTING FACTORs等轉錄因子相互作用，參與調控多種植物激素的信號通路[4,5]。多種植物的DELLA 基因家族成員已被鑒定，如模式植物擬南芥DELLA基因家族包含()、()、()、()和()共5個成員[6,7]。DELLA家族基因參與調控植物的生長發(fā)育和抗逆響應等；此外，通過基因工程手段改造DELLA家族基因，在多個經濟作物中實現(xiàn)了植株矮化和產量提高[8]。

DELLA基因家族成員mRNA是長距離運輸信號，可在植物體中進行長距離運輸，并調控植物的生長發(fā)育[9]。嫁接是一種人工營養(yǎng)繁殖技術，可用于分析接穗和砧木之間的物質運輸[10,11]，為研究DELLA家族基因mRNA運輸提供了技術支撐。通過構建嫁接體，發(fā)現(xiàn)茶海棠(Redh. var. pingyiensis)mRNA可在嫁接體中進行運輸[12]。mRNA可以從伴細胞移動到篩管中，并且其翻譯的蛋白產物保留在其運輸位置[13]。研究還發(fā)現(xiàn)擬南芥()mRNA的編碼序列和3′UTR的特定基序和序列介導了mRNA在嫁接體中的長距離運輸[14]。結球甘藍(下文均簡稱甘藍)是十字花科蕓薹屬甘藍種中的一個變種，在我國蔬菜出口貿易以及周年供應中占有極其重要的地位。當前，對甘藍DELLA基因家族成員及其mRNA運輸特性并不清楚，影響了甘藍品種改良的應用。目前，菜心DELLA基因家族成員已被鑒定[15]，為利用甘藍/菜心異源嫁接體研究甘藍DELLA家族基因mRNA運輸提供了基礎數(shù)據(jù)。本研究在甘藍全基因組范圍內鑒定了5個DELLA基因家族成員；通過構建甘藍/菜心異源嫁接體，發(fā)現(xiàn)甘藍DELLA家族5個基因的mRNA均可從接穗運輸?shù)秸枘静诵闹?，并比較分析了它們的運輸效率。本研究為后期開展甘藍DELLA家族基因mRNA運輸分子機制研究提供了基礎數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 嫁接體的構建和轉錄組測序

2016年8月下旬在浙江省農業(yè)科學院玻璃溫室中(經度120.2°，緯度30.3°)播種四九菜心，一周后播種甘藍G27，生長40 d后，采用劈接法將甘藍G27的莖尖(營養(yǎng)生長階段)分別嫁接到甘藍G27的莖(營養(yǎng)生長階段)和四九菜心花序軸(生殖生長階段)上，構建甘藍/甘藍同源嫁接體和甘藍/菜心異源嫁接體。另外，保留一部分菜心實生苗作為對照。嫁接生長30 d后，接穗甘藍為蓮座狀，而砧木菜心和實生苗菜心均為抽薹開花狀態(tài)。取甘藍/菜心嫁接的砧木菜心花序軸和相同位置的菜心實生苗的花序軸進行轉錄組測序；在甘藍/甘藍同源嫁接體生長30 d后，在接穗上取長約2 cm的甘藍莖尖進行轉錄組測序，為后續(xù)的DELLA基因家族成員mRNA運輸效率與其在接穗中的轉錄表達量之間的相關性分析提供數(shù)據(jù)。上述樣品均取樣3次作為生物學重復。由北京百邁客公司完成RNA提取，通過Nanodrop檢測RNA的純度和Agilent 2100檢測RNA的完整性。構建文庫后，使用Qubit2.0進行初步定量，使用Agilent 2100對文庫的插入片段大小進行檢測。使用qPCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量(文庫有效濃度> 2 nmol/L)，完成庫檢。庫檢合格后，不同文庫按照目標下機數(shù)據(jù)量進行建池，在Illumina HiSeq平臺進行測序，轉錄組測序的read長為150 bp。甘藍的轉錄組數(shù)據(jù)參考Braol JZS V 2.0基因組，菜心的數(shù)據(jù)參考Brara Chiifu V 1.5基因組分別進行序列比對，基因的轉錄表達水平基于FPKM算法獲得。

