滇藏杜英總酚提取方法的篩選

田素梅，李兆云，馬艷粉

德宏師范高等專科學校（芒市 678400）

酚類化合物廣泛存在于植物果實中，是植物次生代謝產(chǎn)物，具有抗氧化、殺菌、清除自由基、消炎多種生物活性，在預防心腦血管、癌癥以及衰老方面有著十分重要的作用[1-2]，因此受到廣泛的關(guān)注。滇藏杜英（Elaeocarpus braceanus）為杜英科杜英樹植物，是高5～15 m的喬木，在我國主要分布在云南和西藏[3]。其果實是云南當?shù)厝嗣裣矚g的一種野生果品，具有生津止渴和清熱解毒的功效[4]。已有的研究表明滇藏杜英果實糖含量中等或偏低，脂肪和蛋白質(zhì)含量高，維生素C和B2含量較豐富，另外還含有較多的其他化合物，是一種有開發(fā)利用價值的野生果品[4-6]。目前，對滇藏杜英總酚的研究尚未見報道，研究擬應用三種方法對滇藏杜英的總酚進行提取，以期探索出較好的提取方法，旨在為其總酚提取提供科學的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗原料與主要試劑

1.1.1 試驗原料

市售滇藏杜英來源于云南省傣族景頗族自治州隴川縣及周邊。

1.1.2 主要試劑

沒食子酸標準品（北京索萊寶科技有限公司）；無水乙醇（成都市科隆化學品有限公司）；福林酚（北京索萊寶科技有限公司）；無水碳酸鈉（廣東省化學試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心）；以上試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設備

JA2003電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；SB-5200超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；722S可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；分樣篩（0.425 mm，浙江省上虞市道墟化驗儀器設備廠）；微孔濾膜（海鹽新東方塑化科技有限公司）；XY-350高速多功能粉碎機（浙江省永康市松青五金廠）；SMART-N超純水機（上海市力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；202-1電熱恒溫干燥箱（上海市崇明實驗儀器廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料處理

將采集到的滇藏杜英清洗干凈，自然通風曬干，然后用高速多功能粉碎機將滇藏杜英粉碎成末，過0.425 mm篩子，濾渣再粉碎過篩，收集粉末置于室溫下密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 標準曲線的繪制

準確稱取0.010 0 g沒食子酸標準品，加雙蒸水定容至100 mL，即得沒食子酸標準品溶液（每毫升含無水沒食子酸100 μg）。分別吸取0，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL上述標準品溶液于25 mL刻度管內(nèi)，每個試管內(nèi)分別加入0.5 mL的福林試劑，搖勻，反應3～8 min后加入4.00 mL 7.5%碳酸鈉，用雙蒸餾水定容至刻度線，搖勻。室溫放置60 min，在波長765 nm條件下測定吸光度，重復3次，取其平均值，以吸光度為縱坐標（Y），標準品沒食子酸的質(zhì)量為橫坐標（X），繪制標準曲線。

1.3.3 試驗方案設計

1.3.3.1 乙醇浸漬法

已有的研究表明料液比，乙醇體積分數(shù)，提取次數(shù)是影響總酚提取的三個重要因素[7-8]。前期已進行單因素試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)料液比在1∶30～1∶50（g/mL）總酚提取率較高，乙醇體積分數(shù)在60%～80%范圍內(nèi)總酚提取率較高，提取次數(shù)1～3次總酚提取率較高。在此基礎上以總酚提取量作為評價指標，采用L9(34)正交表，進行正交試驗，各因素水平設計方法見表1。

表1 乙醇浸漬法正交試驗因素水平表

準確稱取1 g粉碎后的滇藏杜英，分別放入250 mL燒杯內(nèi)，按照不同料液比加入不同體積分數(shù)乙醇溶液，提取不同次數(shù)，靜置提取完成后過濾濃縮，濾液定容到100 mL，于4 ℃密封、避光保存?zhèn)溆?。分別用移液管移取1 mL各待測提取液于25 mL刻度管內(nèi)，按照1.3.2小節(jié)方法進行測定，并根據(jù)標準曲線計算出各組待測試樣中總黃酮總酚含量，再根據(jù)式（1）計算出樣品中總酚含量（%）。

