響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助黃酒酒糟木糖提取工藝

曹卓華，魯姣，應(yīng)雨婷，樓悅，孫小紅，周瑾

紹興文理學(xué)院元培學(xué)院（紹興 312000）

黃酒是以稻米等糧食作為原材料，經(jīng)蒸煮、加曲、發(fā)酵和壓濾等多道工序釀成，作為其主要副產(chǎn)物的黃酒酒糟，含有相當(dāng)豐富的淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]。據(jù)中國(guó)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局?jǐn)?shù)據(jù)顯示，2021年中國(guó)黃酒產(chǎn)量達(dá)360萬 t，黃酒出糟率高，每產(chǎn)1萬 t黃酒約有720 t黃酒糟廢棄，也就意味著每年約25.9萬 t黃酒糟生成。這些黃酒糟中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，如若不經(jīng)過處理回收，不僅導(dǎo)致資源的浪費(fèi)，而且容易造成河道堵塞，微生物肆意繁殖，影響動(dòng)植物的生存，導(dǎo)致環(huán)境污染[2]。黃酒酒糟常用于制作動(dòng)物飼料[3]、制備食醋[4]、醬油[5]和制曲[6]等。黃酒酒糟中含有豐富的半纖維素，這些半纖維素可以分解為木糖及其他戊糖等，其中木糖可作為木糖醇等重要工業(yè)產(chǎn)物的原料，通過中和脫酸工藝[7]生產(chǎn)木糖醇，這將極大提高黃酒酒糟的再利用率。

常用的酒糟中半纖維素水解為木糖的制取工藝包括酸水解法[8]和酶水解法[9]。傳統(tǒng)的酸水解法制取木糖過程中，為達(dá)到適合的反應(yīng)溫度，常使用傳統(tǒng)熱源對(duì)反應(yīng)物進(jìn)行加熱，熱效率低下，反應(yīng)時(shí)間較久[10]。試驗(yàn)采用微波輔助酸水解法使黃酒酒糟中的半纖維素水解，以此制取木糖。為達(dá)到優(yōu)化提取工藝的目的，設(shè)計(jì)相應(yīng)的單因素試驗(yàn)并應(yīng)用響應(yīng)面法綜合分析木糖的最優(yōu)制取條件，以獲得更為高效的酒糟木糖制取方案，為黃酒酒糟的再利用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃酒酒糟（紹興市某酒廠）；D-木糖標(biāo)準(zhǔn)品（≥99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、3, 5-二硝基水楊酸、苯酚、無水亞硫酸鈉、硫酸等（均為分析純）。

1.2 儀器與設(shè)備

MDS-6G多通量微波消解/萃取系統(tǒng)（上海新儀微波化學(xué)科技有限公司）；CXC-06粗纖維測(cè)定儀（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；722N可見分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）；KDN-BI定氮儀（上海新嘉電子有限公司）；KDN-08C數(shù)顯溫控消化爐（上海新嘉電子有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黃酒酒糟基本成分測(cè)定

1.3.1.1 灰分測(cè)定

稱取5 g（精確至0.001 g）干燥黃酒酒糟樣品，置恒重坩堝中于電熱板上加熱充分炭化至無煙，置于高溫爐中550 ℃灼燒4 h，冷卻至200 ℃左右取出，在干燥器中冷卻30 min，重復(fù)灼燒至恒重，稱量，計(jì)算灰分[11]。

1.3.1.2 粗纖維測(cè)定

稱取2 g黃酒酒糟粉末，放入500 mL三角瓶中，加200 mL已沸騰的硫酸溶液，立即加熱，使其在2 min內(nèi)沸騰并保持微沸30 min。抽濾后用已沸騰的氫氧化鈉溶液（0.313 mol/L）將殘?jiān)D(zhuǎn)移至原容器中并加至200 mL，同上微沸30 min，隨后立即在鋪有石棉的古氏坩堝上過濾，先用25 mL硫酸溶液（0.128 mol/L）洗滌，然后將殘?jiān)D(zhuǎn)移至坩堝中，用沸蒸餾水洗至pH 7，再用15 mL乙醇洗滌后抽干。將坩堝放入烘箱，于130 ℃烘干2 h，接著在干燥器中冷卻至室溫，稱量，再于550 ℃馬弗爐中灼燒30 min，取出后于干燥器中冷卻至室溫后稱量，計(jì)算粗纖維含量[12]。

