脊髓N-myc下游調(diào)節(jié)基因2對(duì)奧沙利鉑誘導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛及星形膠質(zhì)細(xì)胞分化影響

崔立穎， 唐 君， 程 浩， 嵇 晴

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院 麻醉科，江蘇 南京 210000

奧沙利鉑是第三代鉑類化療藥，被廣泛用于治療結(jié)直腸癌，其抗腫瘤作用較強(qiáng)，但神經(jīng)毒性顯著，長期應(yīng)用該藥誘發(fā)的嚴(yán)重神經(jīng)病理性疼痛，發(fā)病率高達(dá)60%[1-2]。奧沙利鉑誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛(Oxaliplatin induced neuropathic pain，OINP)主要表現(xiàn)為明顯的機(jī)械痛覺過敏、熱痛覺過敏和冷痛覺過敏[3]。目前，對(duì)于OINP的治療效果不佳，極大影響患者的生活質(zhì)量。因此，積極探索OINP發(fā)生的分子機(jī)制，尋求其治療靶點(diǎn)，仍然是目前的研究重點(diǎn)[4]。近年來，有研究報(bào)道，參與神經(jīng)炎癥的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是造成慢性疼痛難以治愈的關(guān)鍵因素[5]。星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)較豐富的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，當(dāng)機(jī)體受到傷害性刺激后，星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活并可以活化為神經(jīng)毒性A1表型星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)保護(hù)A2表型星形膠質(zhì)細(xì)胞兩種形態(tài)[6]。OINP模型大鼠中星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，而小膠質(zhì)細(xì)胞未見活化，因此，進(jìn)一步闡明星形膠質(zhì)細(xì)胞在OINP中的具體作用對(duì)于其治療意義重大[7]。N-myc下游調(diào)節(jié)基因2(N-myc downstream regulated gene 2，NDRG2)是特異性表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞的一種早期應(yīng)激反應(yīng)基團(tuán)[8-9]。筆者研究曾發(fā)現(xiàn)，NDRG2與慢性神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生機(jī)制密切相關(guān)，在脊神經(jīng)結(jié)扎誘導(dǎo)的慢性疼痛過程中，NDRG2表達(dá)顯著增高并調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)增生[10]。本研究旨在探討星形膠質(zhì)細(xì)胞NDRG2是否參與OINP，并探討其對(duì)脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞表型分化的影響。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取清潔級(jí)(SPF級(jí))雄性SD大鼠32只，周齡6～7周，體質(zhì)量180～220 g，購于南京卡萊斯生物科技有限公司，飼養(yǎng)于南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院(東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有的實(shí)驗(yàn)操作方案均通過南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審核，且符合國際疼痛研究協(xié)會(huì)關(guān)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理的相關(guān)規(guī)定。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為兩部分。第一部分：將16只雄性大鼠隨機(jī)分為兩組：Vehicle組(n=8)，0～4 d腹腔注射5%葡萄糖溶液；Oxaliplatin組(n=8)，用5%葡萄糖注射液將奧沙利鉑(MCE公司，南京)配置成2 mg/ml的溶液，0～4 d連續(xù)5 d腹腔注射奧沙利鉑溶液，構(gòu)建OINP模型[11]。第二部分：將16只雄性大鼠隨機(jī)分為兩組，兩組均采用上述方法構(gòu)建OINP模型，對(duì)照腺病毒+OINP組(AD-control+OINP組，n=8)，奧沙利鉑腹腔注射前3 d鞘內(nèi)注射2×108PFU AD-control；Ndrg2干擾腺病毒(AD-Ndrg2-RNAi)+OINP組(AD-Ndrg2-RNAi+OINP組，n=8)，奧沙利鉑腹腔注射前3 d鞘內(nèi)注射2×108PFU AD-Ndrg2-RNAi。鞘內(nèi)注射具體方法：麻醉大鼠后，以L5-6為中點(diǎn)，緊貼脊柱兩側(cè)縱行切開1.5 cm，去除L5-6棘突之間軟組織，充分顯露骨性結(jié)構(gòu)，將PE10導(dǎo)管向頭端置入椎管內(nèi)，置入導(dǎo)管深度為2.0 cm，建立皮下隧道，將導(dǎo)管外端固定于頸部，熱熔封口[12]。利多卡因驗(yàn)證位置后，注射病毒。