1.2 甘藍DELLA基因家族成員鑒定

使用擬南芥DELLA基因家族成員(、、、和)的序列[6,7]，在甘藍基因組數(shù)據(jù)庫(Braol JZS V 2.0) (http://brassicadb.cn/#/)進行BLASTn檢索(檢索覆蓋率>95%、序列一致率>75%)，在甘藍全基因組中鑒定DELLA基因家族成員。基于擬南芥中的同源基因，分別命名為、、、和。使用ProtParam tool (https://web.expasy.org/protparam/)分析甘藍DELLA家族蛋白的氨基酸數(shù)量、分子量和等電點(pI)。參考甘藍DELLA基因家族成員的序列，利用甘藍/甘藍嫁接體的接穗甘藍莖尖的轉錄組測序文庫中的reads，拼接獲得甘藍G27的DELLA基因家族成員的編碼序列和3′UTR序列。參考白菜DELLA基因的序列，利用菜心實生苗花序軸的轉錄組測序文庫中的reads，拼接獲得四九菜心的DELLA基因家族成員的編碼序列和3′UTR。

1.3 DELLA基因家族系統(tǒng)進化分析

使用擬南芥DELLA基因家族在Ensembl Plants(http://plants.ensembl.org/)檢索可獲得動物、真菌以及植物中DELLA基因家族成員的獲得和丟失情況，了解DELLA的進化歷程。下載十字花科植物DELLA基因的編碼序列，使用MEGA7，采用最大似然法(maximum likelihood method，ML) Kimura 2-parameter 模型，Bootstrap值設置為1000，構建ML系統(tǒng)樹。

1.4 mRNA運輸分析

使用ClustalX比對甘藍DELLA基因和菜心DELLA基因的序列，在甘藍每個DELLA基因的編碼區(qū)上篩選3段長為28 bp的特異序列作為檢索序列(表1)，使用UltraEdit文本編輯器在甘藍/菜心異源嫁接體砧木花序軸的3個生物學重復的轉錄組測序文庫(G1、G2和G3)中過濾獲得外源的甘藍DELLA基因的read。在菜心實生苗花序軸的3個生物學重復的轉錄組測序文庫(C1、C2和C3)篩選外源read。對初步獲得的甘藍read進行驗證，排除重復的read，對余下的read使用ClustalX進行序列比對。參考文獻[16]，在一條read上存在2個以上的差異堿基，可認定為運輸?shù)膔ead。

表1 在菜心轉錄組測序文庫中篩選外源甘藍DELLA基因read的檢索序列

1.5 DELLA家族基因mRNA運輸效率相關性分析

擬南芥DELLA基因家族成員() mRNA可進行長距離運輸，研究顯示的運輸效率與其部分編碼序列和3′UTR序列密切相關[14]。使用甘藍DELLA基因家族成員序列分別與擬南芥(998～1771)進行序列比對，計算它們與(998～1771)序列的一致率。設置甘藍DELLA基因家族每個成員mRNA運輸?shù)膔ead數(shù)量作為運輸效率，并使用SPSS(V26.0)與上述的序列一致率進行雙變量皮爾遜相關性分析。比較運輸效率與甘藍/甘藍嫁接體的接穗甘藍中DELLA家族基因轉錄表達量的雙變量皮爾遜相關性。

2 結果與分析

2.1 甘藍DELLA基因家族鑒定

通過BLAST分析，本研究在甘藍全基因組范圍內鑒定到5個DELLA基因家族成員，未鑒定到。擬南芥包含1個基因，甘藍中存在2個基因，分別定位于甘藍的亞基因組LF和MF2中。蕓薹屬植物的祖先在進化中發(fā)生過基因組三倍化，但甘藍DELLA基因家族成員的數(shù)量并未增加。甘藍DELLA家族蛋白的氨基酸數(shù)量在507～576之間，分子量介于55.8～62.8 kDa，等電點在4.73～5.52之間。甘藍DELLA家族基因不存在內含子(表2)。

