非洲豬瘟疫苗研究進(jìn)展

時(shí)云朵，孫 豪，曹恬雪，鄭燦財(cái)

（1.四川省水產(chǎn)學(xué)校，成都 611730；2.雅安市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川 雅安 625000；3.資陽(yáng)市雁江區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川 資陽(yáng) 641399；4.四川省農(nóng)業(yè)規(guī)劃建設(shè)服務(wù)中心，成都 610041）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一種豬的傳染病，于1921 年首次在肯尼亞被發(fā)現(xiàn)[1]，因其臨床癥狀與傳統(tǒng)豬瘟高度相似，且發(fā)現(xiàn)于非洲而被命名為非洲豬瘟。目前，全球ASF疫情復(fù)雜嚴(yán)峻，多國(guó)發(fā)生ASF 疫情，自2018 年8 月以來(lái)，我國(guó)先后發(fā)生多起ASF疫情，嚴(yán)重威脅生豬產(chǎn)業(yè)發(fā)展。為全力做好疫情防控，世界多國(guó)開展了ASF疫苗研究，我國(guó)也緊急開展了疫苗、免疫機(jī)制等科技攻關(guān)，對(duì)ASFV的基因組和免疫機(jī)制等方面的研究取得了較大進(jìn)展，為ASF的疫苗研究奠定基礎(chǔ)。本文概述了ASF疫苗研制面臨的挑戰(zhàn)和研究進(jìn)展，為ASF疫苗開發(fā)提供參考。

1 非洲豬瘟疫苗研制面臨的挑戰(zhàn)

1.1 非洲豬瘟病毒的形態(tài)與結(jié)構(gòu)

ASFV呈20面體對(duì)稱，直徑為175～215 nm，由外囊膜、衣殼、內(nèi)囊膜、核殼和類核組成。外囊膜的形態(tài)與細(xì)胞質(zhì)膜的“單位膜”特征相似，通過(guò)宿主細(xì)胞膜獲得外囊膜[2]。衣殼有17 280 個(gè)蛋白質(zhì)，1 個(gè)主衣殼蛋白p72 與4 個(gè)次衣殼蛋白（M1249L、p17、p49 和H240R）構(gòu)成5 個(gè)不對(duì)稱子和3 個(gè)對(duì)稱子結(jié)構(gòu)；次衣殼蛋白形成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)將鄰近的衣殼體連接在一起來(lái)穩(wěn)定衣殼，形成衣殼的骨架[3]。內(nèi)囊膜呈單層脂質(zhì)膜樣，源于宿主細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，含有蛋白p12、p17、p54 和pE248R 等[4]。核殼是一層厚約30 nm的蛋白層，圍繞著類核，主要由蛋白pS273R 和聚蛋白pp220 及pp62 的加工產(chǎn)物構(gòu)成；蛋白pp220被加工為蛋白p150、p37、p34和p14 等，pp62 可衍生為蛋白p35 和p15 等，組成核殼的6 種主要成分，占病毒粒子總質(zhì)量的32%[4]。上述結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)揭示了ASFV 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和組裝的基礎(chǔ)，為ASF疫苗研發(fā)開辟了途徑。

1.2 非洲豬瘟病毒具龐大基因組

ASFV 屬非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬，是唯一雙鏈閉合線性DNA 蟲媒病毒[5]。1995 年首次完成ASFV 的全基因組測(cè)序[6]，其基因組的末端是發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)，緊鄰末端的是由串聯(lián)重復(fù)序列和多基因家族構(gòu)成的可變區(qū)，中間部分則是比較穩(wěn)定的基因區(qū)[7]?？勺儏^(qū)基因拷貝數(shù)的變化是造成不同地區(qū)ASFV 分離株基因組大小存在差異的主要因素[8]，根據(jù)p72基因末端核苷酸的差異分析，現(xiàn)已鑒定出24種ASFV基因型，其中基因1型、2型和8型毒力最強(qiáng)，我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)的ASFV毒株（SY18株）屬于基因2 型[9]。ASFV 的DNA 分子長(zhǎng)度為170～193 kb，含150～167 個(gè)開放閱讀框，編碼150～200 種蛋白質(zhì)[10]，編碼蛋白中已知功能的數(shù)量相對(duì)較少，制約了ASFV的疫苗研究。

