跟腱創(chuàng)傷伴隨顱腦損傷后跟腱異位骨化機(jī)制研究

盧偉誠(chéng)， 閆艦飛， 韓瀟瀟， 覃文聘， 高長(zhǎng)河， 孫龍穎， 牛麗娜， 焦 凱

1.軍事口腔醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 口腔疾病國(guó)家臨床醫(yī)學(xué)研究中心 陜西省口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院 黏膜病科，陜西 西安 710032；2.軍事口腔醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 口腔疾病國(guó)家臨床醫(yī)學(xué)研究中心 陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院 修復(fù)科，陜西 西安 710032

異位骨化(heterotopic ossification，HO)是一類(lèi)軟組織內(nèi)部出現(xiàn)異常鈣化的疾病，常導(dǎo)致患者在肘關(guān)節(jié)或髖關(guān)節(jié)等處出現(xiàn)異常的板層骨結(jié)構(gòu)。HO的臨床癥狀包括慢性疼痛、關(guān)節(jié)攣縮、活動(dòng)受限等[1]。該疾病在軍事環(huán)境中的發(fā)病率遠(yuǎn)高于其他環(huán)境，這一現(xiàn)象可能與戰(zhàn)場(chǎng)環(huán)境中的各類(lèi)爆炸傷、燒傷和顱腦損傷關(guān)系密切[2]。目前，針對(duì)該疾病的主流治療方法包括放療、非甾體抗炎藥和手術(shù)治療，但治療效果極為有限且容易復(fù)發(fā)[3]。HO主要分為遺傳性HO和獲得性HO兩大類(lèi)。其中，遺傳性HO包括進(jìn)行性骨化性肌炎和進(jìn)行性骨發(fā)育異常，主要由基因突變引起，人群發(fā)病率低[4]。獲得性HO常見(jiàn)于嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、沖擊傷或重大手術(shù)之后，其中，因中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷而誘發(fā)的HO也稱(chēng)為神經(jīng)源性HO，由于其損傷后較高的發(fā)生率和不良的預(yù)后受到越來(lái)越多的關(guān)注。有研究報(bào)道，當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到創(chuàng)傷后神經(jīng)源性HO的發(fā)病率高達(dá)53%，遠(yuǎn)高于其他類(lèi)型的HO，但是目前對(duì)于神經(jīng)源性HO的發(fā)病機(jī)制并不清楚[5-6]。有研究報(bào)道，顱腦損傷后可能會(huì)導(dǎo)致全身性的炎癥反應(yīng)和外周器官的功能障礙，急性顱腦損傷患者合并肺損傷的發(fā)生率可達(dá)30%，損傷的中樞神經(jīng)可通過(guò)釋放包含炎性小體的細(xì)胞外囊泡造成肺內(nèi)皮細(xì)胞的焦亡[7-8]。細(xì)胞焦亡表現(xiàn)為細(xì)胞不斷脹大直至細(xì)胞膜破裂，這會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物的釋放，進(jìn)而激活強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)[9]。大量研究報(bào)道，炎癥與血管鈣化等病理性鈣化的發(fā)生密切相關(guān)[10-12]，但細(xì)胞焦亡是否參與了中樞神經(jīng)損傷(traumatic brain injury，TBI)導(dǎo)致的HO發(fā)生、發(fā)展卻少見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)構(gòu)建TBI導(dǎo)致的HO動(dòng)物模型，探討細(xì)胞焦亡在神經(jīng)源性HO中所發(fā)揮的作用，以期為神經(jīng)源性HO疾病的干預(yù)提供理論依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取42只雄性SD大鼠，6～8周齡，SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。體質(zhì)量200～250 g，由空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。每籠6只，飼養(yǎng)室溫度20℃～25℃，濕度40%～70%，光照晝夜交替12 h。所有實(shí)驗(yàn)方案均通過(guò)空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心福利與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施(批準(zhǔn)號(hào)：IACUC-20220907)。

