miR-485-5p靶向調(diào)節(jié)婆羅雙樹樣基因4/莫洛尼白血病毒插入點1對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、遷移及凋亡影響

朱冠婭， 徐俊賜， 蔣 航， 薛春利， 李 挺， 楊祖賢

惠州市中心人民醫(yī)院 燒傷外科，廣東 惠州 516000

瘢痕疙瘩是皮膚纖維增生性疾病，常伴有疼痛、瘙癢、畸形甚至主要功能障礙，對患者危害極大。微小RNA(micro RNA，miRNA)在包括癌變、成纖維細胞活化與細胞外基質(zhì)代謝等許多生物過程中作為表觀遺傳調(diào)節(jié)因子產(chǎn)生作用[1]。與正常皮膚組織相比，瘢痕疙瘩病變組織中264種miRNA發(fā)生顯著改變，miR-21與miR-199a-5P均參與瘢痕疙瘩的增殖、遷移及凋亡[2-4]。miR-485-5p是一種腫瘤抑制因子，與多種癌癥細胞增殖、遷移及侵襲有關(guān)，包括胃癌、卵巢癌與肝癌癌[5]。婆羅雙樹樣基因4(sal-like protein 4，SALL4)為與瘢痕疙瘩過度形成相關(guān)的關(guān)鍵纖維化細胞因子[6]。莫洛尼白血病毒插入點1(B-cell specific moloney leukemia virus insertion site-1，BMI-1)基因蛋白是第一個被SALL4識別的蛋白質(zhì)，作為基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件發(fā)揮關(guān)鍵作用[7]。BMI-1表達增加可能導致器官的組織纖維化及疤痕形成。miR-485-5p可通過誘導正反饋回路激活SALL4/BMI-1信號傳導，這是腎纖維化的重要組成誘因[8]。本研究旨在探討miR-485-5p靶向調(diào)節(jié)SALL4/BMI-1對瘢痕疙瘩成纖維細胞(keloid fibroblasts，KFBs)增殖、遷移及凋亡的影響。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基、10%的胎牛血清、青霉素、鏈霉素(中國碧云天生物科技)、miR-485-5p pcDNA3.1低表達載體、空白載體(miR-NC)、噻唑藍染料、二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、碘化丙啶、TRIzol試劑、二辛可寧酸蛋白質(zhì)測定試劑盒(中國Beyotime)、抗SALL4、BMI-1、GAPDH抗體的特異性一抗、辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗、化學發(fā)光試劑(chemiluminescent reagents，ECL)試劑盒(中國Beyotime)等。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料 選取自2021年5月至2022年5月惠州市中心人民醫(yī)院收治的21例瘢痕疙瘩患者為研究對象。其中，男性14例，女性7例；年齡17～54歲，平均年齡(33.02±9.16)歲；病程9～26個月，平均(14.54±4.72)個月。所有患者均符合2018年中國瘢痕疙瘩臨床治療指南中瘢痕疙瘩診斷標準[9]，未接受冷凍、激光、放射治療和糖皮質(zhì)激素類藥物注射。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準?；颊呔炇鹬橥鈺?/p>

1.2.2 細胞培養(yǎng)及分組 無菌條件下切取人瘢痕疙瘩組織，分離培養(yǎng)成KFBs細胞。將KFBs細胞分為miR-NC組(空白載體)、KFBs細胞組、miR-485-5p inhibitor組(miR-485-5p低表達)、miR-485-5p mimics組(miR-485-5p過表達)。miR-NC、miR-485-5p inhibitor、miR-485-5p mimics載體使用 Lipofectamine?2000 試劑于 37℃進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后72 h后繼續(xù)實驗。

1.2.3 KFBs細胞活力檢測 應用噻唑藍比色法測定細胞增殖水平。細胞以5×103個/孔的初始密度，接種在96孔板上。細胞采用100 μl無菌MTT染料在37℃下染色4 h，然后去除培養(yǎng)基,加入DMSO。在參考波長570 nm處測量吸光度(optical density，OD)。

1.2.4 KFBs細胞凋亡測定 通過胰蛋白酶消化收集細胞，固定于70%乙醇中，離心，并在磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)中孵育。離心后，將細胞離心、洗滌并在黑暗中標記15 min。采用流式細胞儀測量樣本，計算凋亡細胞百分比。

