茯苓微粉的粉體特征、多糖含量及抗氧化性研究

丁強，吳嬗嬗，耿璐娜 ，張越, ，王妍妍，陳衛(wèi)東, ,

1. 安徽中醫(yī)藥大學（合肥 230012）；2. 安徽敬道生物科技有限公司（亳州 236814）；3. 直接口服中藥飲片亳州市重點實驗室（亳州 236000）；4. 中藥復(fù)方安徽省重點實驗室（合肥 230012）

茯苓[Poria cocos（Schw.）Wolf]為多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核[1]，主要分布于我國的云南、貴州、湖北、安徽等地[2]，具有利水滲濕、健脾寧心等功效。此外，茯苓作為可食用真菌，其營養(yǎng)價值和藥用價值日益受到關(guān)注?，F(xiàn)代藥理研究表明，茯苓中含有多糖、三萜、甾體、氨基酸等化學成分[3-4]，其中茯苓多糖具有抗腫瘤[5]、免疫調(diào)節(jié)[6]、抗氧化[7-9]等功效。然而，由于茯苓粉水溶性較差，這限制了其新產(chǎn)品的開發(fā)和利用。有研究表明藥材經(jīng)超微粉化處理后能提高其活性成分的溶出率和生物利用率，不僅能增強藥效，提高中藥的臨床應(yīng)用能力，而且能使中藥資源得到更加充分的利用[10-12]。

茯苓超微粉方面的研究較少，主要集中在茯苓超微粉揮發(fā)性成分的研究[13]、茯苓超微粉粉碎工藝的研究[14]等方面，而缺少對茯苓不同粒徑的粉體學性質(zhì)、有效成分含量及藥效活性的考察。因此，試驗采用藥典檢驗篩對茯苓粉末進行過篩分級，得到不同粒徑的茯苓粉末，應(yīng)用激光粒度分析儀對不同粒徑粉末的粒度及其分布進行表征；并對不同粒徑粉末進行粉體學相關(guān)性質(zhì)考察，包括粉末休止角、堆密度、潤濕性；采用苯酚-濃硫酸法測定不同粒徑茯苓粉末中水溶性多糖的含量，考察不同粒徑茯苓粉末的體外抗氧化能力，包括對DPPH·自由基的清除能力和ABTS·自由基的清除能力的考察，選定適宜的茯苓粉末粒徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 茯苓來源

茯苓粉均（批號190107，安徽敬道生物科技有限公司），經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學俞年軍教授鑒定，符合《中華人民共和國藥典（2020年版）》一部各項規(guī)定，為茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf的粉末。

1.1.2 試劑

苯酚（海麥克林生化有限公司）；硫酸（上海捷企化學試劑有限公司）；DPPH（上海源葉生物科技有限公司）；ABTS（合肥博美生物科技有限責任公司）；抗壞血酸（上海潤捷化學試劑有限公司）；抗壞血酸（上海潤捷化學試劑有限公司）；D-無水葡萄糖（中國食品藥品鑒定研究院）；無水乙醇（江蘇強盛功能化學股份有限公司）；甲醇（上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆?/p>

1.1.3 儀器與設(shè)備

多功能酶標儀（Multiskan FC，賽默飛世爾科技有限公司）；1/10萬電子天平（AB135-S，德國梅特勒-托利多儀器有限公司）；激光粒度儀（MS2000，英國馬爾文儀器有限公司）；超聲波清洗儀（AS30600BT，天津奧特塞恩斯儀器有限公司）；紫外可見分光光度計（UV-5100，上海元析儀器有限公司）；純水儀（CascadaⅢ.Ⅰ10純化水系統(tǒng)，頗爾過濾器北京有限公司）；藥典檢驗篩（R40/3系列，紹興市上虞華豐五金儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 茯苓不同粒徑粉末的制備及粒徑測定

將茯苓粉末依次通過孔徑為355 μm（45目），125 μm（120目），75 μm（200目），45 μm（325目）和38 μm（400目）的藥典檢驗篩分級過篩得不同粒徑的粉末。經(jīng)激光粒度儀采用干法測定不同粒徑粉末的體積、面積、比面積平均粒徑大小，測定條件：樣品折射率1.800+0.100i，介質(zhì)折射率1.330，分析模式General purpose。

1.2.2 茯苓不同粒徑粉末的粉體學性質(zhì)考察

1.2.2.1 休止角的測定[15]