1.2 試劑及儀器 戊巴比妥(Sigma公司)，多聚甲醛(北京索萊寶公司)，HE染色試劑盒(北京索萊寶公司)，戊二醛，抗體GSDMD(AF4012，Affinity公司)，NLRP3(BF8029，Affinity公司)，CASPASE-1(AF5418，Affinity公司)，抗原修復(fù)試劑盒(武漢博士德)，內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑(邁新生物)，山羊血清(邁新生物)，免疫組化二抗(邁新生物，Kit-5010)，DAB顯色試劑盒(邁新生物)，中性樹(shù)膠(北京索萊寶公司)，micro-CT(美國(guó)西門(mén)子)，腦立體定位儀，電子顱腦損傷儀eCCI(美國(guó)VUC)，透射電鏡(transmission electron microscopy，TEM)(日本JEOL公司)，微型磨鉆與配套牙科打磨機(jī)，水浴鍋。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及跟腱創(chuàng)傷伴隨顱腦損傷造模 利用隨機(jī)數(shù)字表法將42只大鼠隨機(jī)分為3組，空白對(duì)照組6只，跟腱創(chuàng)傷組(HO組)18只，跟腱創(chuàng)傷伴隨顱腦損傷組(TBI組)18只。跟腱切斷均在左小腿實(shí)施，用1.5%戊巴比妥鈉(0.2 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠。麻醉成功后俯臥位固定。按時(shí)間點(diǎn)分為1周組、2周組、4周組3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只。空白對(duì)照組：無(wú)菌條件下切開(kāi)表皮，顯露跟腱后不做處理，縫合表皮。HO組：無(wú)菌條件下，于踝關(guān)節(jié)后側(cè)跟腱處皮膚做一縱行切口，長(zhǎng)約0.5 cm，顯露并鈍性分離跟腱，于跟腱中部將其剪斷，同時(shí)避免損傷周?chē)浗M織。跟腱不予縫合，傷口止血后縫合皮膚。見(jiàn)圖1。TBI組：跟腱的損傷部位與方式同HO組。跟腱損傷造模后將大鼠固定于腦定位儀，頭頂部脫毛，使用碘伏、乙醇消毒術(shù)區(qū)皮膚，在正中處切開(kāi)頭頂部皮膚，剝離骨膜，顯露頂骨。在冠狀縫后5 mm處、中線(xiàn)旁開(kāi)3 mm處定位，使用直徑4 mm的環(huán)形鉆在該點(diǎn)開(kāi)一骨窗，顯露大鼠硬腦膜，手術(shù)過(guò)程中盡量避免損傷硬腦膜。將撞擊桿對(duì)準(zhǔn)骨窗，設(shè)置撞擊桿的參數(shù)為下落速度3 m/s，打擊深度3 mm，打擊造成顱腦損傷?？p合頭皮后，使用紅霉素軟膏涂抹傷口，待蘇醒后放回籠中。術(shù)后肌肉注射青霉素，預(yù)防感染。肌肉注射美洛昔康預(yù)防術(shù)后疼痛，常規(guī)條件飼養(yǎng)，觀察。

圖1 動(dòng)物模型造模(a、b.橫斷跟腱的大鼠跟腱創(chuàng)傷模型；c、d.大鼠顱腦損傷模型)

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 跟腱損傷部位micro-CT掃描 術(shù)后2、4周，大鼠麻醉后手術(shù)部位行micro-CT檢查，觀察有無(wú)創(chuàng)傷性HO形成。設(shè)置以下CT參數(shù)獲取圖像：掃描電壓80 keV，電流500 μA，掃描層面48 μm。掃描完成后使用專(zhuān)業(yè)軟件進(jìn)行分析，包含HO域的閾值重建HO部分，并計(jì)算異位骨體積。通過(guò)micro-CT比較HO組、TBI組大鼠跟腱局部開(kāi)始出現(xiàn)異位骨化的時(shí)間、異位骨化的骨密度(bone mineral density，BMD)及骨體積占比(bone volume/tissue volume，BV/TV)。