1.3.1.3 蛋白質(zhì)測(cè)定

采用凱氏定氮法[13]。

1.3.1.4 脂肪的測(cè)定

精密稱取5 g干燥黃酒酒糟，置于干燥至恒重的接收瓶中，加入石油醚于索氏提取器中抽提回流8 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收石油醚，待溶劑剩余約2 mL時(shí)水浴蒸干，并于100 ℃干燥1 h，于干燥器中冷卻0.5 h，重復(fù)以上操作至恒重，計(jì)算脂肪含量[14]。

1.3.2D-木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

試驗(yàn)采用DNS分光光度法測(cè)定木糖含量，在波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定樣品的吸光度[15]。配制1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)D-木糖溶液，分別取0，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6和0.7 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL容量瓶中，繼續(xù)加2.0 mL蒸餾水，各加入2 mL 3, 5-二硝基水楊酸（DNS），在沸水浴中煮沸5 min，迅速冷卻至室溫，并用蒸餾水定容至25 mL，混合均勻。在540 nm波長(zhǎng)處用分光光度計(jì)分別測(cè)定各管的吸光度。設(shè)吸光度（A）為縱坐標(biāo)、濃度（c）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=22.65c-0.036 9（R2=0.999 1），線性關(guān)系良好。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

精密稱取0.5 g黃酒酒糟粉末至微波反應(yīng)釜中，研究液料比（3∶1，5∶1，10∶1，15∶1和20∶1 mL/g）、硫酸濃度（1%，2%，3%，4%，5%和6%）、微波功率（300，400，500，600，700和800 W）、微波時(shí)間（1，3，5，7和9 min）4個(gè)因素對(duì)黃酒酒糟中木糖提取的影響，為響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)提供合適的因素水平范圍。根據(jù)試驗(yàn)過程中的實(shí)際液料比加入一定量的稀硫酸溶液，搖勻，使黃酒酒糟粉末與稀酸溶液充分接觸。把微波反應(yīng)釜置于微波反應(yīng)系統(tǒng)中進(jìn)行微波輔助酸水解反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，待反應(yīng)物冷卻至室溫，將所獲得的水解產(chǎn)物進(jìn)行過濾，去除殘?jiān)?，濾液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中用蒸餾水定容，搖勻，作為待測(cè)溶液。

黃酒酒糟中木糖含量的測(cè)定參照1.3.2中的D-木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線來測(cè)定黃酒酒糟中木糖含量（mg/g），按式（1）計(jì)算。

式中：c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程計(jì)算所得到的質(zhì)量濃度，mg/mL；N為稀釋倍數(shù)；V為定容后的待測(cè)酸水解液的體積，mL；m為稱取的黃酒酒糟粉末質(zhì)量，g。

1.3.4 響應(yīng)面分析法試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇微波功率，將液料比（A）、硫酸濃度（B）、微波時(shí)間（C）3個(gè)因素為自變量，然后根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)的設(shè)計(jì)原理來制定相關(guān)的因素的發(fā)展水平，可見表1。

表1 響應(yīng)面因素與水平

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得的結(jié)果采用SPSS 22.0分析，并用Design Expert v13.0分析試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃酒酒糟成分測(cè)定與分析

黃酒酒糟成分測(cè)定結(jié)果如表2所示。黃酒酒糟中含量最高的是蛋白質(zhì)，其次是粗纖維，脂肪含量較低。黃酒酒糟的再利用大多數(shù)是基于黃酒酒糟中蛋白質(zhì)含量高的特點(diǎn)而在畜牧業(yè)和食品行業(yè)予以開發(fā)。黃酒酒糟中的纖維素含量也較為可觀，但開發(fā)利用不充分。

表2 黃酒酒糟成分分析 單位：%

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 液料比的影響

由圖1可知，保持其他因素不變，隨著液料比的增加，樣品中D-木糖含量也隨之增加，并在液料比5∶1 mL/g處出現(xiàn)最大值。其原因可能是在液料比過低時(shí)，液相中的水量較少，酸水解產(chǎn)生的木糖難以充分而快速地?cái)U(kuò)散溶入水中，從而導(dǎo)致反應(yīng)速率減慢，木糖產(chǎn)率降低。綜合考慮，選擇液料比5∶1 mL/g較為合適。