采用固定漏斗法測定休止角。取5 g樣品粉末，水平放置繪圖紙并在其上方固定玻璃漏斗，使樣品勻速通過漏斗，自由下落至繪圖紙上，自然堆積成最大直徑圓錐體，測量該圓錐體直徑和高度。重復(fù)上述步驟測定3次，按式（1）計算。

式中：H為圓錐體高度，cm；R為圓錐體直徑，cm。

1.2.2.2 堆密度的測定[15]

采用量筒法測定堆密度。取1個量筒，將樣品粉末勻速通過玻璃漏斗加入量筒，記錄此時粉末體積與量筒總質(zhì)量，重復(fù)上述步驟測定3次，按式（2）計算。

式中：M1為量筒質(zhì)量，g；M2為量筒加樣品粉末的總質(zhì)量，g；V為粉末體積，mL。

1.2.2.3 潤濕性的測定[16]

潤濕性反映的是粉體完全懸浮于水中的時間，在直徑10 cm的培養(yǎng)皿中，加入50 mL水，加入0.1 g樣品粉末，記錄粉末被水完全潤濕的時間，重復(fù)上述步驟測定3次，參考結(jié)果進行不同粒徑茯苓樣品粉末的潤濕性比較。

1.2.2.4 水分測定[1]

按照《中華人民共和國藥典（2020年版）》四部中0832水分測定法中第二法烘干法對茯苓不同粒徑粉末進行水分測定，計算各茯苓樣品中含水量。

1.2.3 茯苓不同粒徑粉末水溶性總多糖含量測定

1.2.3.1 溶液的制備

試驗采用苯酚-濃硫酸法測定茯苓水溶性總多糖含量，按照前期試驗方法[17]制備葡萄糖對照品溶液、茯苓供試品溶液、苯酚試劑。對照品溶液的制備：稱取葡10.00 mg萄糖標準品，用蒸餾水溶解并定容至100 mL，即得0.1 mg/mL的葡萄糖對照品溶液；供試品溶液的制備：取具塞錐形瓶，各加入1.0 g茯苓不同粒徑的粉末，按料液比1∶50（g/mL）加入超純水，在超聲功率100 W、超聲溫度25 ℃的條件下超聲30 min后過濾，收取濾液，并取1.0 mL續(xù)濾液，稀釋100倍，現(xiàn)配現(xiàn)用；苯酚試劑的制備：稱取8.00 g苯酚，溶解于100 mL純水中，得到8%的苯酚溶液。

1.2.3.2 方法學考察

按照前期方法[17]建立葡萄糖標準曲線，并開展方法學考察，包括精密度考察、重復(fù)性考察、穩(wěn)定性考察及加樣回收率考察。葡萄糖標準曲線的建立：分別精密吸取0.1，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL葡萄糖標準品溶液于試管中，加入超純水至1.0 mL，精密加入1 mL 8%苯酚溶液和4 mL濃硫酸，沸水浴30 min后冷水浴10 min，搖勻，在490 nm處測定其吸光度。

1.2.3.3 茯苓樣品溶液水溶性多糖含量測定

取不同粒徑的茯苓粉末，各6份，按照供試品溶液的制備方法制備待測的樣品，精密吸取1.0 mL待測樣品溶液，按苯酚-濃硫酸法進行顯色，在490 nm波長下測定吸光度，并計算茯苓不同粒徑的粉末水溶性多糖的含量。

1.2.4 茯苓不同粒徑粉末體外抗氧化活性測定

按照1.2.3.1的供試品溶液制備方法制備茯苓不同粒徑的粉末的水溶性，考察不同粒徑粉末溶液的清除DPPH·自由基和ABTS·自由基的能力。

1.2.4.1 DPPH·自由基清除能力的測定

參照文獻及前期方法[18-19]，并稍作修改。測量茯苓不同粒徑粉末樣品的DPPH·自由基清除率。用無水乙醇配制0.2 mmol/L的DPPH·溶液，冷暗處保存?zhèn)溆?。?.5 mL不同粒徑的茯苓樣品溶液與0.5 mL的DPPH溶液充分混勻后，常溫暗處靜置30 min，在517 nm處測定吸光度。重復(fù)上述步驟測定3次，按式（3）計算：