1.4.2 跟腱損傷部位組織學(xué)檢查 術(shù)后2、4周，大鼠麻醉后斷頸法處死，離斷膝關(guān)節(jié)小腿后小腿以下肢體取材，使用體積分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛固定24 h，EDTA脫鈣液脫鈣3周，脫鈣完全后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，透明石蠟包埋，6 μm厚度切片。(1)通過(guò)蘇木素伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色比較HO組、TBI組跟腱處異位骨化的骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)：取石蠟切片烤片3 h，二甲苯結(jié)合梯度乙醇脫蠟，蘇木素染色，流水沖洗，1%鹽酸乙醇分化液分化后伊紅染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后，樹(shù)脂封片，拍照觀察。(2)通過(guò)免疫組化檢測(cè)跟腱創(chuàng)傷局部的焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平：取石蠟切片脫蠟后，抗原修復(fù)液修復(fù)，使用內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷內(nèi)源性氧化物，血清封閉后一抗(抗體GSDMD，1∶200稀釋?zhuān)豢贵wNLRP3，1∶200稀釋?zhuān)豢贵wCASPASE-1，1∶200稀釋)4℃孵育過(guò)夜，PBS沖洗切片，滴加二抗，室溫放置0.5 h，PBS沖洗后使用DAB顯色液顯色。自來(lái)水沖洗DAB溶液。蘇木素細(xì)胞核染色，分化后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，觀察拍照。(3)通過(guò)TEM檢測(cè)HO組、TBI組大鼠跟腱局部早期的病理性礦化：取新鮮的跟腱樣品，2.5%戊二醛固定后電鏡超薄切片，TEM觀察。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析及一般情況 42只大鼠造模后全部存活，傷口無(wú)感染，愈合良好，無(wú)行動(dòng)障礙，全部進(jìn)入數(shù)據(jù)分析。

2.2 大鼠跟腱損傷局部micro-CT掃描結(jié)果 TBI組術(shù)后2周跟腱創(chuàng)傷處可見(jiàn)明顯的圓形片狀高密度影，同期HO組損傷跟腱中無(wú)HO形成(圖2a、c)；術(shù)后4周TBI組和HO組均有HO形成(圖2b、d)，TBI組BMD及BV/TV均大于HO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2e、f)。

圖2 HO組、TBI組大鼠跟腱創(chuàng)傷部位的micro-CT表征[a、b.HO組在2周和4周micro-CT結(jié)果(比例尺=5 mm)；c、d.TBI組在2周和4周micro-CT結(jié)果(比例尺=5 mm)；e.HO組、TBI組BMD比較；f.HO組、TBI組BV/TV比較]

2.3 大鼠跟腱損傷局部HE染色結(jié)果 造模2周后，HO組表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞雜亂排列，TBI組跟腱創(chuàng)傷中可以觀察到軟骨基質(zhì)形成(圖3a、c)，造模4周后，HO組與TBI組中均可見(jiàn)成熟骨組織、骨小梁及骨髓腔結(jié)構(gòu)，但是HO組異位骨化的骨小梁厚度僅為(0.037±0.004)mm，低于TBI組的(0.084±0.007)mm，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=20.89，P<0.05)。見(jiàn)圖3b、d、e。

圖3 HO組、TBI組大鼠跟腱創(chuàng)傷部位的HE表征[a、b.HO組2周和4周跟腱創(chuàng)傷局部HE染色結(jié)果(比例尺=100 μm)；c、d.TBI組2周和4周跟腱創(chuàng)傷局部HE染色結(jié)果(比例尺=100 μm)；e.HO組、TBI組Tb.Th比較]

2.4 大鼠跟腱損傷局部組化染色結(jié)果 造模1周后，通過(guò)免疫組化技術(shù)檢測(cè)焦亡相關(guān)標(biāo)志，明確跟腱組織損傷后細(xì)胞焦亡情況，發(fā)現(xiàn)TBI組大鼠與HO組大鼠比較，損傷跟腱組織中的NLRP3+(t=9.22，P<0.05)、CASPASE-1+(t=20.61，P<0.05)、GSDMD+(t=19.87，P<0.05)的細(xì)胞均顯著增加。見(jiàn)圖4。