2.2 DELLA基因系統(tǒng)進化分析

為了解DELLA基因家族的起源與進化，本研究分析了DELLA基因家族的分布情況。結果顯示，動物、真菌和藻類植物(紅藻、綠藻和輪藻)中均不存在DELLA基因。DELLA基因廣泛存在于地錢()、小立碗蘚()、江南卷柏()以及開花植物中(圖1)。

表2 甘藍中DELLA家族基因對應的同源基因及其蛋白屬性

圖1 DELLA基因在不同物種中的分布

為分析DELLA基因家族在十字花科植物中的系統(tǒng)發(fā)育關系，本文構建了ML系統(tǒng)進化樹。結果顯示，不僅在甘藍中缺失基因，蕓薹屬其他物種(白菜、菜心、芥菜、黑芥以及甘藍型油菜)均缺失基因。該結果暗示基因在蕓薹屬祖先中已經丟失，定位在LF亞基因組的和MF2亞基因組的是通過進化過程中的基因組三倍化形成的。亞麻薺()在進化過程中也發(fā)生過三倍化，其每種類型的DELLA基因家族成員的數(shù)量均是擬南芥中對應直系同源基因數(shù)量的3倍。十字花科植物中，基因和基因聚類在同一分支，親緣關系較近。、和聚類在另一分支，但和之間的親緣關系更近(圖2)。

2.3 甘藍和菜心DELLA基因在嫁接體中的轉錄表達分析

本研究構建了甘藍/菜心異源嫁接體，并分別對甘藍/菜心異源嫁接體的砧木花序軸以及菜心實生苗的花序軸進行了轉錄組測序。在甘藍/菜心異源嫁接體中，和的表達量是、、表達量的6倍以上，的表達量是、表達量的8倍以上。、、、在菜心實生苗花序軸中的表達量與在甘藍/菜心異源嫁接體中菜心花序軸中的表達量相比，差異不明顯。相比于菜心實生苗花序軸中的表達，在甘藍/菜心異源嫁接體的花序軸中的表達量更高(圖3)。

圖2 十字花科植物DELLA基因系統(tǒng)發(fā)育樹

Aa：阿拉伯巖芥；Al：琴葉擬南芥；At：擬南芥；Bc：菜心；Bni：黑芥；Bo：甘藍；Br：白菜；BjA：芥菜A基因組；BjB：芥菜B基因組；BnA：甘藍A基因組；BnC：甘藍C基因組；Si：水蒜芥；Es：鹽芥；Cs：亞麻薺；Cr：薺菜；Sp：條葉鹽芥。

圖3 DELLA基因在甘藍/菜心異源嫁接體的菜心花序軸以及菜心實生苗對應位置的花序軸中的轉錄表達

2.4 甘藍DELLA基因在異源嫁接體中的mRNA運輸分析

甘藍和菜心屬于不同的物種，兩者在基因序列上存在差異。通過構建甘藍/菜心異源嫁接體，并對其進行轉錄組測序，可利用種間差異序列來鑒定長距離運輸及外源的mRNA read (圖4A)。通過比對甘藍和菜心的DELLA基因序列，在甘藍每個DELLA基因編碼區(qū)內選擇了3段特異性序列作為檢索序列(表1)。使用上述的檢索序列在菜心實生苗花序軸的轉錄組測序文庫(C1、C2和C3)進行篩選，未獲得外源的甘藍DELLA基因的read，證明了上述檢索序列的可靠性。利用上述驗證后的檢索序列在甘藍/菜心異源嫁接體的菜心花序軸轉錄組文庫中(G1、G2和G3)中進行檢索，在3個檢索位點(；)和3個菜心轉錄組測序文庫中(G1、G2和G3；G1、G2和G3)鑒定到分別來自甘藍和的8、9條read。在2個檢索位點(和；和)和2個菜心轉錄組測序文庫中(G1和G3；G2和G3)鑒定到分別來自和的3、5條外源read。在位點和G2文庫中鑒定到來自的1條外源read(圖4B)。上述的每條read長度為150 bp。每條read與相應的菜心和甘藍的DELLA基因進行序列比對(圖5)，結果顯示在砧木菜心花序軸中篩選的read在序列上與甘藍同源，證明了接穗甘藍中的DELLA基因的mRNA發(fā)生了運輸。

