改良QuEChERS-GC-TQT/MS法測(cè)定大米中16種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留

朱潔靈，周瑞錚，張樹權(quán)，莫淑梅，沈昌瑩

東莞市食品藥品檢驗(yàn)所（東莞 523808）

大米是日常飲食的主食之一，含有蛋白質(zhì)，脂肪，維生素B1、維生素A、維生素E及多種礦物質(zhì)，為人體健康發(fā)育提供營養(yǎng)與能量保障。大米是稻谷經(jīng)礱谷、碾米等工序后制成的成品。水稻種植過程中由于受環(huán)境溫濕度的影響，雜草與病蟲害較多，而農(nóng)戶為保證水稻產(chǎn)量，常選擇施用農(nóng)藥以除去雜草和減輕病蟲害，但農(nóng)藥的不合理使用會(huì)導(dǎo)致農(nóng)作物被污染，進(jìn)而污染環(huán)境，影響大米的食用安全[1]。隨著農(nóng)藥的廣泛使用、超量使用甚至濫用引發(fā)的食品安全、環(huán)境污染等諸多問題，引起社會(huì)公眾的高度關(guān)注和政府的高度重視[2]。有機(jī)磷農(nóng)藥因其高效、廣譜、半衰期短而被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[3]。

農(nóng)藥殘留的測(cè)定方法主要有氣相色譜法[4-6]、液相色譜法[7-8]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[9-12]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[13]。相較于氣相法、液相法依賴保留時(shí)間定性，氣質(zhì)法和液質(zhì)法通過保留時(shí)間與離子豐度比相結(jié)合對(duì)目標(biāo)化合物定性更為準(zhǔn)確。常用的提取方式有超聲提取[14]、振蕩提取[15]和加壓流體萃取[16-17]，前處理凈化方式主要有固相小柱凈化[18]、凝膠滲透色譜[19]和QuECHERS法[20]。試驗(yàn)通過加壓流體萃取與QcECHERS法相結(jié)合，不僅簡(jiǎn)化試驗(yàn)過程，還提高提取效率，建立大米中有機(jī)磷農(nóng)藥氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（GCMS）的測(cè)定方法，為開展大米中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留日常檢測(cè)工作提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑耗材

MS1003TS天平（可精確至0.001 g，美國梅特勒）；HPFE-06S高通量加壓流體萃取儀[睿科集團(tuán)（廈門）股份有限公司]；RV 10 Auto旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKA集團(tuán)）；Evatros TCS氮吹儀（GOOHUNG）；TRACE1300氣相色譜儀（配有氫火焰離子化檢測(cè)器和火焰分光光度檢測(cè)器，賽默飛世爾科技有限公司）；TSQ8000三重四極桿串聯(lián)氣質(zhì)聯(lián)用[配有離子源（EI）及Chromelon7數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，賽默飛世爾科技有限公司]。

QuEChERS凈化管（400 mg PSA，400 mg C18，1 200 mg無水MgSO4，50/p，島津公司）；丙酮（色譜純，廣州化學(xué)試劑廠）；乙腈（色譜純，德國默克公司）；二氯甲烷（色譜純，天津科密歐公司）；乙酸乙酯（色譜純，德國默克公司）；無水硫酸鈉（優(yōu)級(jí)純，天津科密歐公司）；石英砂（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；硅藻土（上海阿拉?。?；試驗(yàn)用水均為超純水（18.2 MΩ·cm）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品

標(biāo)準(zhǔn)品：吡唑硫磷（1 000.5 μg/mL）、甲基內(nèi)吸磷（1 001.7 μg/mL）、硫線磷（100.5 μg/mL）、丁基嘧啶磷（1 000 μg/mL）、敵 磷（100.0 μg/mL）、甲基對(duì)氧磷（100.0 μg/mL）、安硫磷（100.0 μg/mL）、氧異柳磷（1 000.5 μg/mL）、甲伴磷砜（100.2 μg/mL）、稻豐散（100.0 μg/mL）、碘硫磷（100.1 μg/mL）、 唑磷（999.1 μg/mL）、硫環(huán)磷（100.4 μg/mL）、倍硫磷亞砜（1 003.3 μg/mL）、敵瘟磷（100.4 μg/mL）、苯線磷砜（1 001.8 μg/mL），均購自北京曼哈格生物科技。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

分別準(zhǔn)確移取吡唑硫磷、甲基內(nèi)吸磷、丁基嘧啶磷、氧異柳磷、 唑磷、倍硫磷亞砜、苯線磷砜各0.1 mL，硫線磷、敵 磷、甲基對(duì)氧磷、安硫磷、甲拌磷砜、稻豐散、碘硫磷、硫環(huán)磷、敵瘟磷，各1 mL，用丙酮定容于同一10 mL容量瓶中，配制成10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。用陰性基質(zhì)液分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.01，0.02，0.05，0.10，0.20，0.50和1.00 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。所有標(biāo)準(zhǔn)溶液均于4 ℃避光保存。

