三個(gè)產(chǎn)地丁香花蕾油的水蒸氣蒸餾法提取及成分分析

尹團(tuán)章 ，邵佩 ，吳昭 ，邵興偉 ，張磊 ，蹇順華 *

1. 湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司（武漢 430040）；2. 武漢黃鶴樓新材料科技開發(fā)有限公司（武漢 430040）；3. 武漢黃鶴樓香精香料有限公司（武漢 430040）

丁香（Eugenia caryophyllataThunb.）為桃金娘科（Myrtaceae）植物，廣泛種植于馬來群島、非洲，主產(chǎn)于馬來西亞、印度尼西亞、坦桑尼亞、馬達(dá)加斯加等地。此外，中國也是丁香屬的自然分布中心，我國廣東、廣西、海南等地栽培較多[1]。

丁香花蕾為干燥花蕾，味辛、溫，藥用價(jià)值高，具有溫中降逆、暖腎助陽、行氣止痛、醒神開竅、辟邪殺蟲等功效[2]。同時(shí)也具有食用性，可作辛香料的主配料[3]。其主要提取物丁香花蕾油，作為一種名貴香料，在食品[4-5]、日化[6-7]和醫(yī)藥[8-9]等行業(yè)中使用廣泛，具有良好的市場應(yīng)用前景。

目前丁香花蕾油的研究多集中于抑菌抗氧化功效[10-11]和香氣成分分析[12-16]，關(guān)于不同產(chǎn)地丁香花蕾油及其制備方法等的文獻(xiàn)報(bào)道較少。在丁香花蕾油的提取方法的報(bào)道上，主要有水蒸氣蒸餾法[13]和超臨界CO2萃取法[14,16]。超臨界CO2萃取設(shè)備作為一種精油提取設(shè)備，價(jià)格較昂貴，控溫穩(wěn)定性有待提高，并且超聲過程噪音大，生產(chǎn)普遍性和適用性不強(qiáng)[17]。而水蒸氣蒸餾法工藝中，丁香花蕾油易與水形成乳化液，在油水分離器中不易分離，收集的油水混合物較少，導(dǎo)致得油率較低，但其操作簡單、成本低、適合工業(yè)化生產(chǎn)，因此需進(jìn)行工藝的改良以提高得率。在關(guān)于丁香花蕾油的香氣成分分析的文獻(xiàn)中，除了主要成分丁香酚、β-石竹烯和乙酸丁香酚酯外，其他揮發(fā)性成分的分析和鑒定還有待進(jìn)一步深入研究[12-16,18]。周葉燕等[13]根據(jù)丁香的年出產(chǎn)量開展了印度尼西亞、馬達(dá)加斯加、越南等原料產(chǎn)地的丁香花蕾油提取得率的研究，但我國和國外主產(chǎn)區(qū)丁香花蕾油相比較的相關(guān)研究較少，因此研究根據(jù)我國和國外丁香的主產(chǎn)區(qū)開展中國廣東、馬來西亞和坦桑尼亞三個(gè)產(chǎn)地丁香花蕾油的研究，采用水蒸氣蒸餾法的改良工藝提取丁香花蕾油，并結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對三個(gè)產(chǎn)地的丁香花蕾油的香氣成分進(jìn)行分析和鑒定，以期為丁香花蕾油精細(xì)加工提供理論依據(jù)，也旨在為我國食品、香精香料行業(yè)的辛香類產(chǎn)品開發(fā)提供一些值得借鑒的信息。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

丁香花蕾：干燥花蕾，含水率＜8%，產(chǎn)地分別為馬來西亞、坦桑尼亞和中國廣東，來自供應(yīng)商供應(yīng)的商品；無水硫酸鈉、無水乙醇，分析純。

1.2 儀器和設(shè)備

8890-5977B型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）；98-1-B型電子調(diào)溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；milli-Q lntegral 3型超純水儀[美國密理博（Milipore）公司]；5 000 mL圓底燒瓶、冷凝管、三通彎角、1 000 mL磨口三角錐形瓶、分液漏斗等實(shí)驗(yàn)室常規(guī)玻璃儀器（四川蜀牛玻璃儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)與方法