1.3 行為學(xué)測(cè)定 第一部分實(shí)驗(yàn)分別在給藥0、7、11、18、25 d測(cè)定機(jī)械縮足閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)和熱縮足潛伏期(thermal withdrawal latency，TWL)。第二部分實(shí)驗(yàn)分別在給藥0、11 d測(cè)定MWT和TWL。MWT具體測(cè)定方法：將大鼠置于金屬鐵絲網(wǎng)高架上，適應(yīng)15～30 min后，選用8根von frey纖維絲，將纖維絲垂直刺入大鼠足部中部，持續(xù)8 s，采用Up-down法計(jì)算MWT[13]。TWL具體測(cè)定方法：將大鼠置于有機(jī)玻璃上，輻射大鼠后爪足部中央，記錄開始輻射至出現(xiàn)縮足反應(yīng)的時(shí)間為TWL[14]。

1.4 蛋白免疫印跡 取各組大鼠脊髓腰膨大，使用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，加入上樣緩沖液煮沸變性，SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%牛奶封閉1 h，一抗NDRG2(abcam，ab174850)、GFAP(CST，3670s)、C3(R&D，AF2655)、S100A10(Proteintech，11250-1-AP)、β-actin(Proteintech，66009-1-Ig)4℃孵育過夜，二抗(購自Proteintech)室溫孵育1 h，ECL發(fā)光成像。使用Image J對(duì)條帶進(jìn)行半定量分析。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng) 取各組大鼠脊髓腰膨大，使用TRIzol提取組織RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，配置定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)體系，并在7500 Real Time PCR儀器進(jìn)行檢測(cè)，以Gapdh作為內(nèi)參對(duì)照，用2-ΔΔCT進(jìn)行相對(duì)定量。引物序列如下：Gapdh上游5′-GGATGCTGCCCTTACCC-3′，下游5′-GTTCACACCGACCTTC--ACC-3′；Ndrg2上游5-′GAATTCTA-TGGCAGAGCTTCAGGAGGT-3′，下游5′-GGATCCTCAACAGGAGACTTCCATGGT-3′；C3上游5′-CACAGCGGCACATTTCAT-3′，下游5′-GGGGTCGGTCAAGGTCTA-3′；S1000a10上游5′-GAAAGGGAGTTCCCTGGGTT-3′，下游5′-CCCACTTTTCCATCTCGGCA-3′。

1.6 免疫熒光 分離脊髓腰膨大，4%多聚甲醛溶液固定4 h，再脫水、OCT包埋、冰凍切片機(jī)切取25 μm脊髓切片，5%驢血清封閉1 h，一抗(GFAP、NDRG2及C3)4℃孵育過夜，熒光二抗室溫孵育1 h，封片。熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 奧沙利鉑腹腔注射后MWT及TWL的變化 雄性SD大鼠連續(xù)5 d腹腔注射奧沙利鉑，成功構(gòu)建OINP模型。造模前，Vehicle組與Oxaliplatin組的MWT和TWL比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。腹腔注射奧沙利鉑7、11、18、25 d，Vehicle組的MWT、TWL均高于Oxaliplatin組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 OINP大鼠MWT、TWL變化情況

2.2 OINP大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞激活及A1、A2表型星形膠質(zhì)細(xì)胞分化改變 Oxaliplatin組脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP蛋白含量、A1表型星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物C3蛋白含量均高于Vehicle組，而A2表型星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物S100A10蛋白含量低于Vehicle組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。免疫熒光顯示，與Vehicle組比較，Oxaliplatin組GFAP及C3熒光強(qiáng)度增加。見圖3。

圖2 OINP大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP、A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物C3和A2型星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物S100A10的表達(dá)改變 圖3 OINP大鼠脊髓背角GFAP及C3熒光表達(dá)(比例尺：50 μm)

2.3 大鼠脊髓NDRG2表達(dá)改變 Oxaliplatin組脊髓NDRG2蛋白含量顯著高于Vehicle組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。免疫熒光顯示，與Vehicle組比較，Oxaliplatin組NDRG2熒光強(qiáng)度增加。見圖5。

圖4 OINP大鼠脊髓NDRG2的表達(dá)改變 圖5 OINP大鼠脊髓背角GFAP及NDRG2熒光表達(dá)(比例尺：50 μm)

2.4Ndrg2干擾對(duì)脊髓NDRG2蛋白含量及mRNA含量的影響 AD-Ndrg2-RNAi+OINP組NDRG2蛋白含量及Ndrg2相對(duì)mRNA含量顯著低于AD-control+OINP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)見圖6。

