蛹蟲草芡實保健飲料的制備及其對果蠅生殖力和壽命的影響

楊立軍， 劉林東， 劉敏杰， 陳 瓊， 崔晨旭， 高 涵

(信陽農(nóng)林學院 制藥工程學院， 河南 信陽 464000)

0 引言

【研究意義】蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)又稱北冬蟲夏草或北蟲草，是一種藥食同源的中草藥。蛹蟲草含有豐富的蟲草多糖、蟲草素、核苷和超氧化物歧化酶(SOD)等多種生物活性物質(zhì)[1]，在抗癌、抗炎、抗氧化、降血壓、防止動脈硬化和提高免疫力等方面具有良好功效[2]。芡實(Gordoneuryale)作為一種傳統(tǒng)中藥材，富含膳食纖維，糖類和蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分，包括18種氨基酸及多種維生素[3]，具有調(diào)節(jié)腸道菌落平衡、降低膽固醇、增強免疫和養(yǎng)血安神等保健作用[4]。蛹蟲草和芡實配伍都具有藥食同源性，均有提高人體免疫力，健脾，益氣及延緩衰老等功效[5-8]。蛹蟲草不能直接食用，口感較差，難以受大眾普遍接受[9]，因此，開展蛹蟲草芡實保健飲料的制備及其對果蠅生殖力和壽命的影響研究，對開發(fā)配方更加科學安全的蛹蟲草芡實新型保健品具有現(xiàn)實意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，蛹蟲草廣泛應用于食品與保健領域。車振明[10]將蛹蟲草與多種中草藥配伍，研制出一種兼具抗疲勞和提高免疫力功效的復合型飲品。2008年，相繼報道出蛹蟲草茶、蛹蟲草酸奶、蛹蟲草酒和蛹蟲草醬油等功能性食品[11-13]。秦秀麗等[14]通過正交試驗，對蛹蟲草枸杞飲品進行了生產(chǎn)工藝的優(yōu)化；李冠龍等[15]通過正交試驗確定了蛹蟲草與玉米糝的最佳配比；羅幃等[16]以蛹蟲草燕麥殘基為原料，通過單因素和正交試驗，優(yōu)化了功能性乳飲料的工藝配方?！狙芯壳腥朦c】目前，關于芡實的研究主要集中在營養(yǎng)成分和藥理作用方面，蛹蟲草主要集中于通過正交試驗篩選蛹蟲草與復配物的最佳配比。有關利用蛹蟲草和芡實制備保健飲料且進一步驗證其食用或藥用效果的研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】采用單因素和正交試驗研究蛹蟲草芡實保健飲料制備的最佳配比及其對果蠅生殖力和壽命的影響，以期為蛹蟲草大眾食品和飲品等保健產(chǎn)品的研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蛹蟲草、果蠅及芡實 蛹蟲草子實體，由信陽農(nóng)林學院應用真菌實訓基地提供；野生型黑腹果蠅，由信陽農(nóng)林學院生物制藥實驗室提供；保鮮注水包裝凍結(jié)芡實，河南省固始縣生產(chǎn)。

1.1.2 試劑 α-淀粉酶(活性≥3 700 U/g)，北京奧博星生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；蜂蜜，桂林周氏順發(fā)食品有限公司生產(chǎn)；白砂糖，廣西海棠東亞糖業(yè)有限公司生產(chǎn)；食品級檸檬酸，河南萬邦化工科技有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 儀器設備 6202中藥粉碎機，湖南中誠制藥設備公司；DHG-9023AS電熱恒溫鼓風干燥箱，寧波東南儀器有限公司；pH計，深圳怡華電子公司；GJB30L/h-40Mpa高壓均質(zhì)機，常州均質(zhì)設備公司；SP325破壁機，浙江蘇泊爾股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 材料預處理

1) 蛹蟲草浸提液的制備工藝。挑選優(yōu)質(zhì)蛹蟲草，50℃烘干，粉碎至50目，按料液比1∶100(g/mL)加入蒸餾水，80℃浸提90 min，過濾取濾液。二次浸提60 min，合并2次濾液[17]，靜置30 min后抽濾，得到蛹蟲草浸提液。

2) 芡實濾液的制備。挑選優(yōu)質(zhì)芡實，除去外種皮，60℃烘干，按料液比1∶20(g/mL)加蒸餾水進行破壁磨漿，添加150 U/g α-淀粉酶(淀粉酶量按芡實碳水化合物含量為77.6%計算[18])，70℃酶解90 min。酶解前加入0.2%氯化鈣作為酶活化劑[19]。酶解結(jié)束后煮沸滅酶。

