崔立穎, 唐 君, 程 浩, 嵇 晴
南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院 麻醉科,江蘇 南京 210000
奧沙利鉑是第三代鉑類化療藥,被廣泛用于治療結(jié)直腸癌,其抗腫瘤作用較強(qiáng),但神經(jīng)毒性顯著,長期應(yīng)用該藥誘發(fā)的嚴(yán)重神經(jīng)病理性疼痛,發(fā)病率高達(dá)60%[1-2]。奧沙利鉑誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛(Oxaliplatin induced neuropathic pain,OINP)主要表現(xiàn)為明顯的機(jī)械痛覺過敏、熱痛覺過敏和冷痛覺過敏[3]。目前,對于OINP的治療效果不佳,極大影響患者的生活質(zhì)量。因此,積極探索OINP發(fā)生的分子機(jī)制,尋求其治療靶點(diǎn),仍然是目前的研究重點(diǎn)[4]。近年來,有研究報道,參與神經(jīng)炎癥的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是造成慢性疼痛難以治愈的關(guān)鍵因素[5]。星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)較豐富的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,當(dāng)機(jī)體受到傷害性刺激后,星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活并可以活化為神經(jīng)毒性A1表型星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)保護(hù)A2表型星形膠質(zhì)細(xì)胞兩種形態(tài)[6]。OINP模型大鼠中星形膠質(zhì)細(xì)胞活化,而小膠質(zhì)細(xì)胞未見活化,因此,進(jìn)一步闡明星形膠質(zhì)細(xì)胞在OINP中的具體作用對于其治療意義重大[7]。N-myc下游調(diào)節(jié)基因2(N-myc downstream regulated gene 2,NDRG2)是特異性表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞的一種早期應(yīng)激反應(yīng)基團(tuán)[8-9]。筆者研究曾發(fā)現(xiàn),NDRG2與慢性神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生機(jī)制密切相關(guān),在脊神經(jīng)結(jié)扎誘導(dǎo)的慢性疼痛過程中,NDRG2表達(dá)顯著增高并調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)增生[10]。本研究旨在探討星形膠質(zhì)細(xì)胞NDRG2是否參與OINP,并探討其對脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞表型分化的影響?,F(xiàn)報道如下。
1.1 實(shí)驗動物 選取清潔級(SPF級)雄性SD大鼠32只,周齡6~7周,體質(zhì)量180~220 g,購于南京卡萊斯生物科技有限公司,飼養(yǎng)于南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院(東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院)實(shí)驗動物中心。所有的實(shí)驗操作方案均通過南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會審核,且符合國際疼痛研究協(xié)會關(guān)于動物實(shí)驗倫理的相關(guān)規(guī)定。
1.2 實(shí)驗分組 實(shí)驗分為兩部分。第一部分:將16只雄性大鼠隨機(jī)分為兩組:Vehicle組(n=8),0~4 d腹腔注射5%葡萄糖溶液;Oxaliplatin組(n=8),用5%葡萄糖注射液將奧沙利鉑(MCE公司,南京)配置成2 mg/ml的溶液,0~4 d連續(xù)5 d腹腔注射奧沙利鉑溶液,構(gòu)建OINP模型[11]。第二部分:將16只雄性大鼠隨機(jī)分為兩組,兩組均采用上述方法構(gòu)建OINP模型,對照腺病毒+OINP組(AD-control+OINP組,n=8),奧沙利鉑腹腔注射前3 d鞘內(nèi)注射2×108PFU AD-control;Ndrg2干擾腺病毒(AD-Ndrg2-RNAi)+OINP組(AD-Ndrg2-RNAi+OINP組,n=8),奧沙利鉑腹腔注射前3 d鞘內(nèi)注射2×108PFU AD-Ndrg2-RNAi。鞘內(nèi)注射具體方法:麻醉大鼠后,以L5-6為中點(diǎn),緊貼脊柱兩側(cè)縱行切開1.5 cm,去除L5-6棘突之間軟組織,充分顯露骨性結(jié)構(gòu),將PE10導(dǎo)管向頭端置入椎管內(nèi),置入導(dǎo)管深度為2.0 cm,建立皮下隧道,將導(dǎo)管外端固定于頸部,熱熔封口[12]。利多卡因驗證位置后,注射病毒。
1.3 行為學(xué)測定 第一部分實(shí)驗分別在給藥0、7、11、18、25 d測定機(jī)械縮足閾值(mechanical withdrawal threshold,MWT)和熱縮足潛伏期(thermal withdrawal latency,TWL)。第二部分實(shí)驗分別在給藥0、11 d測定MWT和TWL。MWT具體測定方法:將大鼠置于金屬鐵絲網(wǎng)高架上,適應(yīng)15~30 min后,選用8根von frey纖維絲,將纖維絲垂直刺入大鼠足部中部,持續(xù)8 s,采用Up-down法計算MWT[13]。TWL具體測定方法:將大鼠置于有機(jī)玻璃上,輻射大鼠后爪足部中央,記錄開始輻射至出現(xiàn)縮足反應(yīng)的時間為TWL[14]。