圖6 Ndrg2干擾后脊髓NDRG2蛋白及mRNA含量表達(dá)改變

2.5Ndrg2干擾對(duì)OINP大鼠疼痛行為學(xué)的影響 給藥11 d，AD-Ndrg2-RNAi+OINP組的MWT和TWL顯著高于AD-control+OINP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖7。

圖7 脊髓Ndrg2干擾后OINP大鼠MWT和TWL的變化情況

2.6Ndrg2干擾對(duì)脊髓A1、A2表型星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的影響 AD-Ndrg2-RNAi+OINP組A1表型星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物C3的蛋白含量及mRNA含量低于AD-control+OINP組，而A2表型星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物S100A10的蛋白含量及mRNA含量顯著高于AD-control+OINP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖8。

圖8 脊髓Ndrg2干擾后OINP大鼠C3和S100A10蛋白及mRNA表達(dá)改變

3 討論

奧沙利鉑屬于鉑類化合物，通過與細(xì)胞DNA結(jié)合并交聯(lián)發(fā)揮化學(xué)治療作用，目前，臨床上被廣泛用于治療肺癌、乳腺癌、卵巢癌和結(jié)腸癌等。奧沙利鉑對(duì)神經(jīng)元有顯著毒性，除了病理性疼痛，還可引起癲癇發(fā)作、腦水腫、中風(fēng)和視覺損傷[15]。奧沙利鉑誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)病變?cè)谕Ｋ幒蟛豢赡孓D(zhuǎn)，甚至其神經(jīng)損傷可能加重[16]。本研究通過腹腔注射奧沙利鉑溶液構(gòu)建了OINP模型，在不同時(shí)間點(diǎn)分別檢測(cè)了奧沙利鉑腹腔注射后的機(jī)械痛覺敏感性和熱痛覺敏感性，大鼠MWT和TWL出現(xiàn)了顯著而持久的下降，驗(yàn)證了奧沙利鉑引起了典型的神經(jīng)病理性疼痛。

在外周神經(jīng)損傷后，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞可以分化為神經(jīng)毒性A1表型和神經(jīng)保護(hù)性A2表型[17]。神經(jīng)毒性A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞失去促進(jìn)神經(jīng)元存活、生長、突觸發(fā)生和吞噬作用的能力，并誘導(dǎo)神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡。A1星型膠質(zhì)細(xì)胞高度存在于人類神經(jīng)退行性疾病中，包括阿爾茲海默病、亨廷頓病、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化和多發(fā)性硬化癥等[18-20]。近年來，有研究報(bào)道，在慢性手術(shù)后疼痛中，星形膠質(zhì)細(xì)胞向A1表型分化，而恢復(fù)A1/A2比例可以緩解皮膚肌肉損傷引起的機(jī)械性疼痛[21]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在OINP模型中，大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生激活，GFAP和C3蛋白表達(dá)顯著增加，伴隨S100A10蛋白表達(dá)顯著降低，同時(shí)，大鼠的疼痛行為學(xué)發(fā)生改變，表明奧沙利鉑腹腔注射誘導(dǎo)脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞增生活化，并誘導(dǎo)向A1表型分化，提示神經(jīng)毒性A1表型星形膠質(zhì)細(xì)胞參與OINP的發(fā)生發(fā)展過程。

NDRG2廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，并且特異性表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，參與調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生，在阿爾茲海默病、缺血再灌注損傷、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用[22-24]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，NDRG2在脊神經(jīng)結(jié)扎誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用[10]。在本研究中，鞘內(nèi)注射病毒干擾脊髓Ndrg2表達(dá)能夠?qū)е滦坌設(shè)INP大鼠的MWT及TWL顯著增加，顯著緩解奧沙利鉑誘導(dǎo)的機(jī)械痛和熱痛。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)，干擾脊髓Ndrg2，可以顯著抑制A1表型星形膠質(zhì)細(xì)胞分化，增加A2表型星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。這表明，NDRG2參與調(diào)節(jié)了星形膠質(zhì)細(xì)胞的極化，提示NDRG2可能通過調(diào)節(jié)反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的表型分化，從而促進(jìn)OINP的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，脊髓背角NDRG2促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)毒性A1表型分化，從而促進(jìn)OINP雄性大鼠產(chǎn)生機(jī)械痛覺過敏和熱痛覺過敏，為治療OINP提供潛在的干預(yù)靶點(diǎn)。