響應(yīng)面優(yōu)化山楂葉總黃酮的提取工藝及體外降脂研究

牛成偉，宋涵瑤，顧浩，李長(zhǎng)春，雷小婷

江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院（淮安 223001）

黃芩是唇形科植物黃芩的干燥根，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效。山楂（Crataegus pinnatifidaBunge），又名紅果、山里紅等，為薔薇科山楂屬落葉喬木，全球有250余種，在中國(guó)種植資源豐富[1]。山楂味甘酸，具有消食行健、行氣化瘀的功效，臨床主要用來(lái)治療食物積滯、腹痛瀉痢、胸痛腹痛、痛經(jīng)、吐血、便血等[2-3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，山楂具有抗氧化、降血脂、助消化等生物活性[4-6]。在化學(xué)成分方面，它含有黃酮類、三萜類、氨基酸等多種成分[7]。

隨著社會(huì)的發(fā)展，保健安全越來(lái)越受到重視，因此研究和開(kāi)發(fā)植物中的天然活性成分成為熱點(diǎn)。而黃酮類成分作為植物中天然成分的一種，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生理保健功能，因而也備受關(guān)注。作為藥食同源植物，山楂中含有大量的黃酮類成分。臨床主要使用其果實(shí)，而葉往往被丟棄，造成資源的浪費(fèi)。因此，選擇山楂葉作為研究對(duì)象。已有研究設(shè)計(jì)了多種從植物中提取黃酮類物質(zhì)的方法。傳統(tǒng)方法有乙醇浸提[8]，新型提取方法有酶法提取[9]、超臨界萃取[10]、超聲波輔助提取[11]。其中，超聲波輔助提取法具有操作簡(jiǎn)單、提取工時(shí)少、提取效率高等優(yōu)點(diǎn)。因此，試驗(yàn)采用簡(jiǎn)單易行的超聲波輔助提取法提取山楂葉中總黃酮，通過(guò)單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)研究其最佳提取工藝，并進(jìn)一步測(cè)定其降脂活性，對(duì)提高山楂資源的綜合利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

山楂葉，采于江蘇淮安，經(jīng)江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院祝冬青副教授鑒定為薔薇科植物山楂Crataegus pinnatifidaBunge的干燥葉。

蘆?。ǚ治鰳?biāo)準(zhǔn)品，南京廣潤(rùn)生物科技有限公司）；乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉（均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；月桂酸4-硝基苯酯、豬胰脂肪酶（生物試劑，阿拉丁生化科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

T6型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；HH-W420恒溫水浴鍋（江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）；ME203E分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；SY5200-D超聲儀（上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 山楂葉總黃酮得率的測(cè)定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法[12]檢測(cè)提取液中總黃酮含量，繪制得總黃酮質(zhì)量濃度（Y，mg/mL）與吸光度（X）標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.250 5X-0.010 1，R2=0.997 4，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線公式（式1）計(jì)算總黃酮得率。

式中：Y為超聲波提取總黃酮得率，%；C為由標(biāo)曲計(jì)算所得總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；W為提取用山楂葉的質(zhì)量，mg。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 液料比的篩選

取適量山楂葉，精密稱定，分別加入60%乙醇溶液，使60%乙醇溶液與山楂葉粉末液料比為10∶1，20∶1，30∶1，40∶1和50∶1（mL/g），超聲提取30 min，研究不同液料比對(duì)山楂葉總黃酮得率的影響。

1.3.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)的篩選

取適量山楂葉，精密稱定，按照液料比30∶1（mL/g），分別加入40%，50%，60%，70%和80%的乙醇溶液，超聲提取30 min，研究不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)山楂葉總黃酮得率的影響。

1.3.2.3 提取時(shí)間的篩選

取適量山楂葉，精密稱定，按照液料比30∶1（mL/g），加入60%乙醇溶液，分別超聲提取15，30，45，60和75 min，研究不同提取時(shí)間對(duì)山楂葉總黃酮得率的影響。

