膳食纖維在嬰幼兒配方奶粉中的應(yīng)用及檢測方法研究進(jìn)展

吳裕健，張棟，明雙喜，張紅霞，劉偉，楊穎

1. 山東省食品藥品檢驗研究院（濟南 250101）；

2. 山東省特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心（濟南 250101）

膳食纖維（Dietary Fiber，DF）是一種包含纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、果膠及可溶性多糖等多種成分的混合物，被稱為繼碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、礦物質(zhì)和水之后的“第七大營養(yǎng)素”[1]，具有零能量、防治肥胖、延緩和阻礙葡萄糖在體內(nèi)的吸收、降低血清膽固醇、促進(jìn)腸道有益菌的生長、抑制發(fā)酵有毒產(chǎn)物、通便潤腸、防治腸癌等生理功能[2]。按溶解性，膳食纖維可分為水溶性（SDF）和水不溶性（IDF）兩種，SDF和IDF的生理功能不同，SDF的持水力高、發(fā)酵作用較好，具有降低血脂、促進(jìn)消化道的消化吸收等作用，而IDF可以增加糞便的含水量和體積，促進(jìn)排泄[3]。對嬰幼兒來說，母乳中營養(yǎng)物質(zhì)非常豐富，其中富含的母乳低聚糖（Human milk oligosaccharide，HMOs）起到了維持腸道菌群的平衡，防止便秘以及促進(jìn)腸道營養(yǎng)素吸收的作用[4]。然而，受多種因素的影響，我國純母乳喂養(yǎng)的嬰兒只占總數(shù)的27%[5]，因此，嬰幼兒配方奶粉就成為必不可少的母乳替代品，為了模擬母乳中的各種營養(yǎng)成分，促進(jìn)嬰幼兒健康成長，嬰幼兒配方奶粉生產(chǎn)過程中會添加一些營養(yǎng)素，并且添加具有母乳低聚糖生物功能的營養(yǎng)物質(zhì)已成為重點研究方向之一。目前國產(chǎn)嬰幼兒配方奶粉中通常添加低聚果糖（FOS）、低聚半乳糖（GOS）等膳食纖維來模擬母乳低聚糖的作用，基于此，文章對嬰幼兒配方奶粉中的膳食纖維在國內(nèi)的應(yīng)用及檢測方法進(jìn)行論述，以期為嬰幼兒配方奶粉中膳食纖維的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用與檢測提供參考。

1 膳食纖維在國產(chǎn)嬰幼兒配方奶粉中的應(yīng)用

HMOs的最高濃度出現(xiàn)在初乳中，為20～23 g/L，然后下降到成熟奶至12～14 g/L[6]，HMOs組分極其復(fù)雜，迄今為止，已發(fā)現(xiàn)200種HMOs，分離和鑒定了至少157種不同的HMOs結(jié)構(gòu)[7]。動物乳低聚糖不具有HMOs的多樣性，且多數(shù)哺乳動物乳低聚糖屬于酸性低聚糖，中性低聚糖含量較少，與HMOs剛好相反，因此很難從動物乳中大規(guī)模獲取與母乳成分類似的低聚糖[8]，尋找適合嬰兒生長發(fā)育的非乳源低聚糖一直以來為人們所重視。國外嬰兒配方乳粉中通常會加入乳酮糖來模擬HMOs，用以促進(jìn)雙歧桿菌增殖。國內(nèi)關(guān)于乳酮糖在乳粉中的應(yīng)用還比較少，主要是在嬰幼兒配方乳粉中加入水溶性膳食纖維如低聚果糖、低聚半乳糖等，用以模擬HMOs分子大小分布[9]及調(diào)節(jié)腸道菌群、促進(jìn)排便、提高免疫、減少感染、緩解過敏及特應(yīng)性皮炎的作用[10]。GB 14880—2012《食品營養(yǎng)強化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[11]（以下簡稱GB 14880）表C.2中規(guī)定可在嬰幼兒配方奶粉中添加的膳食纖維共5種，包括低聚果糖（菊苣來源）（FOS）、低聚半乳糖（乳糖來源）（GOS）、多聚果糖（菊苣來源）、棉子糖（甜菜來源）和聚葡萄糖，前四種要求單獨或混合使用，該類物質(zhì)總量不超過64.5 g/kg，而聚葡萄糖要求15.6～31.25 g/kg。文章收集不同品牌不同配方的國產(chǎn)嬰幼兒配方奶粉198批次作為研究對象，共涵蓋66個品牌的嬰兒、較大嬰兒和幼兒配方奶粉，地區(qū)覆蓋我國山東、陜西、黑龍江等16個省，通過研究標(biāo)簽發(fā)現(xiàn)，198批次中共有159批次添加了膳食纖維，其中無添加的產(chǎn)品僅占19.5%，GOS和FOS的組合添加占比50%，位列第一，其次是單獨FOS添加，占比18%，單獨添加多聚果糖、聚葡萄糖都較少，占比1.5%，棉子糖在成品中均未添加（見表1）。從表1中可以看出，膳食纖維的總添加量低于GB 14880的要求或在GB 14880要求的下限，但接近于HMOs的含量，企業(yè)在生產(chǎn)中均最大限度模擬HMOs功能，但HMOs功能復(fù)雜，添加多少能真正起到模擬母乳低聚糖的作用尚值得探討。