式中：m1為依據(jù)標準曲線計算出被測液中總酚含量，μg；m為供試品取樣量，g；V1為待測液分取的體積，mL；V2為待測液的總體積，mL；100為單位換算系數(shù)。

1.3.3.2 回流提取法

根據(jù)已有的研究將料液比、提取時間、提取溫度設為回流提取法提取總酚的三個重要影響因素[9]。前期單因素試驗表明料液比范圍在1∶30～1∶50（g/mL）總酚提取率較高，回流1～2 h總酚提取率較高，提取溫度為90～100 ℃提取率較高。在此基礎上采用L9(34)正交表，進行正交試驗，各因素水平設計方法見表2。

表2 回流提取法正交試驗因素水平表

稱取保存?zhèn)溆玫牡岵囟庞⒎勰└? g，分別放入250 mL圓底燒瓶內(nèi)，加入95%乙醇溶液，放在水浴鍋裝置上，提取完成后過濾濃縮，濾液定容到100 mL，于4 ℃密封、避光保存?zhèn)溆?。分光光度計測定方法同上。

1.3.3.3 超聲波提取法

根據(jù)試驗前期已做的單因素試驗，單因素試驗表明料液比范圍在1∶20～1∶40（g/mL）總酚提取率較高，超聲提取溫度20～40 ℃總酚提取率較高，提取次數(shù)1～3次提取率較高。故此次試驗選用提取溫度、料液比及提取時間作為試驗因素，每個因素設三個水平，采用L9(34)正交表，進行正交試驗，各因素水平設計方法見表3。

表3 超聲波提取法正交試驗因素水平表

稱取保存?zhèn)溆玫牡岵囟庞⒎勰└? g，分別放入250 mL錐形瓶內(nèi)，加入95%乙醇溶液，放入超聲波清洗裝置中，設置參數(shù)：電流1.0 A、頻率40 kHz、提取完成后過濾濃縮，濾液定容到100 mL，于4 ℃密封、避光保存?zhèn)溆?。分光光度計測定方法同上。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用 Excel進行數(shù)據(jù)整理及制表繪圖，采用IBM SPSS 24法進行方差分析與多重比較。利用模糊數(shù)學中的模糊隸屬函數(shù)法對三種提取方法總酚提取率進行模糊綜合評價，篩選出提取率最佳的方法。隸屬函數(shù)的計算公式見式（2）和（3）。

式中：Xij為第i種提取方法的第j個處理的總酚提取率；Xjmax和Xjmin分別為所有處理總酚提取率的最大值和最小值；n為每種提取方法的處理總數(shù)；U為每提取方法n個處理的隸屬度平均值。隸屬度平均值越大，表示該提取方法效果越好。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸標準曲線

以吸光度為橫坐標，沒食子酸質(zhì)量為縱坐標，繪制標準曲線（圖1）。 所得標準曲線的線性回歸方程為y=2.989x+0.049（R2=0.994）。

圖1 沒食子酸標準曲線

2.2 正交試驗結(jié)果直觀分析

對乙醇浸漬法正交試驗的結(jié)果進行直觀分析，結(jié)果如表4所示。由極差值（R）可知，提取次數(shù)（C）對滇藏杜英總酚的提取影響最大，其次是乙醇體積分數(shù)（B）。提取次數(shù)（C）極差值（R）是乙醇體積分數(shù)（B）的1.7倍，料液比（A）的3.6倍。在提取次數(shù)（C）中，提取3次時提取率的因子總和或平均值最高。分析乙醇體積分數(shù)時，使用80%的乙醇體積分數(shù)時因子總和或平均值最高。料液比（A）對提取率也有一定影響，當料液比為1∶30（g/mL）時，因子總和或平均值提取率最高。綜合以上直觀分析分析結(jié)果，滇藏杜英總酚提取的最優(yōu)組合為A1B3C3，即以1∶30（g/mL）的料液比，80%的乙醇，在室溫條件下，提取次數(shù)3次。根據(jù)因素主次順序排列，結(jié)果為C3B3A1。