圖4 利用異源嫁接體分析DELLA家族基因mRNA運輸

A：甘藍/菜心異源嫁接體及其轉錄組測序文庫示意圖；B：不同檢索序列在菜心花序軸轉錄組測序文庫(C1、C2和C3)和在甘藍/菜心異源嫁接體的菜心花序軸的轉錄組文庫(G1、G2和G3)中篩選結果。

2.5 甘藍DELLA基因運輸效率分析

為系統(tǒng)評價DELLA基因家族每個成員的mRNA運輸效率，本研究分析了3個檢索位點、3個文庫的檢測情況以及運輸read的總數(shù)。結果顯示，和在每個檢測位點、每個文庫中都能找到外源的和的read。而和只能在部分位點和部分文庫中找到運輸?shù)膔ead?；跈z索位點的覆蓋度、文庫中重復性以及運輸read的總數(shù)，顯示和的mRNA運輸效率最高。

研究顯示擬南芥的mRNA運輸效率與其部分編碼區(qū)和3′UTR的序列密切相關。由于甘藍DELLA基因家族5個成員的mRNA在3′UTR的長度上有差異，本研究選擇(998～1771)作為參考序列，比較分析了甘藍DELLA基因家族成員與(998～1771)的序列一致率，結果顯示、與(998～1771)的序列一致率在81%以上。而、、與(998～1771)的序列一致率介于64.2%～65.1%之間(表3)。

為找出影響DELLA基因家族成員mRNA運輸效率的相關因素，以運輸read的數(shù)量作為其mRNA運輸效率的指標，分別與序列的一致率、甘藍/甘藍嫁接體的接穗甘藍莖尖中的表達量進行雙變量相關性分析。結果顯示，DELLA基因家族成員的mRNA運輸效率與序列一致率(與(998～1771)比對)呈正顯著相關(皮爾遜相關性系數(shù)=0.889，=0.04<0.05)。甘藍DELLA基因的mRNA運輸效率與接穗甘藍中DELLA基因的轉錄表達量也呈正顯著相關(皮爾遜相關性系數(shù)=0.928，=0.02<0.05)。

圖5 運輸?shù)膔ead與相應的甘藍和菜心DELLA基因序列比對

表3 甘藍DELLA家族基因mRNA運輸效率分析

3 討論

GA是調控植物生長發(fā)育的一類激素，而DELLA家族基因是GA代謝通路中的關鍵基因。因此，在動物和真菌中均未檢測到DELLA基因，表明DELLA基因家族是植物所特有的，但不是所有植物中均有DELLA基因(如紅藻和綠藻)(圖1)。輪藻具有類似根、莖、葉的分化，但也沒有DELLA基因。在苔蘚植物地錢、小立碗蘚以及蕨類植物江南卷柏中開始出現(xiàn)DELLA基因，之后廣泛分布于開花植物中(圖1)[17]。研究表明，DELLA蛋白參與調控植物莖、葉、花的生長發(fā)育以及種子萌發(fā)與休眠[18]。DELLA基因家族的出現(xiàn)可能與植物形態(tài)特征的進化密切相關。