1.2.5 KFBs細胞侵襲水平測定 通過transwell測定法進行評估侵襲能力。將無血清培養(yǎng)基中1×105個細胞接種到涂有Matrigel插入物的上室中。將含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基添加到下室中。孵育24 h后，用脫脂棉去除上膜殘留細胞。已侵襲入膜的細胞采用甲醇與0.1%結(jié)晶紫染色成像，并采用倒置顯微鏡計數(shù)。實驗獨立重復3次。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?野生型(Wt)與突變型(Mut)SALL4 3′-非翻譯區(qū)域(untranslated region，UTR)分別克隆到psiCHECK-2熒光素酶報告質(zhì)粒。將KFBs與SALL4 3′-UTR報告質(zhì)粒、miR-485-5p模擬或?qū)φ展厕D(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48 h，采用雙熒光素酶報告分析。

1.2.7 KFBs細胞SALL4、miR-485-5p表達水平測定 將細胞系制備成細胞懸液，添加TRIzol試劑提取細胞總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄酶從500 ng總RNA合成cDNA。采用miScript Reverse Transcription Kit將miRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過實時聚合酶鏈反應測量RNA表達。引物序列為：SALL4正向5′-TCGCGGCTAGTCGCTGCTGATCGATCGTAGCTGCC-3′，SALL4反向5′-TGGCTGATCGATCGATGCTAGCTAGCTGTCGC-3′；BMI-1正向5′-TGGTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAG CTAGCTAGT-3′，BMI-1反向5′-TGGGCTAGCTAGCTAGCT AGCTAGCTAGC-3′；GAPDH正向，5′-TGCGCGATCG CGCAGCGATCGATCGATGCCC-3′，GAPDH反向5′-TGGGCT AGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGTCGCA-3′。采用2-ΔΔCt計算SALL4、BMI-1的相對表達水平。

1.2.8 KFBs細胞SALL4、BMI-1表達水平測定 通過二辛可寧酸蛋白質(zhì)測定試劑盒定量蛋白質(zhì)。采用5%脫脂奶粉在PBS中封閉1 h后，將膜分別與SALL4、BMI-1一抗在4℃下孵育過夜。將膜與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗孵育。結(jié)合抗體量用ECL檢測試劑檢測。測量條帶的相對光密度，比較4組KFBs細胞靶蛋白的表達水平。

2 結(jié)果

2.1 4組KFBs細胞OD值、存活率比較 與miR-485-5p inhibitor組比較，KFBs細胞組、miR-NC組、miR-485-5p mimics組OD值、存活率均降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與KFBs細胞組比較，miR-485-5p inhibitor組OD值、存活率均升高，miR-485-5p mimics組OD值、存活率均降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 4組KFBs細胞OD值、存活率比較

2.2 4組KFBs細胞凋亡率比較 KFBs細胞組、miR-NC組、miR-485-5p inhibitor組、miR-485-5p mimics組細胞凋亡率分別為(6.09%±1.92%)、(6.74%±2.15%)、(0.92%±0.30%)、(9.80%±2.92%)。與KFBs細胞組比較，miR-485-5p inhibitor組細胞凋亡率降低，miR-485-5p mimics組細胞凋亡率升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與miR-485-5p inhibitor組比較，miR-485-5p mimics組細胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3 4組KFBs細胞遷移能力比較 KFBs細胞組、miR-NC組、miR-485-5p inhibitor組、miR-485-5p mimics組穿膜數(shù)分別為(896.21±24.89)個、(859.96±25.54)個、(1 625.49±23.51)個、(402.30±42.25)個。與KFBs細胞組比較，miR-485-5p inhibitor組穿膜數(shù)升高，miR-485-5p mimics組穿膜數(shù)降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與miR-485-5p inhibitor組比較，miR-485-5p mimics組穿膜數(shù)降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4 miR-485-5p對SALL4的靶向調(diào)節(jié)作用 螢光素酶結(jié)果顯示，miR-485-5p過表達可明顯降低SALL4-wt的熒光素酶活性，miR-485-5p低表達可明顯提升SALL4-wt的熒光素酶活性，miR-485-5p與SALL4存在靶向調(diào)節(jié)作用。

2.5 4組KFBs細胞miR-485-5p、SALL4、BMI-1 mRNA表達水平比較 與KFBs細胞組比較，miR-485-5p inhibitor組miR-485-5p降低，SALL4、BMI-1 mRNA升高，miR-485-5p mimics組細胞miR-485-5p升高，SALL4、BMI-1 mRNA降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與miR-485-5p inhibitor組比較，miR-485-5p mimics組miR-485-5p升高，SALL4、BMI-1 mRNA降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 4組KFBs細胞miR-485-5p、SALL4、BMI-1 mRNA表達水平比較

