金雀花對高血脂小鼠降脂作用

高慶鵬，侯亞婷，畢曉艷，劉福沖，劉平果，袁芝瓊

大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院（大理 671000）

線葉金雀花（AspaLathus linears）的可食部分，為南非豆科植物[Aspalathus linearis（Brum.f.）R.Dahlgren]的葉子和細莖[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，線葉金雀花含有豐富的茶多酚及類黃酮成分，植物衍生的多酚類物質(zhì)可阻止肥胖和相關(guān)脂質(zhì)代謝性疾病的發(fā)病，具有降低血脂的功能[2]。

高血脂癥（hyperLipemia，HLP），是一種脂質(zhì)代謝紊亂疾病[3]，易引發(fā)動脈粥樣硬化、糖尿病等疾病。由于金雀花的抗氧化功能好、安全性好及適用于多種慢性疾病的預(yù)防和調(diào)節(jié)而被廣泛關(guān)注，但對于金雀花降低血脂的研究還存在較大空白。隨著對高血脂癥的深入研究，生理生化指標的異常成為醫(yī)學(xué)上高血脂癥的判斷標準[4]。試驗研究3種不同濃度梯度的金雀花對高脂血癥模型小鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C等指標的影響，旨在揭示金雀花對高血脂癥小鼠及不同濃度梯度的暴露途徑對血脂的調(diào)節(jié)作用，并為深入研究金雀花的降血脂功能提供藥理基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選用SPF等級的KM雄性小鼠：許可證號SYXK（滇）K2011-0004，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，體重22～26 g。試驗動物的飼養(yǎng)環(huán)境20±3 ℃，濕度35%～70%，空氣流通，自然光照。在飼養(yǎng)過程中每天給予5 g/10 g小鼠普通飼料，每天更換飲水，每隔1 d更換墊料，定期消毒。

1.2 試驗材料

新鮮金雀花（產(chǎn)地云南大理）；食用豬油（產(chǎn)地浙江溫州）。

1.3 試劑與儀器

99%膽固醇、亞硝酸鈉（上海麥克林生化科技有限公司）；3號膽鹽、98%丙基硫氧嘧啶、丙二醇、無水乙醇、95%蘆丁、沒食子酸分析標準品、生理鹽水（上海源葉生物科技有限公司）；吐溫-80（上海百舜生物科技有限公司）；75%乙醇（云南昆明天亙消毒制品有限公司）；無水碳酸鈉、硝酸鋁九水合物（上海羅恩化學(xué)技術(shù)有限公司）；氫氧化鈉（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；福林標準液（海標科技有限公司）。

0.22 μm無菌濾頭（Biosharp）；洪達醫(yī)用注射器（廣州平民藥業(yè)連鎖有限公司）；RE-3000旋蒸蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；0412-1離心機[上海醫(yī)療器械（集團）有限公司]；723N可見分光光度計（悅豐儀器儀表有限公司）；JY5002電子天秤（上海衡平儀器儀表廠）；SK8210HP超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；SHZ-DⅢ循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀有限責(zé)任公司）；MJ-54A高壓蒸汽滅菌鍋[旋都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司]；DZG-303A普力菲爾超純水儀（上海富詩特儀器設(shè)備有限公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 多酚標準曲線的繪制

根據(jù)文獻[5]，在760 nm吸收波長處，以試劑空白為參比測定吸光度，吸光度為y軸，沒食子酸質(zhì)量濃度（μg/mL）為x坐標，繪制標準曲線?；貧w方程式為y=45.893x-0.037 6，R2=0.980 3，線性關(guān)系良好。

配制多酚標準曲線測試溶液：準確稱取0.005 g沒食子酸標準樣品，用蒸餾水溶解，定容至50 mL，得到0.1 mg/mL沒食子酸標準溶液。取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0和1.2 mL標準溶液，加入0.5 mL福林試劑，充分搖勻，等待1 min，加入1.5 mL 20% Na2CO3溶液，在75 ℃下反應(yīng)10 min。