1.2.2 試驗設計

1) 蛹蟲草浸提液與芡實濾液體積比的確定。設定蛹蟲草浸提液與芡實濾液的體積比分別為3∶7、4∶6、5∶5和6∶4，以二者混合后的色澤、氣味等為依據(jù)，確定飲料中蛹蟲草浸提液與芡實濾液的最佳混合比例。

2) 飲料配方單因素條件優(yōu)化。以飲料的感官評分為指標，確定蛹蟲草浸提液與芡實濾液的體積比為3∶7，選擇添加6%、8%、10%、12%、14%的蜂蜜，4%、6%、8%、10%、12%的白砂糖和0.08%、0.10%、0.12%、0.14%的檸檬酸進行單因素試驗，研究各因素對保健飲料品質(zhì)的影響。

3) 飲料最優(yōu)配方的確定。以單因素試驗為基礎進行正交試驗。按配方將各材料進行混合調(diào)配，將調(diào)配好的飲料液20 MPa均質(zhì)8 min，以提高保健飲料的穩(wěn)定性；再將均質(zhì)好的飲料于100℃下殺菌20 min降低微生物的含量，以延長保質(zhì)期；滅菌結(jié)束冷卻至常溫于無菌條件下灌裝。隨機抽取5瓶保健飲料進行理化及衛(wèi)生質(zhì)量檢測；利用pH計測定飲料的酸堿度；用常規(guī)微生物學方法檢測飲料中菌落總數(shù)、金黃色葡萄球菌和大腸菌群。

1.2.3 感官評價 邀請10名食品科學專業(yè)人員對飲料的色澤(20分)、氣味(20分)、外觀狀態(tài)(20分)和口感(40分)進行評價，評分標準見表1。通過正交試驗結(jié)果結(jié)合感官評價，篩選出保健飲料的最優(yōu)配方。

表1 飲料感官評價標準

1.2.4 果蠅生殖力和壽命試驗

1) 培養(yǎng)料制備。對照培養(yǎng)基(CK)：瓊脂粉10 g，玉米粉112 g，蔗糖89 g，丙酸8 mL，酵母10 g，蒸餾水1 000 mL。試驗培養(yǎng)基Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ分別為對照培養(yǎng)基添加飲料至終質(zhì)量分數(shù)為5%、10%、15%、20%和25%，3次重復。

2) 果蠅生殖力的測定。收集8 h內(nèi)羽化未交配的黑腹果蠅，麻醉后分雌雄，將雌、雄果蠅按對飼養(yǎng)于上述6組培養(yǎng)基中，每瓶10對，每組10瓶，25℃光照培養(yǎng)[20]。待培養(yǎng)瓶中有蛹出現(xiàn)后轉(zhuǎn)移親本進行壽命試驗。記錄每瓶子一代(F1)的成蛹數(shù)和自第1只成蟲孵出后7 d內(nèi)F1成蟲數(shù)；隨機取F1代處女蠅和雄果蠅繼續(xù)在相同處理培養(yǎng)基中飼養(yǎng)，每瓶3對，每組10瓶繼續(xù)25℃光照培養(yǎng)，7 d后移去F1，記錄子二代(F2)的成蛹數(shù)和自第1只成蟲孵出后7 d內(nèi)F2成蟲數(shù)。

3) 果蠅壽命的測定。收集果蠅成蟲的親本，并將雌(♀)、雄(♂)果蠅分開培養(yǎng)[21]。每瓶各接入10只果蠅，每處理雌果蠅、雄果蠅各10瓶。每天統(tǒng)計果蠅存活數(shù)、死亡數(shù)，直至全部死亡。雌果蠅和雄果蠅半數(shù)死亡時間、平均壽命和最高平均壽命計算參照張明等[22]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 19.0對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析與繪圖，用LSD法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛹蟲草芡實保健飲料最優(yōu)配方的確定

2.1.1 蛹蟲草浸提液與芡實濾液的最佳配比 由表2看出，蛹蟲草浸提液和芡實濾液的混合比例對飲料品質(zhì)的影響較大。當體積比為3∶7時，感官評價得分最高(85分)，飲料為淡黃色，有淡淡的蛹蟲草香味和芡實天然清香，保證了該飲料中的有效成分含量。當體積比為4∶6時，感官評價得分較高(75分)，飲料呈黃色，蛹蟲草香味偏強。當體積比為5∶5時，感官評價得分較低(60分)，飲料顏色深且蛹蟲草的味道過于濃郁，芡實風味極弱。當體積比為6∶4時，感官評價得分最低(50分)，飲料顏色深且蛹蟲草香味過重，完全掩蓋了芡實的香味。因此，蛹蟲草浸提液和芡實濾液最佳混合體積比為3∶7。

