MUC5AC、TIMP-1在毛細支氣管炎患兒血清中表達及與喘息發(fā)作的相關(guān)性探究

鄭碩，閆文豪

毛細支氣管炎是急性下呼吸道感染性疾病且在臨床較為常見，小兒群體是此病的易感群體，多發(fā)于冬季，其病變部位主要在肺部的細小支氣管，臨床常見癥狀多表現(xiàn)為呼吸急促、呼氣性喘鳴，其中少數(shù)患者存在喘息反復(fù)性發(fā)作的現(xiàn)象，若未得到積極治療甚至惡化轉(zhuǎn)變?yōu)橄?、呼吸衰竭，危及患兒生命安全[1]。近年來，多項研究結(jié)果表明[2]，毛細支氣管炎的發(fā)病速度較快，故早期診斷此病有助于患兒盡早接受積極治療、改善預(yù)后。黏蛋白5AC(MUC5AC)具有評估氣道上皮黏液分泌的功能，是黏蛋白家族主要成員之一；基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)是基質(zhì)金屬蛋白酶的內(nèi)源性天然抑制因子，對基質(zhì)金屬蛋白酶的活性具有很好的抑制作用，其中屬基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)活性最強且參與氣道炎癥損傷和氣道重塑的鏈接轉(zhuǎn)換[3-5]。本研究旨在檢測該疾病患者血清中MUC5AC、TIMP-1表達，對比兩者在毛細支氣管炎患兒血清中表達變化、在發(fā)病機制中的作用及與喘息次數(shù)的相關(guān)性，以期為臨床小兒毛細支氣管炎的治療提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 回顧性選取2020年2月至2021年3月在方城縣婦幼保健院內(nèi)兒科就診的毛細支氣管炎患兒78例作為研究組研究對象，研究組按病情嚴重程度被分為輕癥45例，重癥33例；男37例，女41例；年齡3個月～2歲，出生時母親年齡23～36歲，呼吸疾病史：有45例，無33例；病程3～12 d；另外同期選取78例在方城縣婦幼保健院內(nèi)兒科進行健康體檢的健康兒童作為對照組研究對象，年齡4個月～2歲，出生時母親年齡25～34歲，兩組基線資料對比(P＞0.05)，見表1.上述研究對象家屬對本次研究均知情、簽署同意書，方城縣婦幼保健院倫理委員會已批準，批準號：(2020)倫審第(26)號。

表1 兩組基線資料比較[n，(±s)]

女43 41平均年齡/歲 1.29±0.14 1.25±0.16 0.099 1.662出生時母親平均年齡/歲27.52±2.69 27.56±2.62 0.094 0.925農(nóng)村 21 24剖宮產(chǎn) 14 17性別男35 37 0.103 0.748居住環(huán)境城鎮(zhèn) 57 54 0.281 0.596分娩方式自然分娩 64 61 0.362 0.547項目 對照組 研究組 統(tǒng)計值 P值

1.2 選取標準 納入標準：符合《諸福棠實用兒科學(xué)》[6]中毛細支氣管炎診斷標準且經(jīng)臨床查體、影像學(xué)檢查確診；存在顯著的喘憋和咳嗽癥狀；家屬均知情且簽署承諾書。排除標準：肝腎功能異常、存在自身免疫性疾?。蝗朐呵?個月接受過免疫抑制劑、抗血小板等藥物治療，影響研究結(jié)果；肺部發(fā)育不良引起咳嗽；先天氣道性疾病導(dǎo)致高反應(yīng)咳喘；合并哮喘等其他呼吸系統(tǒng)疾病。

1.3 指標檢測

1.3.1 標本采集 入組后采集清晨空腹靜脈血5 mL，室溫環(huán)境靜置2 h，3 000 r/min、r＝15 cm離心15 min，-80℃冰箱，保存待用。

1.3.2 MUC5AC檢測 采用逆轉(zhuǎn)錄- 聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測兩組研究對象血清MUC5AC表達，實驗步驟：將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，條件：25 ℃、50 ℃、85 ℃(10 min、45 min、5 min)。cDNA 進 行 擴 增，引 物 序 列：MUC5AC，F(xiàn)：5’-CGGGTACCTGAG GGACGC CTTGGCTC-3’，R：5’-CCG CTCGAGTGTGTGGACGGCGGGGAAGA-3’；以U6 為 內(nèi) 參，F(xiàn)：5’-GGTTAGAAGTCATACG-3’，R：5’-TGTCATGAATGATCC-3’。反應(yīng)體系為：10 μL BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix(2×)，2 μL cDNA模板，1 μL上下游引物和6 μL H2O。產(chǎn)物擴增條件：預(yù)變性95 ℃、變性均5 min，退火95 ℃、延伸72 ℃分別15 s、30 s，共40個循環(huán)，MUC5AC相對表達量采用2-ΔΔCt計算。