1.4.2 總黃酮標準曲線的繪制

根據(jù)文獻[6]，在510 nm吸收波長處，以試劑空白為參比測吸光度，以吸光度為y軸，蘆丁質(zhì)量濃度（mg/mL）為x坐標，繪制標準曲線。回歸方程式為y=13.043x-0.014 6，R2=0.993 5，線性關(guān)系良好。

配制總黃酮標準曲線測試溶液：準確稱取0.01 g蘆丁，75%乙醇溶解，并定容至50 mL→0.2 mg/mL蘆丁標準溶液→取標準溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5和4.0 mL→加入0.5 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置5 min→加入0.5 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，放置5 min→加入5 mL 4%氫氧化鈉溶液，用75%乙醇定容至10 mL，搖勻，放置10 min。

1.4.3 樣品的測定

稱取80 g金雀花，按照一定的比例分別用乙醇溶液和水溶液浸泡1 h，使用真空抽濾裝置過濾，去渣，取300 mL上層清液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀提取，提取完成后，取出2 mL提取液，分別量取1 mL使用分光光度計按照標準曲線繪制方法進行測定，代入標準曲線方程（y=45.893x-0.037 6和y=13.043x-0.014 6）依次得出樣液中多酚和總黃酮的濃度。試驗結(jié)果均以多酚提取率和總黃酮提取率為考察指標[7]，按式（1）計算。

1.4.4 正交設(shè)計方案

1.4.4.1 乙醇溶液的正交試驗

在乙醇溶液提取過程中，因存在多種單因素影響提取結(jié)果，參考單因素對結(jié)果影響，列出影響較大的單因素：乙醇體積分數(shù)（A）、提取時間（B）、料液比（C）等，分別對各因素進行考察，得出最佳的提取水平，選擇合適的單因素水平進行正交試驗，獲得提取所需成分最佳的工藝。

根據(jù)對乙醇溶液提取法的單因素試驗，得出影響提取結(jié)果的單個因素水平見表1。

表1 正交設(shè)計試驗單因素水平表

1.4.4.2 水溶液正交試驗

在水溶液提取過程中，同樣參考單因素對結(jié)果影響，列出影響較大的單因素：金雀花用量（A）、料液比（B）及提取時間（C），分別對各因素進行考察，得出最佳提取水平，選擇合適的單因素水平進行正交試驗，獲得提取所需成分最佳的工藝。

根據(jù)對水溶液提取法的單因素試驗，得出影響提取結(jié)果的單個因素水平見表2。

表2 正交設(shè)計試驗單因素水平表

1.4.5 高血脂癥模型的建立及分組

根據(jù)文獻[8]，高脂乳劑制作方法：25 g食品級豬油加入100 mL錐形瓶加熱融化，加入15 g膽固醇，攪拌直至溶解，再次加入2 g 3號膽鹽、1 g丙基硫氧嘧啶、20 mL吐溫、20 mL丙二醇。攪拌至充分融合，加入蒸餾水至刻度線，待溫度下降凝固，密封并在4 ℃環(huán)境中保存。每隔2 d制作1次，灌胃前水浴加溫再對小鼠進行灌胃。

第一輪造模，將小鼠隨機分為空白組和高血脂癥組，空白組14只，高血脂癥組62只。空白對照組給予一定質(zhì)量的飼料，自由飲水。高脂血癥組均以0.2 mL/10 g劑量進行灌胃，結(jié)束后給予相應(yīng)質(zhì)量的飼料，自由飲水。高脂乳劑灌胃每日1次，每隔1 d記錄體重，連續(xù)灌胃5周。

造模結(jié)束后，禁食不禁水12 h，選取空白組小鼠6只，高血脂癥組小鼠4只，進行生理指標的數(shù)據(jù)測定，測定其TC、TG、LDL-C、HDL-C、GLU含量，對其數(shù)據(jù)進行SPSS的單因素分析，高血脂癥組所有指標高于空白組，即P＜0.05時，造模成功。