圖4 HO組、TBI組大鼠跟腱創(chuàng)傷局部焦亡的免疫組化表征[a、b.造模1周后跟腱創(chuàng)傷局部的NLRP3蛋白組化表征結(jié)果(比例尺=200 μm)；c、d.造模1周后跟腱創(chuàng)傷局部的CASPASE-1蛋白組化表征結(jié)果(比例尺=200 μm)；e、f.造模1周后跟腱創(chuàng)傷局部的GSDMD蛋白組化表征結(jié)果(比例尺=200 μm)；g.HO組、TBI組NLRP3+細(xì)胞數(shù)目比較；h.HO組、TBI組CASPASE-1+細(xì)胞數(shù)目比較；i.HO組、TBI組GSDMD+細(xì)胞數(shù)目比較]

2.5 大鼠跟腱損傷局部TEM結(jié)果 造模1周后，斷裂跟腱處的微觀結(jié)構(gòu)觀察可以發(fā)現(xiàn)，在HO組的細(xì)胞基質(zhì)中出現(xiàn)針狀的鈣磷沉積，同時(shí)期的TBI組中同樣發(fā)現(xiàn)類(lèi)似高密度的鈣化結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)的形狀更大，成團(tuán)狀。見(jiàn)圖5。

圖5 造模1周后HO組、TBI組大鼠跟腱創(chuàng)傷局部鈣磷結(jié)晶的TEM表征[a.造模1周后HO組局部鈣磷結(jié)晶的TEM表征結(jié)果(比例尺=400 nm)；b.造模1周后TBI組局部鈣磷結(jié)晶的TEM表征結(jié)果(比例尺=400 nm)]

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，TBI組較HO組更易出現(xiàn)HO且骨化程度更加嚴(yán)重，這一結(jié)果與臨床病例相吻合，因此，本研究構(gòu)建的TBI模型可以較好地模擬臨床神經(jīng)源性HO的發(fā)生、發(fā)展，同時(shí)，該模型的構(gòu)建也為筆者進(jìn)一步探究顱腦損傷后HO的發(fā)生機(jī)制打下良好的基礎(chǔ)。

目前認(rèn)為，HO的形成是3個(gè)關(guān)鍵因素共同作用的結(jié)果：參與HO形成的前體細(xì)胞、啟動(dòng)異位成骨的分子信號(hào)、創(chuàng)傷誘導(dǎo)的炎癥微環(huán)境[13]。顱腦損傷可顯著提升機(jī)體的炎癥水平，從而顯著促進(jìn)局部HO的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，顱腦損傷后跟腱創(chuàng)傷局部高表達(dá)焦亡通路相關(guān)蛋白NLRP3、CASPASE-1和GSDMD，與Kerr等[9]報(bào)道的TBI誘發(fā)肺部細(xì)胞焦亡的發(fā)現(xiàn)相類(lèi)似，證實(shí)了顱腦損傷與外周細(xì)胞焦亡間的聯(lián)系。有研究報(bào)道，顱腦受到創(chuàng)傷后，處于炎癥狀態(tài)和瀕死狀態(tài)的神經(jīng)細(xì)胞會(huì)釋放大量包含炎癥小體或者其他炎性物質(zhì)的細(xì)胞外囊泡，這些囊泡可以通過(guò)血腦屏障進(jìn)入到外周循環(huán)系統(tǒng)中，進(jìn)而導(dǎo)致外周炎癥水平上升，當(dāng)被外周細(xì)胞攝取這些囊泡后還會(huì)誘發(fā)細(xì)胞焦亡的發(fā)生[14-15]。因此，筆者推測(cè)跟腱創(chuàng)傷局部的細(xì)胞焦亡很可能是經(jīng)由顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)來(lái)源細(xì)胞外囊泡介導(dǎo)，但是有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