1.3 非洲豬瘟病毒的免疫逃逸機(jī)制

ASFV 能在自然宿主軟蜱和野豬體內(nèi)復(fù)制，弱毒株能引起豬的持續(xù)性感染，而絕大部分滅活疫苗無(wú)保護(hù)作用，即使添加新型免疫佐劑也不能提高滅活疫苗的保護(hù)力，提示ASFV具有逃避宿主防御系統(tǒng)的有效機(jī)制。ASFV 基因組不具有感染性，主要在巨噬細(xì)胞的胞漿內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，是一個(gè)高度受調(diào)控的過(guò)程[11]。ASFV 編碼許多調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞對(duì)病毒感染應(yīng)答的蛋白，其主要策略是調(diào)節(jié)感染巨噬細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，從而干擾大量免疫調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。如在ASFV 感染早期表達(dá)的A238L能夠抑制宿主細(xì)胞NF-κB和NFAT信號(hào)通路[10]，從而調(diào)節(jié)宿主基因表達(dá)；而在感染晚期表達(dá)的凋亡抑制蛋白pA224L 能夠激活NF-κB 信號(hào)通路，通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)ASFV 感染細(xì)胞的存活，最終利于病毒自身的繁殖與擴(kuò)散。同時(shí)，ASFV感染過(guò)程中表達(dá)的pDP71L能促進(jìn)翻譯起始因子eIF2a磷酸化，使宿主細(xì)胞持續(xù)合成蛋白質(zhì)，抑制自噬體的形成，并抑制細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)病毒在細(xì)胞內(nèi)的大量復(fù)制[10]。目前，對(duì)ASFV的研究仍存在較大空白，特別是免疫逃逸機(jī)制。持續(xù)深入研究ASFV編碼蛋白鑒定和蛋白功能，有助于了解ASFV編碼蛋白與宿主細(xì)胞間的相互作用機(jī)制，為研發(fā)ASF疫苗提供理論基礎(chǔ)。

2 非洲豬瘟疫苗類型

2.1 滅活疫苗

滅活疫苗是采用物理或化學(xué)方式消除病原微生物的致病性，保留免疫原性而獲得的疫苗。因制作滅活疫苗的技術(shù)成熟，最早被用在ASF疫苗的研制上，但不能提供有效的保護(hù)性。即使S.Blome 等[12]將當(dāng)時(shí)最先進(jìn)的免疫佐劑（Polygen、Emulsigen-D）加入ASFV滅活制劑后免疫仔豬，雖免疫豬均產(chǎn)生了特異抗體，但未觀察到免疫保護(hù)作用，還輕微加速了臨床過(guò)程。但開發(fā)新型的免疫佐劑，仍是制作有效ASFV疫苗的新嘗試。

2.2 弱毒疫苗

弱毒疫苗是預(yù)防ASF 的潛力最大的疫苗。目前，主要有天然弱毒株疫苗、傳代培養(yǎng)弱毒株疫苗、基因缺失弱毒株疫苗。與滅活疫苗相比，弱毒疫苗能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈持久的細(xì)胞、體液免疫應(yīng)答，同源保護(hù)率高，對(duì)免疫動(dòng)物能提供較高水平的保護(hù)，但存在毒力返強(qiáng)的可能，臨床副作用嚴(yán)重，生物安全隱患較大。