本研究通過構建異源嫁接體和轉錄組測序，在砧木菜心花序軸中鑒定到來自于甘藍DELLA基因家族的read，并且甘藍DELLA基因家族成員mRNA運輸效率存在差異，其中和的mRNA運輸效率明顯高于、、(表3)。研究認為，基因的mRNA運輸效率與其mRNA的表達量和序列結構均有關[14,16]。擬南芥基因mRNA可進行長距離運輸，其運輸效率與其部分編碼序列和3′UTR序列有關[14]。甘藍中不存在基因，但甘藍DELLA基因家族成員與序列相似，且均發(fā)生了mRNA運輸，暗示甘藍DELLA家族基因序列可能與mRNA運輸效率有關。相比于、和，和序列與的序列相似度更高(表3)。相關性分析顯示甘藍DELLA基因家族成員的mRNA運輸效率與其序列一致率(和(998～1771)相比)相關，但仍需要更多研究才能確定兩者之間的因果關系。研究發(fā)現(xiàn)，某些mRNA (如DMC1:tRNA)形成三葉草結構，并富集在韌皮部中，在接穗和砧木之間進行運輸[19,20]。有研究認為基因的mRNA運輸效率與其自身的轉錄表達量有關[16]。本研究結果顯示接穗甘藍DELLA基因和在甘藍莖尖的表達量明顯高于、和(圖3)，而DELLA基因的mRNA運輸效率與之相對應。

在甘藍/菜心異源嫁接體中，盡管接穗甘藍向砧木菜心花序軸運輸了DELLA基因mRNA，但并沒有提高砧木菜心DELLA基因的轉錄表達量(圖3)。推測與甘藍DELLA基因mRNA運輸?shù)秸枘静诵牡臄?shù)量太少有關。另一方面，菜心砧木中的DELLA基因的mRNA也有可能向上運輸?shù)搅私铀敫仕{中，從而形成一種動態(tài)平衡。本研究鑒定了甘藍DELLA基因家族成員，并分析它們的mRNA運輸特征，為理解甘藍DELLA基因家族的生物學功能和甘藍的遺傳改良提供了參考依據(jù)。

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Identification of DELLA gene family in head cabbage and analysis of mRNA transport in the heterograft

Biyuan Li, Yanting Zhao, Zhichen Yue, Juanli Lei, Qizan Hu, Peng Tao

DELLA gene family is involved in the regulation of signal transduction of plant hormones. mRNAs of(), the member of DELLA gene family, are also signaling molecules of long-distance transport in plants. Genome-wide identification and mRNA transport analysis of the members of DELLA gene family in head cabbage (var.) can provide basic data for their application in head cabbage. In this study, five members of DELLA gene family (,,,, and) were identified in head cabbage using genome and transcriptome data. However, head cabbage lacked agene in its genome. The scion (head cabbage, inbred line G27) and the rootstock Chinese flowering cabbage (L. ssp.var.Tsen et Lee) (sijiucaixin) were cleft-grafted together to produce the heterograft. Inflorescence stem of the rootstock and the corresponding inflorescence stem in Chinese flowering cabbage seedlings (as controls) were purified and analyzed with transcriptome sequencing. The total of 8, 9, 3, 5, and 1 exogenous read(s), derived respectively from,,,, and, were identified in the transcriptomes of the rootstocks. Nevertheless, mRNA transport of DELLA family genes from scion to rootstock did not increase the transcriptional level of the members of DELLA gene family in the rootstocks. Correlation analysis suggested that mRNA transport efficiency of the DELLA family genes was correlated with the sequence and the transcriptional level of the respective DELLA gene in the scion (head cabbage). This study lays the foundation for further investigation on the molecular mechanism of mRNA transport of the members of DELLA gene family in head cabbage.

head cabbage; Chinese flowering cabbage; grafting; DELLA genes; mRNA transport

2022-10-18;

2022-12-31;

2023-02-06

浙江省自然科學基金項目(編號：LY21C150006)，浙江省農業(yè)新品種選育重大科技專項(編號：2021C02065-4-4)和國家自然科學基金項目(編號：31601746)資助[Supported by the Natural Science Foundation of Zhejiang Province (No.LY21C150006), the Grand Science and Technology Special Project of Zhejiang Province (No.2021C02065-4-4), and the National Natural Science Foundation of China (No.31601746)]

李必元，學士，副研究員，研究方向：十字花科蔬菜作物遺傳育種。E-mail: 16061944@qq.com

陶鵬，博士，副研究員，研究方向：十字花科蔬菜作物分子遺傳學。E-mail: taopeng-84@163.com

10.16288/j.yczz.22-330

(責任編委: 許勇)