表2 蛹蟲草浸提液和芡實濾液不同配比混合液的感官評價結(jié)果

2.1.2 不同添加劑處理保健飲料的品質(zhì) 從圖1看出，不同添加劑各添加量處理蛹蟲草芡實保健飲料的品質(zhì)有一定差異。

圖1 不同添加劑處理保健飲料的感官評價得分

1) 蜂蜜。感官評價得分隨蜂蜜添加量的增加呈先升后降趨勢，依次為10%(89分)>12%(83分)>8%(80分)>6%(78分)>14%(77分)。其中，添加量為8%～12%時其感官品質(zhì)較好，以添加量為10%時感官評價得分最高，為89分。因此，選擇添加量為8%、10%和12%的蜂蜜進行正交試驗。

2) 白砂糖。感官評價得分隨白砂糖添加量的增加呈先升后降趨勢，依次為8%(88分)>10%(83分)>6%(82分)>4%(77分)>12%(76分)，以添加量為8%時感官評價得分最高，為88分。當添加量為6%～10%時感官評價得分較高，甜度適中；添加量過高會導致飲料過甜，整體風味變差。因此，選擇添加量為6%、8%和10%的白砂糖進行正交試驗。

3) 檸檬酸。感官評價得分隨檸檬酸添加量的增加呈先升后降趨勢，依次為0.10%(87分)>0.08%(80分)>0.12%(79分)>0.14%(77分)，以添加量為0.10%時感官評價得分最高，為87分。當添加量為0.08%～0.12%時感官評價得分較高，酸度適中；添加量過高會導致飲料有酸澀感，口感變差。因此，選擇添加量為0.08%、0.10%和0.12%的檸檬酸進行正交試驗。

2.1.3 蛹蟲草芡實保健飲料的最優(yōu)配方 由表3可知，影響飲料風味因素依次為蜂蜜添加量>檸檬酸添加量>白砂糖添加量。表明，3個因素中對飲料品質(zhì)影響最大的是蜂蜜，由于蜂蜜的味道最為濃郁，加入蜂蜜使保健飲料的口感更香醇，同時可提升飲料的保健功能；其次為檸檬酸，加入檸檬酸可使飲料變得酸甜可口，提升飲料的整體風味；而添加適量的白砂糖可使飲料同時具有不同層次的甜味，后味更充足。通過對保健飲料的色澤、狀態(tài)、氣味和口感進行綜合評價，確定飲料的最優(yōu)配方組合為蛹蟲草浸提液和芡實濾液體積比為3∶7，蜂蜜、白砂糖和檸檬酸的添加量分別為10%、8%和0.10%。此時，蛹蟲草芡實飲料呈淡黃色，清亮，無沉淀，均勻一致，酸甜爽口，具有典型的蛹蟲草香味和芡實清香，易被大眾接受，感官評分高達94分。其pH為4.5～4.8，細菌總數(shù)≤100 CFU/mL，大腸桿菌≤3 MPN/mL，未檢出致病葡萄球菌，符合國家食品生產(chǎn)衛(wèi)生標準。

表3 篩選蛹蟲草芡實保健飲料最佳配方的正交試驗方案及結(jié)果

2.2 蛹蟲草芡實飲料對果蠅生殖力和壽命的影響

2.2.1 果蠅生殖力 由表4可知，不同濃度的蛹蟲草芡實保健飲料對果蠅生殖力影響不同。與CK比，Ⅰ組(5%)、Ⅳ組(20%)和Ⅴ組(25%)的飲料飼喂果蠅，其F1和F2的成蛹數(shù)和成蟲數(shù)變化均不明顯；Ⅱ組(10%)子代的成蛹數(shù)和成蟲數(shù)均顯著增加，F(xiàn)1和F2較CK分別提高15.85%、15.14%和13.13%、12.52%；Ⅲ組(15%)子代的成蛹數(shù)和成蟲數(shù)均極顯著增加，F(xiàn)1和F2較CK分別提高21.22%、21.12%和19.54%、22.78%。表明，添加適宜濃度(10%、15%)的蛹蟲草芡實飲料能提高果蠅的性活力，從而顯著提高果蠅生殖力。

表4 不同飲料飼喂果蠅其子代的成蛹數(shù)和成蟲數(shù)

2.2.2 果蠅壽命 以雌(♀)、雄(♂)果蠅半數(shù)死亡時間、平均壽命和最高壽命3個指標評價蛹蟲草芡實飲料對果蠅壽命的影響。從圖2看出，不同濃度的蛹蟲草芡實保健飲料對果蠅壽命影響不同。Ⅴ組(25%)果蠅全部死亡。與CK比，Ⅰ組(5%)和Ⅳ組(20%)飲料飼喂雌(♀)、雄(♂)果蠅，其半數(shù)死亡時間、平均壽命和最高壽命差異不明顯；Ⅱ組(10%)雌、雄果蠅的3個壽命指標較CK分別提高10.97%、7.82%、11.27%和10.84%、10.73%、13.31%；Ⅲ組(15%)較CK分別提高14.01%、13.11%、15.67%和16.91%、14.57%、16.88%。表明，蛹蟲草與芡實具有良好的抗氧化活性，能夠延緩衰老；適宜濃度(10%、15%)的蛹蟲草芡實保健飲料能提高果蠅壽命。