表1 嬰幼兒配方奶粉膳食纖維的添加情況

2 我國嬰幼兒配方奶粉中膳食纖維的國標(biāo)檢測方法

目前，我國檢測膳食纖維的標(biāo)準(zhǔn)主要有GB 5009.88—2014[12]和GB/T 22224—2008[13]，以上兩種方法均不能測定低聚糖的含量。若單一添加低聚果糖、多聚果糖，采用GB 5009.255—2016[14]。添加聚葡萄糖，采用GB 5009.245—2016[15]。添加低聚半乳糖目前沒有相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)，每個檢測機構(gòu)采用各自內(nèi)部方法進(jìn)行檢驗，因企業(yè)未添加棉子糖文章未討論。

2.1 國標(biāo)中總膳食纖維的測定

2.1.1 GB 5009.88—2014[12]

GB 5009.88—2014適用于所有植物性食品及其制品中總的（TDF）、可溶性（SDF）和不溶性（IDF）膳食纖維的測定，但不包括低聚果糖、低聚半乳糖、聚葡萄糖、抗性麥芽糊精、抗性淀粉等膳食纖維組分，原理是用酶解消化的方法去除蛋白質(zhì)和可消化的淀粉。TDF是先將樣品分別加入三種不同的酶進(jìn)行酶解，并加入乙醇沉淀1 h，再抽濾得到殘渣，分別用乙醇和丙酮洗滌殘渣，烘干稱重。IDF和SDF則是樣品酶解后抽濾得到濾液和殘渣，經(jīng)熱水沖洗殘渣，干燥稱重得IDF，濾液用乙醇沉淀后抽濾洗滌干燥稱重校正得SDF，這三種含量的校正是通過蛋白質(zhì)質(zhì)量、灰分質(zhì)量和試劑空白來進(jìn)行的，該方法對添加了低聚糖的嬰幼兒配方奶粉不能進(jìn)行有效的全面檢測。2021年7月15日，國家衛(wèi)生健康委員會委托中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與健康所和北京市營養(yǎng)源研究所對GB 5009.88—2014[12]的修訂通過了專家審查，此次修訂對現(xiàn)行方法中酶重量法的試樣前處理條件進(jìn)行了調(diào)整，調(diào)整了酶解體系，將標(biāo)準(zhǔn)適用范圍擴大到植物性食品及其制品以及添加了膳食纖維組分的各類食品的測定，并增加了酶重量-液相色譜法，使方法盡可能覆蓋符合膳食纖維定義及允許添加的組分，彌補了現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)檢測方法適用基質(zhì)范圍窄、檢測組分種類少的不足。

2.1.2 GB/T 22224—2008[13]

GB/T 22224—2008中第二法酶重量法-液相色譜法有效，第一法已被GB 5009.88替代，該方法僅適用于含有抗性麥芽糊精的食品中總膳食纖維的測定。原理是先采用酶重量法測定IDF和高分子質(zhì)量SDF的總含量，然后用高效液相色譜法測定試樣中的低分子質(zhì)量抗性麥芽糊精的含量，最后加和計算出總膳食纖維的含量，與其他方法相比，該方法需要更長的時間，同時對實驗技能和設(shè)備的要求也更高，但酶重量法-液相色譜法較酶重量法具有較好的重現(xiàn)性。