1.3.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、液料比（B）、提取時(shí)間（C）的水平范圍，以山楂葉總黃酮得率（Y）為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，用Design-Expert 12.0安排試驗(yàn)。因素與水平表見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面因素與水平表

1.3.2.5 體外降脂試驗(yàn)

取0.5 mL脂肪水解酶緩沖液（0.5 U/μL），加入0.5 mL各樣品溶液（2.5，5.0，10.0，15.0和20.0 mg/mL）充分混勻后37 ℃溫浴 15 min，加入0.5 mL月桂酸4-硝基苯酯充分混勻后，37 ℃下溫浴15 min，于405 nm處測(cè)定吸光度。以不加酶組為空白組，以不加樣品組為對(duì)照組。試驗(yàn)重復(fù)3次，按式（2）計(jì)算各樣品對(duì)胰脂肪酶的抑制率。

式中：A1為樣品組的吸光度；A2為空白組吸光度；A3為對(duì)照組吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 山楂葉總黃酮提取工藝的優(yōu)化

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響

如圖1所示，乙醇體積分?jǐn)?shù)從20%增加到60%時(shí)，山楂葉總黃酮得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而逐漸升高。乙醇體積分?jǐn)?shù)60%時(shí)，山楂葉總黃酮得率呈現(xiàn)最大值。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大，山楂葉總黃酮得率降低。因此初步選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)60%。這可能是基于相似相溶的原理，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%時(shí)，溶劑和山楂葉黃酮類化合物有相似的極性，因而黃酮類化合物溶出度最大。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)山楂葉總黃酮得率的影響

2.1.2 液料比的影響

如圖2所示，隨著液料比增加，山楂葉總黃酮得率逐漸增加。增至30∶1（mL/g）時(shí)，總黃酮得率達(dá)到最大值。液料比大于30∶1（mL/g）時(shí)，山楂葉總黃酮得率下降，這可能是溶劑過(guò)量，導(dǎo)致傳質(zhì)速度降低。因此，初步選擇液料比30∶1（mL/g）。

圖2 液料比對(duì)山楂葉總黃酮得率的影響

2.1.3 提取時(shí)間的影響

如圖3所示，提取時(shí)間由15 min增加到45 min時(shí)，山楂葉總黃酮得率逐漸增加。然而，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，得率降低。可能是提取時(shí)間延長(zhǎng)，黃酮類化合物溶解增加，進(jìn)而提高山楂葉黃酮類化合物的溶出。然而，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致山楂葉黃酮類化合物的吸附，得率降低。因此，初步選擇提取時(shí)間45 min。

圖3 提取時(shí)間對(duì)山楂葉總黃酮得率的影響

2.1.4 響應(yīng)面模型方差分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken試驗(yàn)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、液料比（B）和提取時(shí)間（C）為自變量，以山楂葉總黃酮得率為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，對(duì)山楂葉總黃酮提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。具體試驗(yàn)方案及相應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

應(yīng)用Design-Expert 12.0對(duì)試驗(yàn)結(jié)果分析，得到山楂總黃酮得率對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間的二次多項(xiàng)回歸方程式：Y=4.35-0.117 5A-0.080 0B+0.232 5C+0.022 5AB-0.137 5AC-0.062 5BC-0.208 8A2-0.343 8B2-0.393 7C2。式中：Y為山楂葉總黃酮得率（%），A為乙醇體積分?jǐn)?shù)（%），B為液料比（mL/g），C為提取時(shí)間（min）。

該模型的方差分析見(jiàn)表3。模型P＜0.05，說(shuō)明該模型具有顯著性，模型失擬項(xiàng)P＞0.05，說(shuō)明失擬不顯著，因而該模型擬合程度好。由模型的方差分析可得出乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取時(shí)間（C）、乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間交互項(xiàng)（AC）及各因素的二次項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值有顯著影響（P＜0.05），而液料比（B）、乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比交互項(xiàng)（AB）、液料比與提取時(shí)間交互項(xiàng)（BC）對(duì)響應(yīng)值具有無(wú)顯著影響（P＞0.05）。各因素對(duì)響應(yīng)值的影響顯著性排序?yàn)镃＞A＞B。