表4 乙醇浸漬法提取滇藏杜英總酚正交試驗結(jié)果

根據(jù)回流提取法正交試驗直觀分析結(jié)果（表5）可知，料液比（A）、提取溫度（B）和提取時間（C）的極差值（R）分別為19.04，11.94和17.17。說明在回流提取法中各因素對滇藏杜英總酚的提取率都有較大影響，其中料液比（A）影響最大，其次是提取時間（C），與前二者相比提取溫度（B）影響略低。對試驗各因素每個水平的因子總和或平均值進行比較可知，料液比為1∶50（g/mL）時，該水平總酚提取率的因子總和或平均值最高，在100 ℃條件下因子總和或平均值最高，當提取時間2 h時因子總和或平均值最高。因此，回流提取法提取滇藏杜英總酚提取的最優(yōu)組合為A3B3C3。根據(jù)因素主次順序排列，結(jié)果為A3C3B3。

表5 回流提取法提取滇藏杜英總酚正交試驗設計與結(jié)果

利用超聲波提取法提取滇藏杜英總酚，根據(jù)正交試驗結(jié)果的直觀分析（表5）可知，提取溫度（B）的極差（R）最大，其次是料液比（A），提取次數(shù)（C）的極差（R）最小。由此可知，在考察的3個影響因素中，影響滇藏杜英總酚提取的因素主次順序依次為提取溫度＞料液比＞提取次數(shù)。提取溫度為70℃時，因子總和或平均值最高，料液比為1∶20（g/mL）時因子總和或平均值最高，提取次數(shù)為1次時因子總和或平均值最高。綜上所述利用超聲波提取法提取滇藏杜英總酚提取的最優(yōu)組合為A1B3C1。根據(jù)因素主次順序排列，結(jié)果為B3A1C1。

表6 超聲波提取法提取滇藏杜英總酚正交試驗設計與結(jié)果

2.3 正交試驗結(jié)果方差分析

對正交試驗結(jié)果進行方差分能夠精確地檢驗出各因素對試驗結(jié)果影響的顯著性, 并能估計試驗誤差。運用乙醇浸漬法提取滇藏杜英總酚時，由表7可知，提取次數(shù)對滇藏杜英總酚提取率的影響達到顯著水平（P＜0.05），其他兩個因素對滇藏杜英總酚提取率的影響未達到顯著水平（P＞0.05）。只進行1次提取時，乙醇浸漬法提取的提取率顯著低于（P＜0.05）2次和3次提取的提取率（圖2a）。雖然3次提取的提取率高于2次提取的提取率，但二者并無顯著差異。回流提取法正交試驗結(jié)果方差分析（表7）顯示，所選取的料液比、時間、溫度三個因素滇藏杜英總酚提取率的影響并不顯著（P＞0.05），同一因素個水平間亦無顯著差異（P＞0.05）（圖2b）。在超聲波提取法中，料液比、溫度和提取次數(shù)對總酚提取率均有顯著的影響（P＜0.05），其中料液比和溫度的影響達到了極顯著水平（P＜0.01）（表7）。當料液比為1∶20和1∶30（g/mL）時總酚提取率極顯著（P＜0.01）地高于1∶40（g/mL）的料液比（圖2c），1∶20和1∶30（g/mL）之間無顯著差異；提取溫度為40 ℃時，提取率最高（P＜0.01）；提取次數(shù)為1次時效果最佳。根據(jù)方差分析結(jié)果可知超聲波提取法的最佳方案為A1B3C1，按顯著性進行排序為B3A1C1。

圖2 各種提取方法中同一因素不同水平提取率差異比較

表7 不同方法提取滇藏杜英總酚提取率正交試驗方差分析表

2.4 各提取方法提取滇藏杜英總酚提取率比較和綜合評價

對不同提取方法提取滇藏杜英總酚的提取率進行比較（圖3），運用回流提取法的提取率顯著高于乙醇浸漬提取法和超聲波提取法（P＜0.05）。雖然超聲波提取法的提取率稍高于乙醇提取法，但二者并無顯著差異（P＞0.05）。從模糊隸屬函數(shù)對不同提取方法提取滇藏杜英總酚的綜合評價（圖4）可以看出：回流提取法的平均隸屬值最高（0.620）；其次乙醇浸漬法，平均隸屬值為（0.225）；超聲波提取法的平均隸屬值最低（0.035）。

