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    外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞、EB病毒DNA水平對(duì)鼻咽癌患者預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值

    2023-03-02 01:56:52黃偉義梁錦輝劉家豪董良哲程宇文羅泳林顏建業(yè)寧錦燕
    臨床軍醫(yī)雜志 2023年2期
    關(guān)鍵詞:鼻咽癌外周血陰性

    黃偉義, 梁錦輝, 劉家豪, 鄧 濱, 董良哲, 程宇文, 羅泳林, 顏建業(yè), 寧錦燕, 陳 永

    梧州市紅十字會(huì)醫(yī)院 腫瘤科,廣西 梧州 543200

    鼻咽癌是頭頸部常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,早期不易被發(fā)現(xiàn),80%的患者就診時(shí)已為中晚期。放射治療是鼻咽癌的主要治療方法[1],調(diào)強(qiáng)放療后患者5年總存活率可達(dá)80%以上,但仍有約30%的患者治療失敗,主要原因?yàn)榫植繀^(qū)域復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2]。測(cè)定患者鼻咽癌組織或血清、血漿中分子標(biāo)志物,預(yù)測(cè)治療后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移危險(xiǎn)度,精準(zhǔn)識(shí)別高?;颊撸欣谠缙趯?duì)患者進(jìn)行個(gè)體化治療,從而降低復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率,改善患者預(yù)后[3-4]。目前,多數(shù)鼻咽癌相關(guān)轉(zhuǎn)移標(biāo)志物存在敏感性差、特異性差的問(wèn)題,進(jìn)一步尋找具有較高敏感性、特異性的標(biāo)志物尤為重要[5]。外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumorcells,CTCs)、EB病毒DNA(EB virus DNA,EBV-DNA)水平與鼻咽癌復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān),監(jiān)測(cè)CTCs可早于常規(guī)影像學(xué)檢查手段預(yù)估腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[6]。本研究旨在探討外周血CTCs、EBV-DNA水平對(duì)鼻咽癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值?,F(xiàn)報(bào)道如下。

    1 對(duì)象與方法

    1.1 研究對(duì)象 選取自2018年3月至2019年3月梧州市紅十字會(huì)醫(yī)院收治的100例鼻咽癌患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)[7]:(1)經(jīng)病理組織學(xué)確診為鼻咽癌;(2)入組前未接受過(guò)手術(shù)或局部放化療治療;(3)預(yù)計(jì)生存期>6個(gè)月。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并其他惡性腫瘤;(2)合并心、肝、腎等臟器功能衰竭;(3)不愿配合本研究。其中,男性54例,女性46例;年齡32~75歲,平均(48.8±4.6)歲;病理類型:低分化型37例,中分化型48例,高分化型15例;T分期:T1期22例,T2期34例,T3期24例,T4期20例;臨床分期:ⅢB期58例,Ⅳ期42例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有患者均簽署知情同意書(shū)。

    1.2 研究方法

    1.2.1 治療方法 Ⅰ~Ⅱ期患者接受根治性放療;Ⅲ~Ⅳ期患者接受 2~3個(gè)周期的誘導(dǎo)化療(PF/TPF/GP方案),然后行根治性同步放化療,鼻咽部劑量為68~70 Gy/33 F,頸部陽(yáng)性淋巴結(jié)劑量為66~70 Gy/33 F,預(yù)防照射劑量為54 Gy/33 F。

    1.2.2 CTCs檢測(cè)方法 采集患者清晨空腹靜脈血5 ml,EDTA抗凝。微孔濾膜過(guò)濾法分離外周血CTCs,采用專用的細(xì)胞染色液進(jìn)行染色,CTCBIOPSY?檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自武漢友芝友醫(yī)療科技有限公司。原位雜交技術(shù)檢測(cè)EB病毒編碼的RNAs(EBERs),確定受檢外周血中鼻咽癌CTCs及其數(shù)量,EBERs原位雜交試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。將貼有濾膜的載玻片依次放入100%乙醇、95%乙醇、75%乙醇中脫色;0.4%胃蛋白酶消化10 min;EBERs探針雜交過(guò)夜;信號(hào)檢測(cè)采用過(guò)氧化物酶結(jié)合抗地高辛抗體和3,30-二氨基聯(lián)苯胺;蘇木精復(fù)染。陽(yáng)性信號(hào)呈棕黃色,局限于細(xì)胞核內(nèi)。

    1.2.3 CTCs判斷標(biāo)準(zhǔn) 在光學(xué)顯微鏡下觀察CTCs形態(tài)學(xué)特征。(1)細(xì)胞體積較大,呈圓形、橢圓形或梭形,長(zhǎng)徑>10 μm。(2)細(xì)胞核異型性,呈折疊、扭曲、結(jié)節(jié)或分葉狀等;核深染且著色不均勻,核膜增厚,出現(xiàn)凹陷或褶皺;核偏位,或巨大核仁。(3)多數(shù)核質(zhì)比>0.8。同一個(gè)標(biāo)本中符合上述標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞≥2個(gè)為CTCs陽(yáng)性[8]。