1.3.1 丁香花蕾油的制備方法

水蒸氣蒸餾法改良工藝提取裝置見圖1。

圖1 丁香花蕾油的制備裝置圖

具體步驟：（1）提取：稱取0.5 kg丁香花蕾加入5 000 mL圓底燒瓶2中，以1∶8（g/mL）料液比加入超純水，置于電熱套1中，開始加熱，溫度設(shè)置為100℃，大約40 min后，開始有油水混合蒸氣通過三通彎角3進(jìn)入水平冷凝管5，冷凝液滴落進(jìn)三角錐形瓶；（2）收集：當(dāng)冷凝液裝滿三角錐形瓶7后，將油水混合液（乳化液，乳白色）轉(zhuǎn)移至燒杯中，整個(gè)過程重復(fù)3～4次；（3）破乳：提取5 h后，結(jié)束提取試驗(yàn)，采用低溫冷凍或添加超純水方法進(jìn)行破乳，實(shí)現(xiàn)油水分離和分層，靜置0.5～1 h；（4）分離：將分層的油水置于分液漏斗中，分離，得到丁香花蕾油粗油；（5）脫水干燥：將丁香花蕾油粗油再按2∶1質(zhì)量比加入無水硫酸鈉室溫下干燥后4～6 h，得到澄清透明的丁香花蕾油。

1.3.2 破乳時(shí)間的測定

將一定質(zhì)量的丁香花蕾油和水的乳化液，分別按照冷凍（4 ℃冷藏）和添加3倍質(zhì)量超純水兩種方法進(jìn)行破乳，直至油和水完全分離，計(jì)算和統(tǒng)計(jì)破乳時(shí)間，以小時(shí)（h）為單位，重復(fù)3次。

1.3.3 丁香花蕾油的得率和收集率

丁香花蕾油的得率按式（1）計(jì)算[19]。

式中：R1為丁香花蕾油的得率，%；m1為丁香花蕾油質(zhì)量，g；m2為丁香花蕾的質(zhì)量，g。

丁香花蕾油的收集率按式（2）計(jì)算

式中：R2為丁香花蕾油的收集率，%；R1為丁香花蕾油的得率，%；21%為丁香花蕾油的理論最高含油量，丁香花蕾油的理論含油量為10%～21%[16]。

1.3.4 丁香花蕾油GC-MS 分析條件

1.3.4.1 氣相色譜條件

色譜柱：DB-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升溫：50 ℃保持2 min，以8 ℃/min的速率升至280 ℃，保持25 min；進(jìn)樣口溫度：250℃；恒流進(jìn)樣，載氣（He）流量為1 mL/min；分流比1∶10，傳輸線溫度280 ℃。

1.3.4.2 質(zhì)譜條件

EI離子源；電子能量70 eV；掃描范圍33～400 amu；四級桿溫度：150 ℃；離子源溫度280 ℃。

1.3.5 丁香花蕾油的定性定量方法

以美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所譜庫NIST17.L檢索為主，同時(shí)結(jié)合人工解析質(zhì)譜圖[20]對各個(gè)組分進(jìn)行定性；采用峰面積歸一化法對各個(gè)組分進(jìn)行定量，計(jì)算各個(gè)不同揮發(fā)性化學(xué)組分的相對含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2010對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Origin 8.0軟件進(jìn)行繪圖，圖表中數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 三個(gè)產(chǎn)地丁香花蕾油的得率

通過水蒸氣蒸餾法的改良工藝，成功制備得到丁香花蕾油，試驗(yàn)得油率從改進(jìn)前工藝（傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾的油水分離器）的不足1%（數(shù)據(jù)未提供）顯著提高到12%以上（見圖2），其關(guān)鍵在于改良工藝中油水混合物的有效收集和破乳二個(gè)步驟。從圖2可知，這三個(gè)產(chǎn)地的丁香花蕾油的得率存在顯著性差異（P＜0.05），得率大小排序?yàn)橹袊鴱V東＞坦桑尼亞＞馬來西亞，得率符合以赤道為中心向兩極遞增的規(guī)律，這也與周葉燕等[13]的研究結(jié)果基本一致。

圖2 三個(gè)產(chǎn)地丁香花蕾油的得率

2.2 丁香花蕾油的有效收集

根據(jù)文章方法中的1.3.3小節(jié)計(jì)算可知，常規(guī)水蒸氣蒸餾法工藝的丁香花蕾油的收集率僅在4.2%左右，而改良工藝的丁香花蕾油的收集率在60%以上（見圖3），遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常規(guī)水蒸氣蒸餾法工藝的收集率。這是因?yàn)樵诔Ｒ?guī)水蒸氣蒸餾法丁香花蕾油提取中實(shí)際的難點(diǎn)在于精油和水容易形成乳化液難以分離，在玻璃材質(zhì)的油水分離器中不能即時(shí)分層得到精油，因此油水分離器并不適用于丁香花蕾油的提取。