2.2 國標(biāo)中單一添加低聚果糖、多聚果糖、聚葡萄糖的檢測方法

2.2.1 GB 5009.255—2016[14]

GB 5009.255—2016明確規(guī)定適用于單一添加低聚果糖、多聚果糖的產(chǎn)品的檢測。原理是試樣經(jīng)熱水浸提，樣液中的蔗糖經(jīng)蔗糖酶水解成葡萄糖和果糖，加入硼氫化鈉溶液，將相應(yīng)的糖醇還原，預(yù)估果聚糖含量后加入果聚糖酶使之水解成果糖和葡萄糖，用離子色譜-脈沖安培檢測器檢測果糖質(zhì)量濃度，通過校正系數(shù)折算得到果聚糖的含量。該方法能準(zhǔn)確測定配方乳粉中低聚果糖的含量，但也有前處理復(fù)雜、耗時較長等缺點。另外，果聚糖水解產(chǎn)物都是果糖和葡萄糖，對于非單一添加的果聚糖，由于無法估量平均聚合度，因此該方法不適用。

2.2.2 GB 5009.245—2016[15]

GB 5009.245—2016適用于添加聚葡萄糖的產(chǎn)品的檢測。原理是食品中聚葡萄糖經(jīng)熱水浸提、超濾離心后，濾液經(jīng)酶解去除淀粉、果聚糖等干擾物后，再用離子色譜-脈沖安培檢測器定量測定聚葡萄糖含量。由于檢測方法使用的檢測條件和標(biāo)準(zhǔn)品單一，測定結(jié)果與實際添加量存在一定差異。

3 膳食纖維檢測方法的研究進(jìn)展

目前對于嬰幼兒配方奶粉中允許添加的膳食纖維還缺乏部分檢驗方法，為了保障嬰幼兒的健康，國家衛(wèi)生健康委員會制修訂并發(fā)布了3項嬰幼兒配方食品標(biāo)準(zhǔn)，包含GB 10765—2021[16]、GB 10766—2021[17]和GB 10767—2021[18]，其中明確規(guī)定膳食纖維的含量可按低聚糖和（或）多聚糖的添加量計算，近年來國內(nèi)外對于單一添加或組合添加低聚糖、多聚糖的檢測方法的研究也在不斷地深入，主要有分光光度法[19]、高效液相色譜法（HPLC法）[20,22-26]、離子色譜法（IC法）[27-30]和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS法）[31-33]。文章結(jié)合近年研究動態(tài)，比較膳食纖維測定各方法的特點，以期為開發(fā)出適用性更強、效率及精準(zhǔn)度更高的膳食纖維檢測方法提供參考依據(jù)。

3.1 分光光度法

3.1.1 酶-分光光度法

AOAC 999.03[19]分別采用蔗糖酶、果聚糖酶水解蔗糖和果聚糖，用分光光度法測得水解產(chǎn)物果糖含量，通過折算系數(shù)計算得到果聚糖的含量。由于計算過程中采用的折算系數(shù)，沒有考慮到果聚糖的不同化學(xué)結(jié)構(gòu)形式，檢測結(jié)果有時準(zhǔn)確有時偏低。

3.2 高效液相色譜法（HPLC法）

3.2.1 高效液相色譜-示差檢測法（HPLC-示差檢測法）

鄧偉恒等[20]以 GB/T 23528—2009《低聚果糖》[21]為基礎(chǔ)，通過前處理通過等量加入亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液除去樣品中的蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)，獲得澄清溶液，以乙腈/水（75∶25，V/V）為流動相等度洗脫，利用氨基柱分離，示差檢測器檢測，測定低聚果糖的具體組分蔗果三糖（GF2）、蔗果四糖（GF3）和蔗果五糖（GF4）。該方法前處理簡單快捷、定量準(zhǔn)確，但示差檢測器不能進(jìn)行梯度洗脫，靈敏度低，對于測定含量在1 g/100 g以下的樣品時，結(jié)果偏差較大。