2.6 4組KFBs細胞SALL4、BMI-1蛋白表達水平比較 與KFBs細胞組比較，miR-485-5p inhibitor組細胞SALL4、BMI-1蛋白升高，miR-485-5p mimics組細胞SALL4、BMI-1蛋白降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與miR-485-5p inhibitor組比較，miR-485-5p mimics組單細胞SALL4、BMI-1蛋白降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 4組KFBs細胞SALL4、BMI-1蛋白表達水平比較

3 討論

miRNA為高度保守的非編碼 RNA，調(diào)控細胞增殖、分化、發(fā)育、代謝和細胞凋亡，miRNA在腫瘤中充當抑癌基因或原癌基因。瘢痕疙瘩是異常增生，與良性腫瘤相似，在真皮細胞中呈現(xiàn)舌狀前進邊緣，類似于侵襲性腫瘤生長[10]。miRNA參與調(diào)節(jié)成纖維細胞的生物學表型以參與瘢痕疙瘩的發(fā)病機制[10]。miR-21在瘢痕疙瘩組織中上調(diào)，抑制miR-21可加速KFBs凋亡。作為一種高度保守的miRNA，miR-485-5p參與了細胞內(nèi)多種生物學事件的調(diào)節(jié)，包括細胞周期停滯、促進細胞衰老、誘導細胞凋亡、阻止細胞遷移。

本研究結(jié)果顯示，與KFBs細胞組、miR-NC組比較，miR-485-5p inhibitor組OD值、存活率、穿膜數(shù)升高，miR-485-5p mimics組OD值、存活率、穿膜數(shù)降低(P<0.05)。這說明，miR-485-5p顯著抑制KFBs增殖、遷移和促進細胞凋亡。miRNA主要通過作用于靶基因作為腫瘤抑制基因或癌基因。有研究發(fā)現(xiàn)，SALL4的3′UTR含有與miR-485-5p互補的核苷酸序列，miR-485-5p可能靶向調(diào)節(jié)SALL4的表達。既往研究證明，SALL4 為纖維化疾病中的關(guān)鍵信號蛋白，參與器官組織纖維化和病理性傷口愈合進展。然而，SALL4 在調(diào)節(jié)瘢痕疙瘩形成中的確切作用仍然未知。BMI-1是一種促纖維化劑，可通過經(jīng)典的Smads和Erk磷酸化途徑促進細胞外基質(zhì)，尤其是膠原蛋白的合成[11-13]。SALL4誘導BMI-1磷酸化并增加人Ⅲ型膠原表達。既往研究表明，磷酸化絲裂原活化蛋白激酶1/2在BMI-1介導的膠原合成中發(fā)揮協(xié)同作用，這是由BMI-1在一些纖維化疾病細胞(如人真皮成纖維細胞和肌成纖維細胞)中過表達所引起[14-15]。本研究熒光素酶報告基因檢測結(jié)果表明，miR-485-5p mimic可降低SALL4野生型的熒光素酶活性。這提示，miR-485-5p可與3′ SALL4 靶向結(jié)合位點的UTR。此外，上調(diào)KFBs中miR-485-5p的表達后，SALL4蛋白的表達下調(diào)，下調(diào)miR-485-5p的表達后，SALL4蛋白的表達上調(diào)，進一步證實了KFBs中miR-485-5p可以負調(diào)節(jié)SALL4的表達。有研究發(fā)現(xiàn)，血管平滑肌細胞中的BMI-1/SALL4以時間依賴性方式影響蘇氨酸蛋白激酶的磷酸化，并因SALL4的過表達而增強[16-20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與KFBs細胞組比較，miR-485-5p inhibitor組miR-485-5p降低，SALL4、BMI-1 mRNA升高，miR-485-5p mimics組細胞miR-485-5p升高，SALL4、BMI-1 mRNA降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。這說明，miR-152-5p靶向調(diào)節(jié)SALL4，同時抑制BMI-1表達，進而抑制了SALL4/BMI-1通路的激活。

綜上所述，miR-485-5p過表達可顯著抑制KFBs增殖、遷移，促進細胞凋亡，其機制可能與miR-152-5p靶向調(diào)節(jié)SALL4，同時抑制BMI-1表達，進而抑制SALL4/BMI-1通路的激活有關(guān)。