1.4 樣品溶液的制備

1.4.1 加速溶劑萃取

稱取4 g（精確至0.001 g）試樣于燒杯中，加入1 g硅藻土，攪拌混勻后，倒入34 mL萃取釜中，提取溶劑為丙酮-二氯甲烷（體積比1∶1），在10 MPa壓力和80 ℃爐溫條件下，加熱5 min，靜態(tài)萃取5 min，循環(huán)1次。用60%儲(chǔ)罐容量的溶劑沖洗萃取池，并用氮?dú)獯祾?20 s。萃取液經(jīng)無水硫酸鈉柱脫水后，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中40 ℃蒸發(fā)近干。加入丙酮并定容至10 mL，待凈化。

1.4.2 QuEChERS凈化

準(zhǔn)確吸取8 mL上述溶液于含有400 mg PSA、400 mg C18、1 200 mg無水MgSO4的凈化管中，渦旋0.5 min，按8 000 r/min離心5 min，準(zhǔn)確吸取5 mL上清液加入到10 mL刻度離心管中，于40 ℃氮吹近干，準(zhǔn)確加入1.00 mL丙酮，渦旋0.5 min，用微孔濾膜過濾，待測(cè)。

1.4.3 空白基質(zhì)溶液的制備

稱取4.00 g陰性樣品，按上述步驟操作，用于配制基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.5 儀器工作條件

1.5.1 高通量流體萃取儀參數(shù)

表1 高通量流體萃取儀參數(shù)

1.5.2 色譜條件

色譜柱DB-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度280 ℃；進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣；載氣為氦氣（純度99.999 9%）；恒定流速模式，柱流速1.2 mL/min；進(jìn)樣體積1 μL。程序升溫：初始柱溫40 ℃，保持1 min，以40 ℃/min升至120 ℃，以5 ℃/min升至240 ℃，以12 ℃/min升至300 ℃保持6 min，總分析時(shí)間38 min。

1.5.3 質(zhì)譜條件

離子源為EI源，離子源溫度280 ℃，溶劑延遲時(shí)間3 min，傳輸線溫度280 ℃，四極桿溫度150 ℃，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM），具體檢測(cè)離子對(duì)條件如表2所示。

表2 質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 試驗(yàn)條件優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇

在大米樣品中加入50 μg/kg的有機(jī)磷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，比較丙酮、乙腈、丙酮-二氯甲烷（體積比1∶1）這3種溶劑對(duì)16種有機(jī)磷農(nóng)藥提取效率的影響。如圖1所示，丙酮的提取效率一般，16種有機(jī)磷農(nóng)藥加標(biāo)回收率在75.4%～86.1%之間，原因是單一溶劑對(duì)于復(fù)雜樣品提取不完全，損耗大。乙腈在高溫加壓下提取效率較差，加標(biāo)回收率在64.2%～79.2%之間。丙酮-二氯甲烷（體積比1∶1）提取效率最好，16種有機(jī)磷農(nóng)藥的回收率為79.4%～103.8%，對(duì)于大米類含脂肪的樣品建議選用脂溶性較好的試劑進(jìn)行提取，能提高提取效率。結(jié)果表明，應(yīng)選丙酮-二氯甲烷（體積比1∶1）作為提取溶劑。

圖1 不同提取溶劑對(duì)16種有機(jī)磷農(nóng)藥加標(biāo)回收率的影響

2.1.2 提取方式與QuEChERS吸附劑的選擇

有機(jī)磷試驗(yàn)常用的提取方式有超聲提取、振蕩提取和加壓流體萃取。經(jīng)過對(duì)比分析，選用加壓流體萃取作為試驗(yàn)樣品的提取方式，整個(gè)萃取過程通過升高溫度和增加壓力，使目標(biāo)物質(zhì)的溶解度增大，同時(shí)提高溶質(zhì)的擴(kuò)散效率，確保提取充分。然而，高效提取的同時(shí)也會(huì)帶來更多的雜質(zhì)，為提高除雜效率，后續(xù)提取液會(huì)經(jīng)過凈化處理。研究發(fā)現(xiàn)含有GCB、C18、PSA、無水MgSO4的凈化管能有效去除大部分雜質(zhì)。GCB在除去提取液色素的同時(shí)，對(duì)平面結(jié)構(gòu)農(nóng)藥有較強(qiáng)吸附能力，會(huì)使農(nóng)藥提取效率降低。PSA能除去有機(jī)酸、脂肪酸和糖類等干擾物質(zhì)，C18可有效去除油脂，無水MgSO4作為吸水劑能起到凝結(jié)和沉降作用，能有效去除水溶性雜質(zhì)，提高凈化效率。對(duì)于富含淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪的大米，適合用PSA、C18、無水MgSO4這3種吸附劑除去雜質(zhì)。