圖2 蛹蟲草芡實飲料飼喂果蠅的壽命

3 討論

蛹蟲草和芡實均是集食用、藥用和保徤功能于一體的養(yǎng)生佳品，具有較好的市場開發(fā)前景[23]。利用蛹蟲草開發(fā)新型保健品多以蛹蟲草浸提液或蛹蟲草發(fā)酵液配制而成。南曉潔等[24]以蛹蟲草和黃花菜為主要原料，復配枸杞子藥食同源的物料，成功研發(fā)出一款復合飲料；雷燕妮等[25]采用蛹蟲草和葛根為原材料，研發(fā)出一種具有提高免疫力、提高女性雌激素及預防心腦血管疾病等功效的新型固體飲料。芡實是能量和膳食纖維的理想來源，其含有較多的生物堿成分，長期食用有較好的“降火”功效，如今已被廣泛應用于食品工業(yè)，如芡實香腸[26]和芡實飲料[17]。

以蛹蟲草、芡實、蜂蜜、白砂糖和檸檬酸為原料制備的保健飲料，其顏色淡黃、清亮，酸甜爽口，具有典型的蛹蟲草香味和芡實清香。通過單因素和正交試驗進行工藝優(yōu)化表明，蛹蟲草浸提液和芡實濾液體積比為3∶7，蜂蜜、白砂糖和檸檬酸添加量分別為10%、8%和0.10%時其品質(zhì)最佳。依據(jù)果蠅生殖力和壽命試驗結(jié)果得出，適宜濃度(10%、15%)的蛹蟲草芡實飲料有效提高果蠅壽命和性活力，從而提高其生殖力。前人主要集中研究通過正交試驗篩選蛹蟲草與復配物的最佳配比，僅局限于產(chǎn)品的口感、色澤和營養(yǎng)價值等方面。而蛹蟲草芡實飲料的研究通過正交試驗確定最佳配比，并以果蠅的生殖力和壽命作為檢測標準，進一步驗證該配比飲料對果蠅生殖力和壽命的影響，使配方更科學，功能更明確，效果更顯著。

4 結(jié)論

蛹蟲草浸提液和芡實濾液體積比為3∶7，蜂蜜、白砂糖和檸檬酸添加量分別為10%、8%和0.10%時，蛹蟲草芡實保健飲料的顏色淡黃、清亮，酸甜爽口，具有典型的蛹蟲草香味和芡實清香，其pH為4.5～4.8，細菌總數(shù)≤100 CFU/mL，大腸桿菌≤3 MPN/mL，符合國家食品生產(chǎn)衛(wèi)生標準。CK(對照培養(yǎng)基)，F(xiàn)1和F2的成蛹數(shù)、成蟲數(shù)分別為65.98只、59.13只和64.43只、57.02只。10%飲料飼喂果蠅，F(xiàn)1(76.44只、68.08只)和F2(72.89只、64.16只)的成蛹數(shù)、成蟲數(shù)分別較CK提高15.85%、15.14%和13.13%、12.52%；15%飲料飼喂果蠅，F(xiàn)1(79.98只、71.62只)和F2(77.02只、70.01只)的成蛹數(shù)、成蟲數(shù)分別較CK提高21.22%、21.12%和19.54%、22.78%。CK雌(♀)果蠅和雄(♂)果蠅半數(shù)死亡時間、平均壽命和最高壽命分別為55.13 d、60.43 d、74.26 d和55.81 d、60.32 d、78.56 d。10%飲料飼喂雌果蠅(61.18 d、65.16 d、82.63 d)和雄果蠅(61.86 d、66.79 d、89.02 d)，其半數(shù)死亡時間、平均壽命、最高壽命分別較CK提高10.97%、7.82%、11.27%和10.84%、10.73%、13.31%；15%飲料飼喂雌果蠅(62.85 d、68.35 d、85.90 d)和雄果蠅(65.25 d、69.11 d、91.82 d)，分別較CK提高14.01%、13.11%、15.67%和16.91%、14.57%、16.88%。表明，蛹蟲草芡實保健飲料的最佳配方為蛹蟲草浸提液和芡實濾液體積比3∶7，同時添加10%蜂蜜、8%白砂糖和0.10%檸檬酸；適宜濃度(10%、15%)的飲料飼喂果蠅能明顯提高其生殖力和壽命。