表3 方差分析

2.1.5 響應(yīng)面和等高線分析

模型的響應(yīng)面及等高線圖結(jié)果見(jiàn)圖4。響應(yīng)面圖顯示乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間中任意1個(gè)變量取零水平時(shí)，其余2個(gè)變量對(duì)山楂葉總黃酮產(chǎn)率的影響。2個(gè)因素之間的交互作用可通過(guò)響應(yīng)面和等高線表示。兩因素交互項(xiàng)的三維圖越陡峭，等高線呈橢圓，則表明這2個(gè)因素的交互項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的影響越顯著[13]。三維圖的陡峭順序?yàn)锳C＞BC＞AB，即乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間交互項(xiàng)三維圖最陡峭，表明乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間之間的交互作用對(duì)山楂葉總黃酮得率的影響顯著；從等高線來(lái)看，AB與BC的等高線接近圓形，表明乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比之間的交互作用及液料比與提取時(shí)間之間的交互作用對(duì)山楂葉總黃酮得率的影響不顯著（P＞0.05），這與模型的方差分析一致。

圖4 兩因素的交互作用對(duì)山楂葉總黃酮得率影響的響應(yīng)面及等高線圖

2.1.6 最佳工藝條件的預(yù)測(cè)和驗(yàn)證

經(jīng)Design-Expert 12.0預(yù)測(cè)模型極值點(diǎn)，結(jié)果顯示最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)55.84%、液料比28.35∶1（mL/g）、提取時(shí)間33.81 min。在此最佳提取條件下山楂葉總黃酮得率為4.43%。根據(jù)實(shí)際操作設(shè)計(jì)驗(yàn)證試驗(yàn)，其提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)56%、液料比28∶1（mL/g）、提取時(shí)間34 min，此提取條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，山楂葉總黃酮得率為4.42%±0.08%，驗(yàn)證結(jié)果與預(yù)測(cè)值接近，表明該模型擬合度良好。

2.2 山楂葉總黃酮對(duì)胰脂肪酶活性的影響

胰脂肪酶主要存在于小腸中，其主要功能是對(duì)脂肪進(jìn)行分解代謝，生成甘油和脂肪酸，從而吸收入血，引起血脂升高。胰脂肪酶活性受到抑制，脂肪分解降低，從而血脂降低。如圖5所示，隨著山楂葉總黃酮濃度的增加，其對(duì)胰脂肪酶的抑制作用增強(qiáng)，且具有一定的濃度依賴關(guān)系。

圖5 山楂葉總黃酮對(duì)胰脂肪酶活性的影響

3 結(jié)論

山楂葉總黃酮的提取和利用是山楂葉開(kāi)發(fā)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。試驗(yàn)采用超聲波輔助提取法對(duì)山楂葉總黃酮進(jìn)行提取。選取最可能影響產(chǎn)率的3個(gè)因素，即液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間。對(duì)3個(gè)因素的不同水平進(jìn)行考察，確定合適的區(qū)間。用Design-Expert 12.0設(shè)計(jì)不同因素和水平的17組試驗(yàn)。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，優(yōu)化最佳提取條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)56%、液料比28∶1（mL/g）、提取時(shí)間34 min。經(jīng)驗(yàn)證，該方法產(chǎn)率高，重復(fù)性好。通過(guò)體外方法評(píng)價(jià)山楂葉的降脂活性，初步試驗(yàn)結(jié)果顯示，山楂葉總黃酮具有顯著的降脂活性，為開(kāi)發(fā)利用天然降脂藥物的研究提供依據(jù)。