1.4 蛋白免疫印跡 取各組大鼠脊髓腰膨大,使用RIPA裂解液提取總蛋白,BCA法測定蛋白濃度,加入上樣緩沖液煮沸變性,SDS-PAGE電泳,濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%牛奶封閉1 h,一抗NDRG2(abcam,ab174850)、GFAP(CST,3670s)、C3(R&D,AF2655)、S100A10(Proteintech,11250-1-AP)、β-actin(Proteintech,66009-1-Ig)4℃孵育過夜,二抗(購自Proteintech)室溫孵育1 h,ECL發(fā)光成像。使用Image J對條帶進(jìn)行半定量分析。
1.5 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng) 取各組大鼠脊髓腰膨大,使用TRIzol提取組織RNA,將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,配置定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)體系,并在7500 Real Time PCR儀器進(jìn)行檢測,以Gapdh作為內(nèi)參對照,用2-ΔΔCT進(jìn)行相對定量。引物序列如下:Gapdh上游5′-GGATGCTGCCCTTACCC-3′,下游5′-GTTCACACCGACCTTC--ACC-3′;Ndrg2上游5-′GAATTCTA-TGGCAGAGCTTCAGGAGGT-3′,下游5′-GGATCCTCAACAGGAGACTTCCATGGT-3′;C3上游5′-CACAGCGGCACATTTCAT-3′,下游5′-GGGGTCGGTCAAGGTCTA-3′;S1000a10上游5′-GAAAGGGAGTTCCCTGGGTT-3′,下游5′-CCCACTTTTCCATCTCGGCA-3′。
1.6 免疫熒光 分離脊髓腰膨大,4%多聚甲醛溶液固定4 h,再脫水、OCT包埋、冰凍切片機(jī)切取25 μm脊髓切片,5%驢血清封閉1 h,一抗(GFAP、NDRG2及C3)4℃孵育過夜,熒光二抗室溫孵育1 h,封片。熒光顯微鏡觀察結(jié)果。
2.1 奧沙利鉑腹腔注射后MWT及TWL的變化 雄性SD大鼠連續(xù)5 d腹腔注射奧沙利鉑,成功構(gòu)建OINP模型。造模前,Vehicle組與Oxaliplatin組的MWT和TWL比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。腹腔注射奧沙利鉑7、11、18、25 d,Vehicle組的MWT、TWL均高于Oxaliplatin組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。
圖1 OINP大鼠MWT、TWL變化情況
2.2 OINP大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞激活及A1、A2表型星形膠質(zhì)細(xì)胞分化改變 Oxaliplatin組脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP蛋白含量、A1表型星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物C3蛋白含量均高于Vehicle組,而A2表型星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物S100A10蛋白含量低于Vehicle組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。免疫熒光顯示,與Vehicle組比較,Oxaliplatin組GFAP及C3熒光強(qiáng)度增加。見圖3。
圖2 OINP大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP、A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物C3和A2型星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物S100A10的表達(dá)改變 圖3 OINP大鼠脊髓背角GFAP及C3熒光表達(dá)(比例尺:50 μm)
2.3 大鼠脊髓NDRG2表達(dá)改變 Oxaliplatin組脊髓NDRG2蛋白含量顯著高于Vehicle組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。免疫熒光顯示,與Vehicle組比較,Oxaliplatin組NDRG2熒光強(qiáng)度增加。見圖5。
圖4 OINP大鼠脊髓NDRG2的表達(dá)改變 圖5 OINP大鼠脊髓背角GFAP及NDRG2熒光表達(dá)(比例尺:50 μm)
2.4Ndrg2干擾對脊髓NDRG2蛋白含量及mRNA含量的影響 AD-Ndrg2-RNAi+OINP組NDRG2蛋白含量及Ndrg2相對mRNA含量顯著低于AD-control+OINP組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)見圖6。
圖6 Ndrg2干擾后脊髓NDRG2蛋白及mRNA含量表達(dá)改變
2.5Ndrg2干擾對OINP大鼠疼痛行為學(xué)的影響 給藥11 d,AD-Ndrg2-RNAi+OINP組的MWT和TWL顯著高于AD-control+OINP組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖7。