2.2.1 天然弱毒株疫苗

目前，ASFV 的天然弱毒株有ASFV/NH/P68、OUR/T88/3、Lvl7/WB/Riel。研究表明，ASFV/NH/P68 能促進(jìn)T 淋巴細(xì)胞與NK 細(xì)胞的活性，免疫接種后的豬能抵御ASFV/L60 毒株的攻擊[13]，但部分接種豬出現(xiàn)肺炎、流產(chǎn)等多重感染[14]。經(jīng)OUR/T88/3 免疫接種后的豬能抵御OUR/T88/1、Benin 97/1和genotype X Uganda毒株的攻擊。隨著CD8+T淋巴細(xì)胞的消耗，免疫效果減退[15-16]，表明該疫苗的保護(hù)性存在CD8+T 淋巴細(xì)胞依賴性，且有異源保護(hù)的可能，但免疫的豬會(huì)出現(xiàn)發(fā)熱、關(guān)節(jié)腫脹等臨床癥狀。Lvl7/WB/Riel 減毒株經(jīng)口服免疫野豬后能抵御Arm07 強(qiáng)毒株的攻擊，保護(hù)率達(dá)到92%，但該疫苗生產(chǎn)困難，且可產(chǎn)生高熱、肺炎、運(yùn)動(dòng)障礙等副作用。因此，生物安全風(fēng)險(xiǎn)限制了天然弱毒株作為防控疫苗的實(shí)際使用價(jià)值與可行性。

2.2.2 傳代培養(yǎng)弱毒株疫苗

ASFV可在豬源細(xì)胞系如Vero與CV1細(xì)胞內(nèi)不斷傳代培養(yǎng)，降低其毒力。A.D.Sereda等[17]將經(jīng)豬骨髓細(xì)胞傳代培養(yǎng)后的弱毒株接種豬，結(jié)果表明，弱毒株對(duì)同源強(qiáng)毒株的攻擊可以提供有效的保護(hù)。A.Lacasta 等[18]將經(jīng)CV1 傳代致弱的E75CV1毒株免疫接種豬后，產(chǎn)生了與親本不同的免疫途徑，能抵御同源毒株的攻擊，但不能抵御異源毒株。西班牙、葡萄牙曾利用傳代致弱毒株免疫豬卻產(chǎn)生災(zāi)難性后果。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，尤其是基因編輯技術(shù)的突破性進(jìn)展，基于自然毒株弱化的方式已逐漸被淘汰，因此傳代培養(yǎng)弱毒株是未來(lái)有望推向市場(chǎng)的候選疫苗，俄羅斯研制的傳代細(xì)胞適應(yīng)株（Arriah CV-1 株）已被歐盟作為重點(diǎn)研究的候選株[19]。

2.2.3 基因缺失弱毒株疫苗

利用基因編輯、同源重組等現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)敲除ASFV的毒力相關(guān)基因，獲得基因缺失毒株，用于疫苗研制。目前，研究主要集中在敲除免疫逃逸基因或與病毒復(fù)制有關(guān)的基因。M.V.Borca等[20]敲除ASFV-G10分離株的8D基因，獲得ASFVG-Δ8DR基因缺失株，通過(guò)肌肉注射和滴鼻接種的方式接種豬后，表現(xiàn)出與ASFV-G 相同的毒力，且病毒血癥值也沒(méi)有差異，表明8DR基因的缺失與ASFV-G 分離株的毒力明顯下降無(wú)關(guān)。而P. L. Monteagudo 等[21]敲除ASFV-BA71 分離株的EP402R 基因，獲得BA71ΔCD2 基因缺失株，免疫接種后，誘導(dǎo)特異性CD8 T 細(xì)胞識(shí)別同源株BA71、異源株E75 及ASFV-G，產(chǎn)生交叉保護(hù)作用。此外，V. O'Donnell 等[22]敲除ASFV-G07 株的9GL基因，獲得ASFV-G-Δ9GL基因缺失株，肌肉注射接種后，可以抵御同源毒株的攻擊，繼續(xù)敲掉UK基因，獲得ASFV-G-Δ9GL/ΔUK雙基因缺失株，接種后，對(duì)于同源毒株的攻擊提供100%的保護(hù)，且安全性比ASFV-G-Δ9GL更高。表明，在ASFV 基因缺失弱毒株疫苗研究時(shí)，為減弱毒力，提高保護(hù)性，要采取不同毒株敲除不同的基因或同一毒株同時(shí)敲除幾個(gè)基因的方式。因此，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所的Chen W.等[23]同時(shí)敲除ASFV 的7 個(gè)基因，構(gòu)建ASFV 基因缺失弱毒株HLJ/18-7GD，免疫接種SPF 豬、商品豬和懷孕母豬，能抵御強(qiáng)毒株的攻擊，且未見(jiàn)返強(qiáng)，表明該基因缺失株具有較好的保護(hù)性和安全性，有望用于ASF防控中，但交叉保護(hù)性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.3 基因工程疫苗