圖3 兩種工藝中丁香花蕾油的收集率

在常規(guī)水蒸氣蒸餾法工藝的油水分離器中，丁香花蕾油不能在此實(shí)現(xiàn)油水的即時(shí)分離（一步），而且油水分離器中的集油管容量（5 mL）有限，油水混合物反復(fù)回流、蒸發(fā)、冷凝，不能將油水混合物全部收集，最終得油率較低。在改良工藝中，針對常規(guī)水蒸氣蒸餾法工藝油水不能即時(shí)分離這一現(xiàn)狀進(jìn)行有效的提取裝置改進(jìn)（見圖1），不使用油水分離器進(jìn)行精油的分離和收集，先通過水平冷凝管將油水混合物冷凝為液滴后收集到三角瓶中（第一步），這樣的益處是能將丁香花蕾油最大化地收集起來，再結(jié)合后續(xù)的破乳步驟實(shí)現(xiàn)油水分離和分層（第二步），能提升丁香花蕾油的得油率。通過常規(guī)水蒸氣蒸餾法工藝（一步法，油水收集和分離同時(shí)進(jìn)行）改為改良工藝（二步法，先收集再分離），能最大限度地收集丁香花蕾精油，最終提升精油得率。

2.3 破乳工藝步驟的確立

在改良工藝中，在前期的油水混合液（乳化液）的有效收集的基礎(chǔ)上，開展油水乳化液的破乳，實(shí)現(xiàn)油水分離分層。在丁香花蕾油和水乳化液的分離中，周葉燕等[13]采用2% NaCl鹽析方法分離油水混合物，也是一種破乳方法。破乳這一工藝步驟打破了丁香花蕾油油水乳化液中的分子間平衡，使精油從水分子間分離出來，最后達(dá)到油和水的分層。

試驗(yàn)在探索丁香花蕾油水乳化液的多種破乳方法中，根據(jù)無添加外源物以及經(jīng)濟(jì)、簡單易行的原則確立了冷凍破乳和添加超純水破乳兩個(gè)方法。通過試驗(yàn)結(jié)果可知，冷凍方法破乳時(shí)間為12 h，而添加超純水方法破乳時(shí)間僅為0.5 h（見圖4）。添加超純水破乳的方法的時(shí)間更短，效率更高。另外，超純水選材容易，無環(huán)境壓力，因此選擇添加超純水破乳的方法進(jìn)行丁香花蕾油油水混合液的分離。

圖4 不同破乳方法的破乳時(shí)間

2.4 丁香花蕾油揮發(fā)性成分的GC-MS分析結(jié)果

用裝有DB-5MS型色譜柱的GC-MS聯(lián)用儀分別對三個(gè)產(chǎn)地的丁香花蕾油的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析和鑒定，所得對應(yīng)的總離子流圖見圖5，鑒定出的揮發(fā)性成分見表1。

圖5 三個(gè)產(chǎn)地丁香花蕾油的TIC總離子流圖

表1 三個(gè)產(chǎn)地丁香花蕾油中揮發(fā)性成分的鑒定結(jié)果

接表1

由圖5和表1可以看出：采用水蒸氣蒸餾法結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用儀分別萃取和分析三個(gè)產(chǎn)地丁香花蕾中的香氣成分，共檢測出34種揮發(fā)性成分；共有揮發(fā)性成分18種（烯烴類7種、酯類3種、酚類3種、醇類3種、烷類1種、其他類1種）。

三個(gè)產(chǎn)地丁香花蕾油中檢測出的揮發(fā)性成分的種類多少，也和它們精油得率的規(guī)律基本一致，符合以赤道為中心向兩極遞增的規(guī)律，中國廣東產(chǎn)地的丁香花蕾油的揮發(fā)性成分種類最多，共檢測出33種；坦桑尼亞產(chǎn)地的丁香花蕾油的揮發(fā)性成分，共檢測出28種；馬來西亞產(chǎn)地的丁香花蕾油的揮發(fā)性成分，共檢測出23種，三個(gè)產(chǎn)地丁香花蕾油中的揮發(fā)性成分種類數(shù)存在差異。