式中：A0為DPPH乙醇溶液的吸光度；A1為樣品和DPPH乙醇溶液的吸光度；A2為樣品溶液的吸光度。

1.2.4.2 ABTS·自由基清除能力的測定

參照文獻及前期方法[19-20]，并稍作修改。測量茯苓不同粒徑粉末樣品的ABTS·自由基清除率。將2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液和7 mmol/L ABTS溶液等體積混合后常溫避光反應(yīng)14 h后制得ABTS陽離子儲備液。稀釋ABTS陽離子儲備液使其在734 nm的吸光度為0.700±0.020，即得ABTS陽離子溶液。取0.5 mL不同粒徑的茯苓樣品溶液與2.5 mL的ABTS陽離子溶液充分混勻后，常溫暗處靜置10 min，在734 nm處測定吸光度。重復(fù)上述步驟測定3次，按式（4）計算：

式中：A0為ABTS溶液的吸光度；A1為樣品和ABTS溶液的吸光度；A2為樣品溶液的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 茯苓不同粒徑粉末的制備

如表1所示：茯苓粉末依次通過孔徑為355 μm（45目），125 μm（120目），75 μm（200目），45 μm（325目）和38 μm（400目）的藥典檢驗篩過篩，得到5種不同粒徑的茯苓粉末，依次命名為粗粉、細粉、微粉Ⅰ、微粉Ⅱ、微粉Ⅲ。隨著目數(shù)的增加，茯苓粉末的顏色逐漸由米白色偏向白色。

表1 茯苓5種不同粒徑的粉末

2.2 茯苓不同粒徑粉末粒徑測定及其分布

激光粒度儀測定茯苓粒徑分布結(jié)果如表2所示，與粗粉相比，茯苓微粉的D50由131.77 μm降低到28.09 μm，D90由247.32 μm下降到66.30 μm；茯苓不同目數(shù)粉體的體積平均粒徑隨粉體所過的目數(shù)增加而降低，與粗粉相比，茯苓微粉的體積平均粒徑由139.12 μm降低至32.44 μm。5種茯苓粉末中，微粉Ⅲ的表面積平均粒徑、體積平均粒徑、D10、D50和D90均最低，比表面積最大。如圖1所示，通過粒度分布測定，單峰模式下粗粉、細粉、微粉Ⅰ、微粉Ⅱ、微粉Ⅲ粒度分布均呈正態(tài)分布。

圖1 茯苓不同目數(shù)粉體粒徑分布圖

2.3 茯苓不同粒徑粉末的粉體學性質(zhì)

粉體學性質(zhì)是影響中藥制劑生產(chǎn)過程的重要因素。休止角是評價粉體流動性的一個重要因素，也是衡量粉體黏著性的一個間接指標，粉末粒徑減小，粉體表面粗糙，黏著性增大，則休止角也越大[21]。如表3所示，隨著茯苓粉末粒徑的減小，其休止角呈現(xiàn)增大趨勢，粉體休止角由粗粉的27.68°增大至微粉Ⅲ的43.88°。堆密度也與粉末的流動性和黏著性有一定關(guān)系，粉末粒徑減小，粉體間摩擦力增大，妨礙粉體堆積，流動性差[22]。如表3所示，隨著茯苓粉末粒徑的減小，其堆密度呈現(xiàn)減小趨勢，粉體堆密度由粗粉的0.68 g/mL減小至微粉Ⅲ的0.32 g/mL。休止角和堆密度結(jié)果表明隨著茯苓粉末粒徑的減小，粉末流動性逐漸變差，微粉Ⅲ的流動性最差。潤濕性是與固體制劑溶解性和崩解性有關(guān)的重要的物理性質(zhì)，也是評價粉體加工性能的一個重要指標。在平行條件下，粉末完全潤濕所需時間越短，則對應(yīng)粉末的潤濕性越好，而潤濕性越好的粉末，加工性能越好，相關(guān)成分越易被人體吸收[23]。如表3所示，試驗結(jié)果表明粗粉和細粉的完全潤濕時間分別48 h和45 h，微粉Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的完全潤濕時間為分別為27，24和23 h，微粉的潤濕性要強于粗粉和細粉，這也表明微粉擁有更好的速溶性。此外，經(jīng)過測定，5種粒徑茯苓粉末的水分均小于18.0%，符合《中華人民共和國藥典（2020年版）》標準[1]，表明即使茯苓達到微粉狀態(tài)，其吸濕性并未增加，不易發(fā)霉、變質(zhì)，儲存條不需要進一步嚴格。

表3 茯苓不同粒徑粉末的粉體學性質(zhì)