2.3.1 亞單位疫苗

亞單位疫苗是利用特異性基因和蛋白的表達(dá)來(lái)產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的一類疫苗，具有安全性高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。ASF亞單位疫苗主要是利用真核或原核細(xì)胞作為表達(dá)載體，表達(dá)具有中和表位的保護(hù)性抗原基因（如結(jié)構(gòu)蛋白基因p12、p30、p54、p72、pp62 和膜蛋白基因CD2v 等），產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或多肽誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，然而已研發(fā)的亞單位疫苗尚不能有效抵御強(qiáng)毒株的攻擊。G.P.Paulino等[24]認(rèn)為ASFV的p72、p54及p30蛋白疫苗能夠抑制病毒的依附及內(nèi)化過(guò)程，從而影響病毒復(fù)制，在病毒攻擊易感細(xì)胞后中和病毒，但免疫接種后的豬不能抵御強(qiáng)毒株的攻擊。J.G.Neilan等[25]利用桿狀病毒表達(dá)ASFV 的p30、p54、p72 及p22蛋白，免疫接種豬后均可有效誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，能延遲豬發(fā)病，但不能提供有效的免疫保護(hù)。J.K.Jancovich 等[26]用痘病毒表達(dá)ASFV的47個(gè)蛋白，免疫接種后，致死劑量的強(qiáng)毒株攻擊后，豬的血液和淋巴組織中病毒基因組水平顯著降低，表明單一抗原引起的機(jī)體免疫應(yīng)答不足以提供全面的保護(hù)。M. V. Murgia 等[27]利用甲型病毒載體表達(dá)ASFV 的p30、p54 和p72 蛋白先行免疫接種啟動(dòng)免疫原性，然后用減毒活病毒疫苗加強(qiáng)免疫的策略，能擴(kuò)大對(duì)ASFV 表位的識(shí)別。齊艷麗等[28]利用大腸桿菌載體，結(jié)合細(xì)胞融合技術(shù)，獲得ASFV 的p54蛋白單克隆抗體，其最低效價(jià)為1∶2 500，與豬偽狂犬病等病毒不發(fā)生交叉反應(yīng)，能識(shí)別p54 蛋白C端127-146aa 肽段。這表明鑒定更多的ASFV 保護(hù)性抗原，是提高亞單位疫苗免疫效力的思路。