3.2.2 高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法（HPLC-蒸發(fā)光散射檢測法）

張書芬等[22]通過對樣品進(jìn)行酶解法前處理，采用ZORBAX Carbohydrate糖分析專用柱、乙腈-水（85∶15）為流動相、霧化氣流量1.6 mL/min的優(yōu)化條件，建立了一種HPLC-蒸發(fā)光散射檢測法測定低聚果糖的方法，該方法回收率為86.7%～105.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，使用的儀器設(shè)備價格低廉、屬于實驗室基本配置，因此有較大的實際應(yīng)用和推廣價值。

張麗等[23]建立了一種檢測乳粉中低聚果糖和低聚半乳糖的HPLC-蒸發(fā)光散射檢測法，方法采用水和乙腈為流動相梯度洗脫，糖柱分離后蒸發(fā)光散射檢測器檢測，經(jīng)過優(yōu)化，確認(rèn)最佳試驗條件：乙腈為沉淀劑，酶解pH 6.0，酶解溫度25 ℃，酶解時間 50 min。該方法回收率為92.52%～106.00%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5.12%。該方法前處理未對乳糖進(jìn)行預(yù)處理，當(dāng)樣品乳糖含量較高時，酶解產(chǎn)生的半乳糖也較高，對低聚半乳糖的結(jié)果會產(chǎn)生較大的影響，所以該檢測方法要求乳粉中的乳糖含量不能過高，適用于乳糖和低聚半乳糖的含量比值小于8的樣品中低聚果糖和低聚半乳糖的檢測。

Zhang等[24]建立了HPLC-蒸發(fā)光散射法測定嬰兒奶粉中的低聚半乳糖的方法，該方法采用酰胺柱，以乙腈與水（83∶17，V/V）為流動相，通過減少進(jìn)樣量，差向異構(gòu)體峰分辨率優(yōu)化，將GOS的峰分辨率從4.0提高到8.0，GOS的線性關(guān)系幾乎不受葡萄糖含量高的影響。該方法具有良好的線性和穩(wěn)定性，回收率為90.5%～105.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.72%～5.81%，該方法靈敏度高、準(zhǔn)確度高、樣品制備方便，消除復(fù)雜基質(zhì)干擾，解決了樣品中高乳糖的干擾，符合嬰兒配方奶粉中高GOS含量定量分析的法定限值要求。

3.2.3 高效液相色譜熒光檢測法（HPLC-熒光檢測法）

林慧等[25]建立了一種柱前衍生HPLC-熒光檢測法測定低聚半乳糖含量的分析方法。樣品用2-氨基苯甲酰胺衍生后，經(jīng)色譜柱分離，用髙效液相色譜-熒光檢測器檢測，外標(biāo)峰加和分段法定量。方法回收率為85.9%～103.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，解決了嬰幼兒配方乳粉中高含量乳糖對低聚半乳糖測定的干擾問題。

Cuany等[26]建立了一種HPLC-熒光檢測法測定嬰配中GOS的方法，該方法取稀釋樣品的兩等分試樣，一份用淀粉葡萄糖苷酶處理，以水解試樣中所有的麥芽低聚糖，另一份用β-半乳糖苷酶處理，以水解試樣中所有的GOS，將內(nèi)標(biāo)物（昆布三糖）添加到兩份等分試樣中，并用2-氨基苯甲酰胺熒光標(biāo)記低聚糖，用乙腈中的甲酸銨水溶液梯度分離分析物，用高效液相色譜-熒光檢測器檢測，兩次測量之間測定的低聚糖的差值即是樣品的GOS含量。該方法回收率為91.5%～102%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.7%～5.99%，適用于高乳糖含量的嬰配產(chǎn)品。

3.3 離子色譜法（IC法）

白靖等[27]建立了果糖酶水解后采用IC法測定乳粉中多聚果糖的方法，緩沖鹽體系優(yōu)選醋酸緩沖液，加入果聚酶，酶解溫度選定60 ℃，酶解時間優(yōu)化至1 h，使多聚果糖全部酶解為果糖，然后用IC法分別測定樣品酶解前后果糖及蔗糖的含量，計算得到多聚果糖的含量，對含麥芽糊精的樣品需加入葡聚酶水解成葡萄糖，解決濾液渾濁和過濾不暢的問題，方法平均回收率為97.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差3.56%。該方法樣品前處理簡單、重復(fù)性好、靈敏度高。