2.4 茯苓不同粒徑粉末水溶性總多糖含量

以濃度（C）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線，進行線性回歸，回歸方程為A=12.646C-0.026 2（線性范圍0.01～0.1 mg/mL，r2=0.994 8）。儀器精密度SRSD為0.31%，表明精密度良好。重復(fù)性試驗中，SRSD為0.28%，表明該方法重復(fù)性良好。樣品穩(wěn)定性試驗中，SRSD為0.79%，表明該樣品穩(wěn)定性良好。加樣回收率試驗中，平均加樣回收率為97.40%，SRSD為1.96%，表明該試驗準確度高。由圖2可知，在355 μm（45目，粗粉）～ 45 μm（325目，微粉Ⅱ）范圍內(nèi)，茯苓粉末水溶性總多糖含量隨粉末粒徑減少而穩(wěn)步增加，而到38 μm（400目，微粉Ⅲ）時含量則不再增加，微粉Ⅱ的水溶性總多糖含量提取率最高，提示茯苓粉末粉碎到一定程度后，提取的有效成分水溶性總多糖的含量則趨于穩(wěn)定，這也與文獻報道的黃柏有效成分含量隨目數(shù)變化的結(jié)果基本相一致[24]。

圖2 茯苓不同粒徑粉末水溶性多糖含量

2.5 茯苓不同粒徑粉末體外抗氧化活性

由表4可知：茯苓5種不同粒徑粉末水溶液均有一定的抗DPPH·自由基和ASBT·自由基能力，在355 μm（45目，粗粉）～ 45 μm（325目，微粉Ⅱ）范圍內(nèi)，茯苓粉末水溶性抗DPPH·自由基和ASBT·自由基能力隨粉末粒徑減少而穩(wěn)步增加，而到38 μm（400目，微粉Ⅲ）時，抗DPPH·自由基和ASBT·自由基能力則不再增加，微粉Ⅱ的抗DPPH·自由基和ASBT·自由基能力，提示茯苓粉末粉碎到一定程度后，提取的有效成分水溶性總多糖的含量則趨于穩(wěn)定。此外，茯苓5種不同粒徑粉末水溶液的抗DPPH·自由基和ASBT·自由基能力與茯苓水溶性總多糖含量呈現(xiàn)同樣的變化趨勢，間接表明茯苓水溶性總多糖含量具有一定的抗DPPH·自由基和ASBT·自由基能力，可能是茯苓發(fā)揮抗氧化活性的主要成分，這也與前期的試驗結(jié)果[19]及文獻[25]報道的茯苓水溶性多糖具有顯著的抗氧化能力結(jié)果相一致。

表4 茯苓不同粒徑粉末體外抗氧化活性

3 結(jié)論

通過將茯苓粉碎后依次經(jīng)過孔徑為355 μm（45目），125 μm（120目），75 μm（200目），45 μm（325目）和38 μm（400目）的藥典檢驗篩過篩分級，分別得到粗粉、細粉、微粉Ⅰ、微粉Ⅱ、微粉Ⅲ這5種不同粒徑的茯苓粉末。粒徑分布結(jié)果表明：不同粒徑粉末的粒徑大小隨目數(shù)增加而降低，微粉Ⅲ的粒徑最??；隨著茯苓粉末粒徑減小，粉體流動性逐漸降低，粗粉＞細分＞微粉Ⅰ＞微粉Ⅱ＞微粉Ⅲ；潤濕性逐漸增加，粗粉＜細分＜微粉Ⅰ＜微粉Ⅱ＜微粉Ⅲ；茯苓水溶性總多糖提取率，粗粉＜細分＜微粉Ⅰ＜微粉Ⅱ≈微粉Ⅲ；茯苓水溶液抗DPPH·自由基和ASBT·自由基能力，粗粉＜細分＜微粉Ⅰ＜微粉Ⅱ≈微粉Ⅲ。粉體越細流動性越差，越不利于制劑生產(chǎn)；粉體潤濕性越好，加工性能越好，相關(guān)成分越易被人體吸收。因此，綜合中醫(yī)臨床用藥和制藥企業(yè)用藥的實際情況，建議茯苓飲片粉碎時粉體過45 μm（325目，微粉Ⅱ）較為適宜?；谇捌陂_展茯苓多糖在人工胃液、腸液中的降解及其在體腸吸收研究[26]，后續(xù)可利用所建立的試驗方法考察茯苓不同粒徑粉末在胃腸中的吸收情況是否有差異，以進一步明確茯苓微粉的粉體優(yōu)勢。試驗結(jié)果為茯苓破壁口服飲片或其他新型茯苓藥品、功能性食品等開發(fā)提供技術(shù)支撐。