2.3.2 DNA疫苗

ASF 的DNA 疫苗與亞單位疫苗相似，前者是將ASFV的抗原基因克隆入真核表達(dá)載體后，直接導(dǎo)入機(jī)體內(nèi)，在宿主細(xì)胞內(nèi)完成轉(zhuǎn)錄翻譯后產(chǎn)生抗原蛋白，從而激活豬特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫。但其免疫原性與亞單位疫苗相似。J.M.Argilaguet等[29-30]和A.Lacasta等[31]研究發(fā)現(xiàn)，用ASFV的基因（P54、P30）構(gòu)建的重組質(zhì)粒DNA疫苗（pCMVPQ），接種小鼠后能誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，而免疫豬卻不能誘導(dǎo)免疫反應(yīng)；為提高豬的免疫應(yīng)答，將ASFV基因（P54、P30、sHA）與豬白細(xì)胞抗原Ⅱ特異性抗體或血凝素構(gòu)建新的重組質(zhì)粒DNA 疫苗（pCMVAPCH1PQ、pCMV-sHAPQ），可成倍增強(qiáng)豬的免疫應(yīng)答，但不能抵御強(qiáng)毒株的攻擊；為增強(qiáng)誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）的效應(yīng)，將ASFV 基因（P54、P30、sHA）及泛素融合構(gòu)建重組質(zhì)粒DNA 疫苗（pCMV-UbsHAPQ），在缺乏抗體的情況下誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞應(yīng)答，且部分免疫豬抵御了ASFV的致命攻擊，表明T細(xì)胞免疫與預(yù)防ASF密切相關(guān)；為證明存在具有保護(hù)潛能的CD8 T細(xì)胞決定因子，構(gòu)建了包含4 000多個(gè)單個(gè)質(zhì)?？寺〉谋磉_(dá)庫(kù)，每個(gè)克隆隨機(jī)包含ASFV基因組的Sau3AI限制性片段（p54、p30和血凝素）融合到泛素，用該表達(dá)庫(kù)免疫豬，對(duì)E75 強(qiáng)毒株致死攻擊的保護(hù)率為60%，表明ASFV基因組中存在額外的保護(hù)性決定因素。

2.3.3 病毒活載體疫苗

細(xì)胞免疫在ASF防控中扮演重要角色，而CTL的效應(yīng)更是免疫效果的保證，因此，可利用病毒活載體在機(jī)體內(nèi)持續(xù)復(fù)制與表達(dá)的特性研制病毒活載體疫苗。目前，常用腺病毒、偽狂犬病病毒、牛痘病毒或新城疫病毒作為載體構(gòu)建疫苗，可有效刺激細(xì)胞免疫和CTL 效應(yīng)。S. Lokhandwala等[32-33]研制的腺病毒載體的非洲豬瘟病毒抗原具有免疫原性，能引起豬強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，但不能抵御強(qiáng)毒株的攻擊[34-35]。表明病毒活載體疫苗免疫保護(hù)效力需要進(jìn)一步評(píng)價(jià)。

3 小 結(jié)

ASF在國(guó)內(nèi)已得到有效控制，但其危害性不可忽視，研發(fā)安全有效的ASFV疫苗仍是當(dāng)下亟須解決的問(wèn)題。目前，在ASFV 基因序列、功能結(jié)構(gòu)、入侵方式及宿主對(duì)其免疫應(yīng)答等方面的研究取得了較大進(jìn)展，并嘗試了多類別的疫苗研發(fā)，雖獲得了一定的效果，但仍沒(méi)改變尚無(wú)有效疫苗可用的現(xiàn)狀，應(yīng)持續(xù)深入加強(qiáng)病毒與宿主相互作用的基礎(chǔ)性研究。弱毒活疫苗能持續(xù)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，成為可提供高效、安全的保護(hù)性疫苗的首選，但毒力返強(qiáng)問(wèn)題是其致命弱點(diǎn)，因此采用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)，敲除毒力基因，獲得減毒基因缺失株是研制疫苗值得關(guān)注的研究方向。同時(shí)，更高效的免疫佐劑探索、更多的抗原位點(diǎn)識(shí)別研究及多種疫苗的相互聯(lián)用，也是今后值得關(guān)注的方向。此外，高效安全的特異性疫苗雖是防治ASF的最佳手段，但在疫苗研制舉步維艱的情況下，可采用針對(duì)病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制過(guò)程來(lái)抑制病毒增殖，如RNA 干擾技術(shù)、有機(jī)試劑阻斷技術(shù)等，同時(shí)要持續(xù)加強(qiáng)生物安全風(fēng)險(xiǎn)控制，切斷病毒傳播途徑，同樣也能達(dá)到防控ASF的目的。