圖1 液料比對(duì)木糖得率的影響

2.2.2 硫酸濃度的影響

由圖2可知，保持其他因素不變，隨著硫酸濃度的增加，樣品中的D-木糖含量也隨之增加，并在硫酸濃度4%處出現(xiàn)最大值。其可能的原因是在酸水解的過程中，硫酸濃度的增加使得氫離子濃度也隨之增加，氫離子同黃酒酒糟中半纖維素的醚鍵結(jié)合的概率也就越大，其酸水解為木糖的速率也隨之增加[16]。且硫酸濃度較低時(shí)，生物質(zhì)中的無機(jī)陽(yáng)離子和灰分也會(huì)與水解液中的氫離子發(fā)生離子交換反應(yīng)[17]，從而進(jìn)一步使氫離子濃度降低，降低反應(yīng)速率，使木糖的產(chǎn)率降低。硫酸濃度繼續(xù)增大時(shí)，樣品中的D-木糖含量反而呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，可能是過高的硫酸濃度會(huì)導(dǎo)致木糖被氧化，同時(shí)木糖在酸的催化下進(jìn)一步脫水生成糠醛。綜合考慮，選擇硫酸濃度4%較為合適。

圖2 硫酸濃度對(duì)木糖得率的影響

2.2.3 微波功率的影響

由圖3可知，保持其他因素一定，微波功率300 W時(shí)，樣品中的D-木糖含量有最大值，隨著微波功率的增加，木糖含量開始下降?？赡茉诤线m的微波功率下，微波的輻射使得極性分子間的碰撞更加頻繁與劇烈，使得木糖的溶出增加，反應(yīng)速度加快。同時(shí)，硫酸分子間會(huì)形成氫鍵，而使得氫離子濃度降低，反應(yīng)速率變慢。合適功率下的微波輻射會(huì)使溫度升高，促進(jìn)氫離子電離，加快反應(yīng)速率[18]，提高木糖產(chǎn)率。而過高的微波功率的輻照則會(huì)導(dǎo)致木糖的焦化及Maillard反應(yīng)的發(fā)生[16]，使得木糖的產(chǎn)率下降。綜合考慮，選擇微波功率300 W較為合適，后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)微波功率直接設(shè)置為300 W。

圖3 微波功率對(duì)木糖得率的影響

2.2.4 微波時(shí)間的影響

由圖4可知，保持其他因素一定，隨著微波時(shí)間的增加，樣品中的D-木糖含量也隨之增加，并在微波時(shí)間5 min處出現(xiàn)最大值。隨著微波時(shí)間的增加，黃酒酒糟中的半纖維素的水解程度也隨之增加，并逐漸達(dá)到水解完全。繼續(xù)增加微波時(shí)間，樣品中的D-木糖含量呈下降趨勢(shì)，可能是半纖維素完全水解為木糖后，副反應(yīng)進(jìn)行速率增加，木糖脫水生成糠醛的反應(yīng)進(jìn)行程度逐漸加大，產(chǎn)生的木糖被消耗，導(dǎo)致木糖產(chǎn)率降低。綜合考慮，選擇微波時(shí)間5 min較為合適。

圖4 微波時(shí)間對(duì)木糖得率的影響

2.3 響應(yīng)面分析

2.3.1 響應(yīng)面結(jié)果

表3為試驗(yàn)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果，表4為數(shù)據(jù)方差及顯著性檢驗(yàn)分析。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表4 響應(yīng)面回歸模型的方差分析及顯著性檢驗(yàn)

通過Design Expert v13.0軟件將3個(gè)因素與響應(yīng)值Y進(jìn)行回歸擬合，得到木糖取得量（Y）的多元二次回歸擬合方程（各因素水平值為編碼制）：Y=93.02-2.40A+2.27B+15.90C-3.06AB+16.77AC-2.52BC-10.32A2-7.03B2-17.47C2。

通過對(duì)比預(yù)測(cè)值與實(shí)際值，其R2=0.836 8，表明二者較為接近，試驗(yàn)誤差較小，實(shí)際值相對(duì)預(yù)測(cè)值的偏離較小，該模型較為有效。