研究表明：丁香酚、β-石竹烯和乙酸丁香酚酯是丁香花蕾油中的主要香氣成分，研究中這3種物質(zhì)在三個(gè)產(chǎn)地的丁香花蕾油中的占比較高，均達(dá)到總揮發(fā)性成分的95%以上，其中中國廣東產(chǎn)地的比例為95.35%，馬來西亞產(chǎn)地的比例為96.63%，坦桑尼亞產(chǎn)地的比例為95.99%。

丁香花蕾油中除了丁香酚、β-石竹烯和乙酸丁香酚酯這3個(gè)主要香氣成分外，還含有一種重要的香氣成分葎草烯，又稱為α-石竹烯，是β-石竹烯的同分異構(gòu)體，它具有似丁香油的辛香和木香香氣，其相對含量在1%左右，占第四位。同時(shí)，在丁香花蕾油中存在（-）-異丁香烯（Bicyclo[7.2.0]undec-4-ene，4, 11, 11-trimethyl-8-methylene-，[ 1R-（1R*，4Z，9S*）]-）、異丁香烯同分異構(gòu)體4, 11, 11-三甲基-8-亞甲基雙環(huán)[7.2.0]十一碳-3-烯（4, 11, 11-trimethyl-8-methylene-bicyclo[7.2.0]undec-3-ene）、蘇合香烯等成分，屬首次報(bào)道。異丁香酚[Phenol，2-methoxy-4-（1-propenyl）]（丁香酚的同分異構(gòu)體），具有清甜的辛香，有香石竹、丁香花、香羅蘭樣花香，又有似龍涎香、麝香、豆香與膏香氣息，可用于轉(zhuǎn)化為香蘭素[21]，還具有體內(nèi)外抗炎的作用[22]。另外，石竹烯醇，一種倍半萜醇，有木香香氣[23]；葎草烯醇-II，石竹烯氧化物，屬于β-石竹烯的衍生物，具有辛香和木香香氣。這些丁香酚、β-石竹烯的同分異構(gòu)體、衍生物的作用，使得丁香花蕾油具有典型的辛香為主和兼具木香的香韻。

古巴烯、γ-依蘭油烯、α-法尼烯、γ-欖香烯、α-芹子烯，這些萜烯類物質(zhì)的存在，豐富和飽滿了丁香花蕾油的香韻，符合丁香花蕾油的文獻(xiàn)的研究報(bào)道[18]，不僅提供了丁香花蕾油抗氧化、抗菌的特性，還可為作為其他食用香精的配料提供參考。

3 結(jié)論

用水蒸氣蒸餾法的改良工藝制備的三個(gè)產(chǎn)地丁香花蕾油，能有效收集油水混合物和通過破乳方法實(shí)現(xiàn)精油與水完全分離，最終提高得油率。三個(gè)產(chǎn)地丁香花蕾的得油率，隨地理緯度的增加而升高，分別為中國廣東14.12%、坦桑尼亞13.43%、馬來西亞12.56%。同時(shí)，三個(gè)產(chǎn)地丁香花蕾油的揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量也呈現(xiàn)出隨地理緯度的增加而增多的趨勢。

通過GC-MS成分分析，三個(gè)產(chǎn)地的丁香花蕾油在主要成分含量和香氣成分上也有一定差別，可以得出：（1）三個(gè)產(chǎn)地的丁香花蕾油中，總共檢測鑒定出34種揮發(fā)性成分，其中共有揮發(fā)性成分18種；（2）丁香酚、β-石竹烯和乙酸丁香酚酯這三種主要香氣成分均占三個(gè)產(chǎn)地丁香花蕾油中的總揮發(fā)性成分的95%以上，對丁香花蕾油的特征香氣起主導(dǎo)作用；（3）在三個(gè)產(chǎn)地的丁香花蕾油中均包含葎草烯，這也是一種重要香氣成分；（4）異丁香酚、（-）-異丁香烯、異丁香烯同分異構(gòu)體（4, 11, 11-三甲基-8-亞甲基雙環(huán)[7.2.0]十一碳-3-烯）等成分存在于丁香花蕾油中，豐富了丁香花蕾油的組分；（5）丁香酚、β-石竹烯的同分異構(gòu)體也存在于丁香花蕾油中，符合同分子組成結(jié)構(gòu)具有多態(tài)性的規(guī)律。

通過三個(gè)產(chǎn)地丁香花蕾油的得率和GC-MS成分分析，對指導(dǎo)不同產(chǎn)地丁香花蕾原料和精油的采購價(jià)格、丁香花蕾油的精細(xì)加工、丁香花蕾油辛香香韻強(qiáng)度的合理使用具有一定的參考意義。