朱偉等[28]建立了一種同時測定嬰幼兒配方乳粉中低聚果糖、低聚半乳糖的IC法檢測技術(shù)，優(yōu)選CarboPac PA20色譜柱分離，采用氫氧化鈉和乙酸鈉溶液進(jìn)行梯度洗脫。該方法功能性低聚糖能得到很好分離，回收率為80.0%～103%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3%。

冉丹等[29]建立以電化學(xué)脈沖安培-IC法檢測嬰幼兒配方乳粉中低聚半乳糖含量的方法。采用離子色譜法檢測經(jīng)β-半乳糖苷酶酶解的原料糖漿試樣中低聚半乳糖含量，再以測得低聚半乳糖含量的同批次原料糖漿作為對照，檢測嬰幼兒配方乳粉中低聚半乳糖含量。該方法線性關(guān)系良好，準(zhǔn)確度較高，加標(biāo)回收率為87.7%～92.4%，SRSD為3.5%，為高乳糖含量產(chǎn)品中GOS檢測提供了新思路。

張志國等[30]建立了指紋圖譜法測定嬰幼兒配方乳粉中低聚半乳糖含量的方法，利用離子色譜構(gòu)建低聚半乳糖指紋圖譜，分析得到特征組分，進(jìn)而測定嬰幼兒配方乳粉中低聚半乳糖含量，該方法回收率為94.0%～106.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差1.2%～2.8%。樣品前處理簡便快速，定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性良好，不需購買復(fù)雜的標(biāo)準(zhǔn)樣品，解決了不同企業(yè)生產(chǎn)的低聚半乳糖組分復(fù)雜不易檢測的技術(shù)難題。

3.4 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS法）

甄振鵬等[31]建立了乳粉中低聚果糖的LC-MS檢測方法，乙醇與水以7∶3的比例提取凈化樣品，離心移取上清液，采用XBridge Amide色譜柱，二級串聯(lián)質(zhì)譜檢測器，負(fù)離子模式進(jìn)行檢測，該方法前處理簡單、快速，靈敏度、準(zhǔn)確度高。

劉蕓等[32]建立了LC-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法測定奶粉中低聚果糖的方法，乳粉樣品用水溶解后，加乙酸鋅沉淀蛋白，離心過濾后，采用Carbohyduate色譜柱進(jìn)行分離，以乙腈與0.1%甲酸水溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫，正離子掃描模式，該方法前處理過程簡便，分析時間短，能很好排除樣品中的基質(zhì)干擾，測定結(jié)果準(zhǔn)確。

甄振鵬等[33]還建立了LC-MS法測定乳粉中的低聚半乳糖，同樣采用XBridge Amide色譜柱，流動相采用乙腈水溶液進(jìn)行洗脫，電噴霧質(zhì)譜負(fù)離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）檢測，該方法靈敏度高、定量準(zhǔn)確，可以實現(xiàn)批量化檢測，能有效提高工作效率、降低分析成本。

4 結(jié)語

膳食纖維在我國嬰幼兒配方奶粉的應(yīng)用尚在探索中，企業(yè)在生產(chǎn)中均最大限度模擬HMOs功能，但HMOs功能復(fù)雜，國內(nèi)外研究還不完善，HMOs結(jié)構(gòu)及組成、功能替代營養(yǎng)源以及膳食纖維的添加種類、添加量、添加方式等都需進(jìn)行深入研究。隨著研究成果的不斷積累，建議在今后標(biāo)準(zhǔn)修訂中及時補充嬰幼兒配方奶粉中膳食纖維的添加種類、添加量等相關(guān)參數(shù)，方便指導(dǎo)和改進(jìn)嬰幼兒配方奶粉的生產(chǎn)。目前膳食纖維的國標(biāo)檢測方法的修訂工作已審查通過，正處在向社會征求意見階段，修訂稿調(diào)整了酶解體系，并增加了酶重量-液相色譜法，彌補了現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)檢測方法適用基質(zhì)范圍窄、檢測組分種類少的不足。相信隨著研究的深入發(fā)展和新國標(biāo)的發(fā)布實施，膳食纖維在嬰幼兒配方奶粉的生產(chǎn)中應(yīng)用和檢測技術(shù)能得到更高效、更完善的發(fā)展，從而進(jìn)一步促進(jìn)嬰幼兒配方奶粉產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展。