圖3 不同提取方法提取率比較

圖4 不同提取方法平均隸屬值

3 討論

酚類是植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物，對其進行提取時，影響其提取率的工藝參數(shù)因物種的不同而不同，目前國內(nèi)使用較為廣泛的一類多酚提取方法是溶劑萃取法[10]。由于受多酚來源不同的影響，影響多酚提取率工藝參數(shù)也不同，通常浸提條件、浸提劑、浸提時間、溫度、次數(shù)等都會對提取率產(chǎn)生不同的影響[10-11]。研究結(jié)果顯示，提取次數(shù)對乙醇浸漬法提取滇藏杜英總酚有顯著影響，且提取1次的提取率顯著低于多次提取的提取率，但當提取次數(shù)超過兩次時提取率差異并不顯著，因此從節(jié)省人力物力和提高效率角度考慮，運用乙醇浸漬法提取滇藏杜英總酚時，選擇提取次數(shù)2次為最佳。料液比和乙醇體積分數(shù)對乙醇浸漬法提取滇藏杜英總酚的影響在統(tǒng)計學上雖達不到顯著水平，但運用直觀分析法可知，當料液比和乙醇體積分數(shù)分別為1∶30（g/mL）和80%時提取效果最佳。因此結(jié)合直觀分析法結(jié)果乙醇浸漬法提取滇藏杜英總酚的最佳方案為C2B3A1。

回流提取法是一種重要的植物總酚提取方法。在提取滇藏杜英總酚時，回流提取法的總酚提取率均顯著高于乙醇浸漬法和超聲波提取法，另外回流提取法平均隸屬值最高，表明三種提取滇藏杜英總酚的方法中回流提取法的提取率最高。各因素影響提取率的方差分析中，回流提取法的三種因素對提取率的影響均不顯著，且誤差值較高，這說明還有其他重要的因素影響滇藏杜英總酚的提取率。因此運用回流提取法提取滇藏杜英總酚時還需要進一步探索其他因素對總酚提取率的影響?；亓魈崛》ǖ娜N因素對提取率的影響均不顯著，但通過直觀分析可知試驗三種因素的最優(yōu)組合為A3C3B3。

超聲波提取法是利用超聲波產(chǎn)生的各種效應，如強烈振動、高加速度、強烈的空化效應、攪拌作用等，破壞多酚類化合物內(nèi)的氫鍵和疏水鍵而加速有效成分進入溶劑，以達到避免高溫對提出成分的影響，從而提高提取率、縮短提取時間[12-13]。在利用超聲波提取法提取滇藏杜英總酚時，料液比、溫度和提取次數(shù)對提取率的影響均達到顯著水平，由此可見在利用該方法提取滇藏杜英總酚時應當重點考慮和控制這三個因素。綜合直觀分析和方差分析的結(jié)果，最優(yōu)組合為B3A1C1。對各提取方法提取滇藏杜英總酚提取率比較和綜合評價結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲波提取法提取率最低。在使用該方法提取滇藏杜英總酚時還需進一步改進，探索出提取率更高的方案。

4 結(jié)論

通過試驗研究，運用乙醇浸漬法提取滇藏杜英總酚時，應采用C2B3A1方案，即乙醇體積分數(shù)為80%，提取次數(shù)為3次，料液比為1∶30（g/mL），此時總酚提取率最高。采用回流提取法提取時，采用料液比1∶50（g/mL）、提取溫度100 ℃、提取時間2 h的組合提取效率最高（A3C3B3）。利用超聲波提取法提取滇藏杜英總酚時，應將提取溫度設為30 ℃，料液比設為1∶20（g/mL），提取次數(shù)設為1次 （B3A1C1），這樣提取效率最高。采用回流提取法提取滇藏杜英總酚可實現(xiàn)較高的提取率。