試驗階段，金雀花溶液的最佳提取方法為水溶液提取，每只小鼠的安全灌胃劑量為5 mg/kg。將高血脂癥組小鼠隨機分為5個組：高血脂組、陽性對照組、金雀花提取物（1.165 g/mL）高濃度組、金雀花提取物（0.583 g/mL）中劑量組、金雀花提取物（0.291 g/mL）低劑量組。使用不同濃度梯度的金雀花提取液進行灌胃，每隔1 d記錄體重，連續(xù)灌胃3周。

表3 試驗分組

1.4.6 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)收集采用Excel 2016軟件，金雀花提取結(jié)果采用正交試驗結(jié)果表進行表示，小鼠各組指標均以±s表示。分別使用SPSS 25.0軟件進行正交試驗設(shè)計、單因素方差分析、單因素檢驗，檢驗水平α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗提取結(jié)果

根據(jù)乙醇溶液提取正交設(shè)計方案，結(jié)果見表4和表5。

分析表4可得，可影響金雀花中總黃酮的提取率的因素主次順序為乙醇體積分數(shù)（A）＞料液比（B）＞提取時間（C），金雀花中總黃酮旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀提取最佳工藝條件為A3B1C3，即乙醇體積分數(shù)65%、料液比1∶45（g/mL）、提取時間60 min，在此條件下提取金雀花中的總黃酮提取率最高，為1.48%。

表4 正交試驗乙醇溶液黃酮提取結(jié)果

分析表5可得，影響金雀花中多酚的提取率的因素主次順序為乙醇體積分數(shù)（A）＞提取時間（C）=料液比（B），金雀花中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀提取多酚的最佳工藝條件為A3B3C3，即乙醇體積分數(shù)65%、料液比1∶55（g/mL）、提取時間60 min，在此條件下提取金雀花中的多酚提取率最高，為0.20%。

表5 正交試驗多酚提取結(jié)果

根據(jù)水溶液提取結(jié)果可得，金雀花提取液中多酚和總黃酮的提取率與金雀花用量、提取時間呈正比，與料液比呈反比。由此，金雀花中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀提取最佳工藝條件為金雀花用量100 g、料液比1∶10（g/mL）、提取時間60 min，在此條件下金雀花中的多酚提取率為1.221%，總黃酮提取率為6.996%。

2.2 一般情況

高血脂癥模型建模5周后，選取部分小鼠進行生理指標檢測，對檢測的數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，分析后，高血脂癥造模小鼠的血清總膽固醇F=7.239，甘油三酯F=4.425，高密度脂蛋白F=1.524，低密度脂蛋白F=8.289?？瞻捉M與之相比差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），即高血脂癥模型建造成功（見表6），小鼠體重變化結(jié)果見表7。

表6 部分小鼠的TC、TG、LDL-C水平（±s）單位：mmol/L

表6 部分小鼠的TC、TG、LDL-C水平（±s）單位：mmol/L

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表7 部分小鼠體重（±s）

表7 部分小鼠體重（±s）

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金雀花提取溶液灌胃3周降脂后，空白組、陽性對照組、金雀花組體重與高血脂組體重差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。空白組與陽性對照組、金雀花各濃度組體重變化無差異，不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。小鼠體重變化結(jié)果見表8。

表8 灌胃后小鼠的體重變化（±s）

表8 灌胃后小鼠的體重變化（±s）

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2.3 TC、TG、LDL-C

由表9可知，金雀花各組、陽性對照組經(jīng)方差分析，血清總膽固醇均下降，與高血脂對照組相比，其F值分別為24.02，61.26，20.70和8.23，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。0.583 g/mL金雀花組的總膽固醇水平下降率更高，TC降低水平與其余各金雀花組之間不存在明顯差異，即P＞0.05。