    1.2.4 EBV-DNA測(cè)定 在10%胎牛血清中培養(yǎng)CNE1鼻咽癌細(xì)胞系,分別加入100 U/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素,以含EBV B95-8細(xì)菌株構(gòu)建BAC質(zhì)粒,設(shè)計(jì)EBER1同源重組正向引物,按照Trizol法提取鼻咽癌細(xì)胞EBV-RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,根據(jù)CFX-96 PCR系統(tǒng)設(shè)計(jì)反應(yīng)引物,采用熒光定量PCR測(cè)定EBV-DNA。

    1.3 觀察指標(biāo) 隨訪12.5~33.4個(gè)月,中位隨訪時(shí)間為25.6個(gè)月。記錄患者無(wú)進(jìn)展生存期(progression free survival,PFS)、總生存期(overall survival,OS)。

    2 結(jié)果

    2.1 患者局部復(fù)發(fā)和(或)轉(zhuǎn)移發(fā)生情況 將CTCs和(或)EBV-DNA陽(yáng)性的患者納入陽(yáng)性組(n=81),將CTCs和EBV-DNA陰性的患者納入陰性組(n=19)。陰性組治療前、治療后1個(gè)月、治療后3個(gè)月的局部復(fù)發(fā)和(或)轉(zhuǎn)移發(fā)生率均低于陽(yáng)性組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

    表1 患者局部復(fù)發(fā)和(或)轉(zhuǎn)移發(fā)生情況/例(百分率/%)

    2.2 CTCs陰性與陽(yáng)性患者PFS、OS比較 CTCs陽(yáng)性患者PFS、OS分別為(4.22±0.98)個(gè)月、(7.14±1.02)個(gè)月,均短于CTCs陰性患者的(7.14±1.02)個(gè)月、(18.36±2.47)個(gè)月,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    3 討論

    鼻咽癌發(fā)生與遺傳有關(guān),同時(shí)受環(huán)境、病毒等因素的影響,最后于鼻咽位置形成腫瘤[9]。臨床多選擇手術(shù)、化療等方式對(duì)其進(jìn)行治療[10]。有研究報(bào)道,80%的鼻咽癌患者可通過(guò)對(duì)癥治療達(dá)到控制病情的目的,同時(shí)延長(zhǎng)生存時(shí)間[11]。在此期間,臨床可通過(guò)監(jiān)測(cè)病理參數(shù)分析患者病情,如CTCs、EBV-DNA等[12]。與腫瘤組織樣本比較,血液樣本更易獲取、創(chuàng)傷性小、可反復(fù)采集,是臨床常規(guī)檢測(cè)較為理想的標(biāo)本來(lái)源[13]。有研究報(bào)道,CTCs檢測(cè)有助于腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移監(jiān)控,判斷患者預(yù)后,可指導(dǎo)術(shù)后輔助治療等[14]。CTCs常以多種形態(tài)分布在機(jī)體的外周血內(nèi),即可呈單個(gè)游離狀態(tài),也可聚集成團(tuán),同時(shí)可隨著血液進(jìn)入淋巴系統(tǒng),轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞[15]。

    本研究中,CTCs和EBV-DNA陰性患者治療前、治療后1個(gè)月、治療后3個(gè)月的局部復(fù)發(fā)和(或)轉(zhuǎn)移發(fā)生率均低于CTCs和(或)EBV-DNA陽(yáng)性患者。CTCs變化可以反映腫瘤的增殖活性及對(duì)治療的敏感性,CTCs持續(xù)增多提示腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[16]。EBV-DNA作為診斷鼻咽癌的重要方式,能夠觀察到EB病毒的DNA情況,若結(jié)果顯示陽(yáng)性,提示患者機(jī)體中存在EB病毒感染,需及時(shí)采取對(duì)應(yīng)的抗病毒藥物進(jìn)行治療[17]。有研究報(bào)道,EBV-DNA作為非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒,其水平一旦>500份/mm,提示患者預(yù)后極差[18]。此外,治療后腫瘤轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)患者的治療前血漿EBV-DNA拷貝數(shù)較未出現(xiàn)臨床進(jìn)展患者高,治療前血漿EBV-DNA水平可以作為鼻咽癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素,血漿EBV-DNA水平每升高10倍,腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)度就會(huì)增加[19-21]。

    本研究結(jié)果顯示,陰性組治療前、治療后1個(gè)月、治療后3個(gè)月的局部復(fù)發(fā)和(或)轉(zhuǎn)移發(fā)生率均低于陽(yáng)性組,提示CTCs和(或)EBV-DNA陽(yáng)性為腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素,可以作為鼻咽癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。本研究從鼻咽癌患者化療結(jié)束后隨訪至2020年6月,隨訪結(jié)束時(shí),化療前CTCs陽(yáng)性患者PFS、OS短于CTCs陰性患者(P<0.05),提示CTCs為腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素,可以作為鼻咽癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。

    綜上所述,CTCs、EBV-DNA陽(yáng)性鼻咽癌患者的局部復(fù)發(fā)和(或)轉(zhuǎn)移發(fā)生率升高,CTCs、EBV-DNA陽(yáng)性提示預(yù)后不良。

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