2.1.3 溫度的選擇

研究氮吹溫度對(duì)農(nóng)藥回收率的影響，如圖2所示，氮吹溫度40 ℃時(shí)，農(nóng)藥的回收率最高。試驗(yàn)對(duì)比可知，氮吹溫度60 ℃時(shí)，16種有機(jī)磷農(nóng)藥的回收率為75.9%～96.4%。氮吹溫度50 ℃時(shí)，16種有機(jī)磷農(nóng)藥的回收率為79.3%～95.8%。氮吹溫度40 ℃時(shí)，16種有機(jī)磷農(nóng)藥的回收率為81.9%～103.2%。結(jié)果表明，氮吹溫度不易過高，硫線磷、甲基對(duì)氧磷、丁基嘧啶磷、唑磷、倍硫磷亞砜、苯線磷砜和敵 磷這7種有機(jī)磷農(nóng)藥在高溫下氮吹后復(fù)溶回收率明顯降低。

圖2 不同氮吹溫度對(duì)16種有機(jī)磷農(nóng)藥加標(biāo)回收率的影響

2.1.4 復(fù)溶試劑的選擇

研究不同復(fù)溶試劑對(duì)回收率的影響，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)丙酮作為復(fù)溶試劑時(shí)，16種農(nóng)藥的回收率較穩(wěn)定。經(jīng)過對(duì)比分析，乙酸乙酯作復(fù)溶試劑時(shí)，回收率為76.8%～110.2%。乙腈作復(fù)溶試劑時(shí)，回收率為30.6%～56.5%。丙酮作復(fù)溶試劑時(shí)，回收率為79.9%～98.8%。結(jié)果表明，復(fù)溶試劑為丙酮時(shí)，16種農(nóng)藥的回收率較高且較穩(wěn)定。

圖3 不同復(fù)溶試劑對(duì)16種有機(jī)磷農(nóng)藥加標(biāo)回收率的影響

2.2 色質(zhì)譜條件優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

選擇DB-5MS的毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）作為分離色譜柱，通過程序升溫分離16種待測(cè)組分。從圖4可以看出，16種有機(jī)磷農(nóng)藥皆有出峰且峰型良好，滿足定性定量要求。因此，選擇DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）毛細(xì)管柱作為分離色譜柱。

圖4 16種有機(jī)磷農(nóng)藥氣質(zhì)總離子流圖

2.2.2 定性及定量離子的選擇

定量和定性離子的選擇應(yīng)考慮：與基質(zhì)干擾離子不同，具有良好的特性、高質(zhì)量數(shù)、高對(duì)稱性和良好的再現(xiàn)性。為提高檢測(cè)方法的靈敏度，采用MRM模式進(jìn)行測(cè)定，通過單極質(zhì)譜全離子掃描，確認(rèn)升溫程序和各農(nóng)藥組分保留時(shí)間，在第一階段全掃描質(zhì)譜結(jié)果中選擇2～3個(gè)響應(yīng)高的母體離子，誘導(dǎo)母體離子碰撞和解離產(chǎn)生離子碎片。通過選擇不受基質(zhì)干擾的子離子，組成一對(duì)定性離子和一對(duì)定量離子，優(yōu)化每個(gè)離子對(duì)的碰撞解離電壓，按出峰順序分時(shí)段分別檢測(cè)。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別準(zhǔn)確吸取適量有機(jī)磷農(nóng)藥混合物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（10 μg/mL），用陰性基質(zhì)液稀釋配制成0.01，0.02，0.05，0.10，0.20，0.50和1.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，按選定的色譜、質(zhì)譜條件，經(jīng) MRM模式掃描監(jiān)測(cè)，以定量離子峰面積對(duì)質(zhì)量濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，16種農(nóng)藥的線性方程和相關(guān)系數(shù)見表3。結(jié)果表明，各農(nóng)藥在0.01～1 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好。

2.3.2 方法檢出限與定量限

以基線3倍噪音為檢出限，若取樣量為4 g，各農(nóng)藥檢出限為2.94～6.83 μg/kg，定量限為11.44～14.37 μg/kg。檢出限與定量限數(shù)據(jù)見表3。

表3 16種有機(jī)磷農(nóng)藥的線性方程、相關(guān)系數(shù)（R2）和檢出限、定量限

2.3.3 方法精密度及回收率

稱取4 g試樣，分別添加7.5，15和100 μg/kg 3個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平，每個(gè)水平進(jìn)行6次平行測(cè)定，各農(nóng)藥的平均回收率為78.8%～103.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）為1.32%～7.78%，16種有機(jī)磷農(nóng)藥的回收率和精密度情況見表4。

表4 16種有機(jī)磷農(nóng)藥的回收率和精密度（n=6）

2.4 樣品測(cè)定結(jié)果

對(duì)10份抽檢大米進(jìn)行檢測(cè)，16種農(nóng)藥在樣品中均為未檢出，說明市售大米品質(zhì)比較有保障。

3 結(jié)論

建立加速溶劑萃取、結(jié)合QuECHERS凈化測(cè)定大米中16種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的氣相色譜/三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法。甲基內(nèi)吸磷等16種有機(jī)磷農(nóng)藥在大米中檢出限為2.94～6.83 μg/kg；加標(biāo)水平為7.5，15和100 μg/kg時(shí)，平均回收率為78.8%～103.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.32%～7.78%。該方法提取效率高，凈化效果好，回收率高，準(zhǔn)確靈敏，可用于大米中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測(cè)工作。