表9 各組小鼠的TC、TG、LDL-C水平（±s）單位：mmol/L

表9 各組小鼠的TC、TG、LDL-C水平（±s）單位：mmol/L

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金雀花各組、陽性對照組經(jīng)方差分析，甘油三酯和LDL-C均下降，與高血脂對照組相比，甘油三酯的F值分別為108.28，110.68，30.12和25.89；LDL-C的F值為168.537，187.711，140.02和99.28。差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），其中0.583 g/mL金雀花組甘油三酯水平、LDL-C水平下降率更高，更接近于陽性對照組，與其余2組金雀花組之間不存在明顯差異，即P＞0.05。

2.4 高密度脂蛋白（HDL-C）

由表10可知，陽性對照組、金雀花各濃度組其HDL-C與高血脂癥對比HDL-C均升高，其F值分別為0.063，1.144 5，0.796，1.017和0.377，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。陽性對照組升高HDL-C效果明顯更優(yōu)，但0.583 g/mL金雀花組效果接近于陽性對照組，說明抗動脈粥樣硬化、預(yù)防冠心病的能力與其余各組相比更強。

表10 各組小鼠的HDL-C水平（±s） 單位：mmol/L

表10 各組小鼠的HDL-C水平（±s） 單位：mmol/L

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2.5 葡萄糖（GLU）

由表11可見，因高脂血癥極易引發(fā)其他并發(fā)癥，如糖尿病[9]，根據(jù)降脂后，金雀花各組與高脂血癥組相比，F(xiàn)值為4.602，0.649和1.444，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，即（P＞0.05）。但陽性對照組與高脂血癥組經(jīng)方差分析，F(xiàn)=3.116，P＜0.05，即差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。提示金雀花各組雖然可使高血脂癥小鼠的葡萄糖水平下降，但是降低效果不如陽性對照組顯著。

表11 各組小鼠的GLU水平（±s） 單位：mmol/L

表11 各組小鼠的GLU水平（±s） 單位：mmol/L

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2.6 小鼠肝臟系數(shù)

表12 各組小鼠的肝臟系數(shù)（±s） 單位：%

表12 各組小鼠的肝臟系數(shù)（±s） 單位：%

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臟器指數(shù)可反映臟器的健康狀況，小鼠長期接觸高脂乳劑，可導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)積累及病變，這一變化可以通過肝臟系數(shù)來反映[10]。從肝臟系數(shù)的分析來看，金雀花各組、陽性對照組與高血脂癥組對比，肝臟系數(shù)顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討論與結(jié)論

試驗表明，金雀花水提物組與高血脂模型組相比，金雀花組顯著地降低高血脂小鼠血清中的TC、TG、LDL-C含量，金雀花水提物酚酸類、黃酮類2種成分有效地影響脂肪的生成和代謝，對于降低血脂具有重要意義。

通過高脂乳劑誘導(dǎo)，高血脂組小鼠的體重、肝臟系數(shù)、葡萄糖與空白組相比顯著上升。在灌胃金雀花水提物后，小鼠的體重與肝臟系數(shù)顯著下降。由此可知，金雀花的作用機理可能在一定程度上逆轉(zhuǎn)了誘導(dǎo)的肝臟損傷，但是葡萄糖的水平雖有顯著下降，但仍未達到正常水平，其原因可能與灌胃試劑的配方、金雀花提取物的濃度有關(guān)，具體原因還有待進一步研究。

試驗進行線葉金雀花的提取，通過正交試驗優(yōu)化乙醇溶液和水溶液提取方案，通過水溶液提取得到最佳提取方案，中濃度組提取物與其余濃度組相比，降低血清中的TC、TG、HDL-C和肝臟系數(shù)更為顯著，更接近陽性對照組與空白組，結(jié)果表明，中濃度組調(diào)節(jié)血脂的作用較為突出。

金雀花作為食品、藥物在調(diào)節(jié)血脂和心血管疾病方面有著可觀的前景，作為降脂藥物具有一定的安全性和優(yōu)越性，在我國的醫(yī)療保健領(lǐng)域有著探索意義，后續(xù)將對金雀花降血脂的作用機理進行進一步研究。