由表4可知：該模型F值為3.99，P值=0.040 9（＜0.05），說明試驗(yàn)的模型水平差異具有顯著性（P＜0.05）；同時(shí)該模型的失擬項(xiàng)P=0.125 9（＞0.05），表明模型失擬項(xiàng)差異不顯著，模型擬合度較高。模型可應(yīng)用于分析與預(yù)測(cè)黃酒酒糟在不同水解條件下的木糖得率。在方程中，一次項(xiàng)C微波時(shí)間對(duì)于木糖的得率的影響極為顯著，二次項(xiàng)C2對(duì)于木糖得率有著顯著影響。而交互項(xiàng)AC對(duì)于木糖得率的影響顯著。這表明因素對(duì)于響應(yīng)值的影響不是線性關(guān)系，其交互作用也對(duì)響應(yīng)值有影響。對(duì)于黃酒酒糟中的木糖得率的各因素作用強(qiáng)度中，C＞A＞B，即微波時(shí)間＞液料比＞硫酸濃度；兩因素間的交互作用強(qiáng)度中，AC＞AB＞BC，即液料比與微波時(shí)間的交互作用＞液料比與硫酸濃度的交互作用＞硫酸濃度與微波時(shí)間的交互作用強(qiáng)度。

2.3.2 響應(yīng)面圖形分析

圖7 硫酸濃度和微波時(shí)間對(duì)木糖得率的響應(yīng)面分析

響應(yīng)面等高線圖的形狀反映2種因素間交互作用的強(qiáng)弱。等高線圖越偏向于圓形，2種因素間的交互作用就越弱；等高線圖越偏向于橢圓形，2種因素間的交互作用就越強(qiáng)。如圖5所示，液料比與硫酸濃度及硫酸濃度和微波時(shí)間的交互作用等高線圖更偏向于圓形，其交互作用較??；圖6顯示液料比與微波時(shí)間的交互作用等高線圖更偏向于橢圓形，其交互作用較大。等高線排列的密集程度也反映2種因素的變化對(duì)于響應(yīng)值的影響程度。其中，液料比和微波時(shí)間的交互作用等高線圖等高線排列較為密集，二者的交互作用的影響也呈顯著水平。根據(jù)三維曲面圖可知，各個(gè)響應(yīng)面均為凸面，表明模型在該試驗(yàn)范圍內(nèi)存在最大值的穩(wěn)定點(diǎn)。

圖5 液料比和硫酸濃度對(duì)木糖得率的響應(yīng)面分析

圖6 液料比和微波時(shí)間對(duì)木糖得率的響應(yīng)面分析

2.3.3 最優(yōu)工藝條件的確定及模型驗(yàn)證

通過Design Expert v13.0軟件對(duì)于回歸模型的分析可得，在液料比9.03∶1 mL/g、硫酸濃度4.30%、微波時(shí)間7 min條件下，最優(yōu)條件下的木糖得率為100.66 mg/g。在實(shí)際條件下依照該條件進(jìn)行試驗(yàn)以驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。驗(yàn)證結(jié)果表明，3個(gè)平行試驗(yàn)中，木糖平均得率為98.06 mg/g，與理論預(yù)測(cè)值較為接近，證實(shí)該最優(yōu)條件下的木糖制取工藝的準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面分析法優(yōu)化微波輔助黃酒酒糟中木糖的制取工藝，得出最優(yōu)條件：液料比9.03∶1 mL/g、硫酸濃度4.30%、微波時(shí)間7 min，木糖最高取得量為100.66 mg/g。該最優(yōu)工藝參數(shù)可為黃酒酒糟木糖的進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)。

黃酒酒糟的酸水解所制取的木糖可作為工業(yè)原料來生產(chǎn)木糖醇[19]、糠醛[20]等重要產(chǎn)物，促進(jìn)黃酒酒糟的廢物再利用，為釀造工業(yè)的生態(tài)保護(hù)提供新思路。此外，微波加熱法具有高效、節(jié)能的特點(diǎn)，其與工業(yè)生產(chǎn)及試驗(yàn)中物質(zhì)提取的有機(jī)結(jié)合可使產(chǎn)業(yè)及科學(xué)研究效率大幅提高。黃酒酒糟中還含有大量蛋白質(zhì)、氨基酸、黃酮等物質(zhì)，黃酒酒糟的進(jìn)一步開發(fā)利用在醫(yī)藥、食品及化妝品領(lǐng)域有著深厚的潛力與廣闊的市場(chǎng)前景。