非膠原蛋白、核酸等生物大分子具有穩(wěn)定鈣磷離子、形成無(wú)定形礦化前驅(qū)體介導(dǎo)鈣化形成的作用，在生理性礦化和病理性礦化中發(fā)揮重要作用[16]。有研究證實(shí)，細(xì)胞外核酸可以吸附在膠原纖維上并可以進(jìn)一步吸附鈣磷，誘導(dǎo)纖維內(nèi)礦化的發(fā)生[17]。凋亡細(xì)胞釋放的凋亡囊泡，同樣具有礦化成核位點(diǎn)的作用，這些囊泡可以從細(xì)胞外液中吸附鈣磷并沉積，形成微小的鈣化結(jié)晶，隨后繼續(xù)富集細(xì)胞外液中的鈣磷，生長(zhǎng)變大成為鈣化結(jié)節(jié)[18]。細(xì)胞焦亡后能夠釋放出大量的細(xì)胞外核酸、蛋白等細(xì)胞內(nèi)容物來(lái)充當(dāng)成核位點(diǎn)，因此焦亡可能在病理性礦化形成中發(fā)揮了重要作用，但是具體機(jī)理仍有待深入探索[19]。

本研究中，HO組與TBI組在HO的形成階段都遵循軟骨內(nèi)成骨的成骨方式[20]，后期的HO組織都趨向于成熟骨樣結(jié)構(gòu)，在這個(gè)過(guò)程上具有一定相似性，因此造成兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組HO形成差別的原因可能是早期的炎癥水平或者是局部細(xì)胞死亡水平的差異。顱腦損傷后局部增強(qiáng)的細(xì)胞焦亡現(xiàn)象可能會(huì)誘導(dǎo)局部產(chǎn)生更多的鈣磷結(jié)晶。納米級(jí)別的鈣磷結(jié)晶本身就具有一定的誘導(dǎo)HO的能力，一方面可以通過(guò)吸附鈣磷不斷沉積變大，另一方面可以促進(jìn)周?chē)?xì)胞向成骨方向分化[21]。還有學(xué)者認(rèn)為，微小的鈣磷結(jié)晶會(huì)導(dǎo)致基質(zhì)的硬度發(fā)生改變，硬度較大的基質(zhì)又可以誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向成軟骨成骨方向分化，進(jìn)一步促進(jìn)HO[22]。

本研究成功構(gòu)建出大鼠的神經(jīng)源性HO動(dòng)物模型，可以有效模擬臨床上的神經(jīng)源性HO的病理狀態(tài)。在此模型的基礎(chǔ)上，筆者觀察到TBI大鼠跟腱創(chuàng)傷局部的細(xì)胞焦亡和鈣磷沉積，這一發(fā)現(xiàn)將為后續(xù)研究HO的阻斷提供一個(gè)新的思路，即對(duì)神經(jīng)源性HO形成早期的細(xì)胞焦亡進(jìn)行阻斷，提高病患預(yù)后質(zhì)量，避免該疾病阻礙傷病員重返崗位，有力提高官兵戰(zhàn)斗力。但是，目前實(shí)驗(yàn)取材時(shí)間點(diǎn)的分組較少，無(wú)法準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)HO形成的全部過(guò)程。下一階段的探索中會(huì)增多時(shí)間分組，更詳細(xì)研究HO形成的整個(gè)過(guò)程。同時(shí)，關(guān)于焦亡在骨化形成中的發(fā)揮的具體作用并未深入探索，探明細(xì)胞焦亡與神經(jīng)源性HO之間的關(guān)系，將為從病理生理層面理解神經(jīng)源性HO提供更多的實(shí)驗(yàn)支持。

綜上所述，顱腦損傷顯著加速跟腱創(chuàng)傷局部HO進(jìn)程，其機(jī)制可能與細(xì)胞焦亡提高局部炎癥水平，進(jìn)而加重HO的發(fā)生相關(guān)。