圖7 脊髓Ndrg2干擾后OINP大鼠MWT和TWL的變化情況
2.6Ndrg2干擾對脊髓A1、A2表型星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的影響 AD-Ndrg2-RNAi+OINP組A1表型星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物C3的蛋白含量及mRNA含量低于AD-control+OINP組,而A2表型星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物S100A10的蛋白含量及mRNA含量顯著高于AD-control+OINP組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖8。
圖8 脊髓Ndrg2干擾后OINP大鼠C3和S100A10蛋白及mRNA表達(dá)改變
奧沙利鉑屬于鉑類化合物,通過與細(xì)胞DNA結(jié)合并交聯(lián)發(fā)揮化學(xué)治療作用,目前,臨床上被廣泛用于治療肺癌、乳腺癌、卵巢癌和結(jié)腸癌等。奧沙利鉑對神經(jīng)元有顯著毒性,除了病理性疼痛,還可引起癲癇發(fā)作、腦水腫、中風(fēng)和視覺損傷[15]。奧沙利鉑誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)病變在停藥后不可逆轉(zhuǎn),甚至其神經(jīng)損傷可能加重[16]。本研究通過腹腔注射奧沙利鉑溶液構(gòu)建了OINP模型,在不同時間點(diǎn)分別檢測了奧沙利鉑腹腔注射后的機(jī)械痛覺敏感性和熱痛覺敏感性,大鼠MWT和TWL出現(xiàn)了顯著而持久的下降,驗證了奧沙利鉑引起了典型的神經(jīng)病理性疼痛。
在外周神經(jīng)損傷后,反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞可以分化為神經(jīng)毒性A1表型和神經(jīng)保護(hù)性A2表型[17]。神經(jīng)毒性A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞失去促進(jìn)神經(jīng)元存活、生長、突觸發(fā)生和吞噬作用的能力,并誘導(dǎo)神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡。A1星型膠質(zhì)細(xì)胞高度存在于人類神經(jīng)退行性疾病中,包括阿爾茲海默病、亨廷頓病、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化和多發(fā)性硬化癥等[18-20]。近年來,有研究報道,在慢性手術(shù)后疼痛中,星形膠質(zhì)細(xì)胞向A1表型分化,而恢復(fù)A1/A2比例可以緩解皮膚肌肉損傷引起的機(jī)械性疼痛[21]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),在OINP模型中,大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生激活,GFAP和C3蛋白表達(dá)顯著增加,伴隨S100A10蛋白表達(dá)顯著降低,同時,大鼠的疼痛行為學(xué)發(fā)生改變,表明奧沙利鉑腹腔注射誘導(dǎo)脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞增生活化,并誘導(dǎo)向A1表型分化,提示神經(jīng)毒性A1表型星形膠質(zhì)細(xì)胞參與OINP的發(fā)生發(fā)展過程。
NDRG2廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi),并且特異性表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi),參與調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生,在阿爾茲海默病、缺血再灌注損傷、實(shí)驗性自身免疫性腦脊髓炎等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用[22-24]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn),NDRG2在脊神經(jīng)結(jié)扎誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用[10]。在本研究中,鞘內(nèi)注射病毒干擾脊髓Ndrg2表達(dá)能夠?qū)е滦坌設(shè)INP大鼠的MWT及TWL顯著增加,顯著緩解奧沙利鉑誘導(dǎo)的機(jī)械痛和熱痛。同時,本研究還發(fā)現(xiàn),干擾脊髓Ndrg2,可以顯著抑制A1表型星形膠質(zhì)細(xì)胞分化,增加A2表型星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。這表明,NDRG2參與調(diào)節(jié)了星形膠質(zhì)細(xì)胞的極化,提示NDRG2可能通過調(diào)節(jié)反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的表型分化,從而促進(jìn)OINP的發(fā)生發(fā)展。
綜上所述,脊髓背角NDRG2促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)毒性A1表型分化,從而促進(jìn)OINP雄性大鼠產(chǎn)生機(jī)械痛覺過敏和熱痛覺過敏,為治療OINP提供潛在的干預(yù)靶點(diǎn)。