1.3.3 TIMP-l 檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELIEA)檢測血清TIMP-1水平，實驗步驟：將冰箱中血清標本取出放置室溫30 s，備置標準血清及溶液，300 μL洗板液洗板對其進行30 s沖洗，微孔拍干后依次加入檢測緩沖液、標準液、樣本、檢測抗體均50 μL，封板，震蕩，室溫(37 ℃)孵育2 h，洗板，100 μL的酶標記物導(dǎo)入檢測孔，封板，震蕩，放置室溫內(nèi)45 min，洗板，將100 μL底物液加入微孔，30 min避光孵育、加入100 μL終止液、震蕩，使用酶標儀在450 nm處測吸光值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0處理數(shù)據(jù)。用Kolmogorov-Smirnov檢驗數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，符合則計量資料使用均數(shù)±標準差(±s)進行描述，組間兩兩比較采用獨立t檢驗，多組間行F值數(shù)據(jù)計算，計數(shù)資料以率[n(%)]表示，Pearson相關(guān)性分析MUC5AC、TIMP-1與毛細支氣管炎的相關(guān)性，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MUC5AC、TIMP-1在對照組、研究組血清中比較 相比對照組，研究組血清中MUC5AC、TIMP-1較高，以研究組重癥最為顯著表現(xiàn)為MUC5AC(3.85±0.43)、TIMP-1(179.23±18.54)ng/mL，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F＝93.240、24.135，P均＜0.05)。見表2。

表2 MUC5AC、TIMP-1在對照組、研究組血清中比較(±s)

表2 MUC5AC、TIMP-1在對照組、研究組血清中比較(±s)

注：MUC5AC＝黏蛋白5AC，TIMP-1＝基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1；下同。

組別 例數(shù) MUC5AC TIMP-1/(ng·mL-1)對照組 78 0.72±0.08 128.46±13.57重癥 33 3.85±0.43 179.23±18.54 F值 93.240 24.135 P值 0.001 0.001研究組輕癥78 45 2.16±0.24 146.82±15.03

2.2 研究組MUC5AC、TIMP-1與喘息發(fā)作的相關(guān)性 研究組MUC5AC、TIMP-1與喘息發(fā)作呈正相關(guān)，即喘息次數(shù)越多，MUC5AC(4.23±0.46)、TIMP-1(182.46±18.27)ng/mL越高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t＝16.570、7.510，P均＜0.05)，見表3。

表3 研究組MUC5AC、TIMP-1與喘息發(fā)作的相關(guān)性(±s)

表3 研究組MUC5AC、TIMP-1與喘息發(fā)作的相關(guān)性(±s)

項目 例數(shù) MUC5AC TIMP-l/(ng·mL-1)喘息＜3次 45≥3次 33 2.87±0.26 153.79±15.38喘息4.23±0.46 182.46±18.27 t值 16.570 7.510 P值 0.001 0.001

2.3 MUC5AC、TIMP-1 之間的相關(guān)性分析 以MUC5AC、TIMP-1 進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，MUC5AC、TIMP-1 正 相 關(guān)(r＝0.468、P＝0.001)，見圖1。

圖1 MUC5AC、TIMP-1之間相關(guān)性分析

2.4 毛細支氣管炎發(fā)生影響因素的多元Logistic回歸分析 毛細支氣管炎為因變量(未發(fā)生＝0，發(fā)生＝1)，MUC5AC、TIMP-1為自變量，賦值升高設(shè)為1，正常設(shè)為0，納入二分類多因素Logistic回歸模型分析，結(jié)果顯示，MUC5AC、TIMP-1為影響毛細支氣管炎發(fā)生的危險因素，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表4。

表4 毛細支氣管炎發(fā)生影響因素的多元Logistic回歸分析

3 討論

研究表明[7-8]，小兒支氣管炎的發(fā)生發(fā)展與炎癥因子和黏液分泌增加密切相關(guān)，患兒多出現(xiàn)一系列呼吸癥狀，如鼻炎、呼吸急促、呼吸做功增加等，且與患兒后期是否發(fā)生復(fù)發(fā)性喘息和哮喘等存在一定關(guān)聯(lián)。毛細支氣管炎目前臨床認為此病是多種因素共同作用的結(jié)果，其中過敏體質(zhì)、家族哮喘史、長期吸入二手煙等均是此病的誘發(fā)因素，目前臨床上暫無早期診斷后發(fā)生反復(fù)喘息的標志性指標[9]。

黏蛋白具有濕潤吸入氣體、預(yù)防支氣管及肺泡上皮干燥的功效，對呼吸道具有較好的保護作用，可防止和避免有毒氣體或微生物的入侵[10-11]。呼吸道黏液的重要組成部分為黏蛋白，而MUC5AC是一種氣道黏液中重要的黏蛋白，且經(jīng)臨床研究證實[12-14]，其水平變化在慢性鼻- 鼻竇炎、呼吸機相關(guān)性肺炎等多種肺部疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，且備受廣大醫(yī)者的關(guān)注。本文研究數(shù)據(jù)得出，MUC5AC在毛細支氣管炎患兒血清中呈異常高表達且其表達隨喘息次數(shù)增加而升高，MUC5AC的作用機制包括MUC5AC表達抑制劑叉頭轉(zhuǎn)錄因子A2(FoxA2)、白細胞介素-13(IL-13)誘發(fā)黏液化生和MUC5AC表達、表皮生長因子受體誘導(dǎo)MUC5AC表達，在支氣管炎發(fā)病過程中，炎癥聯(lián)級反應(yīng)上調(diào)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子6磷酸化并抑制FoxA2 表達，在一定程度上可促進MUC5AC表達，誘導(dǎo)黏液高分泌，由此佐證在小兒毛細支氣管炎發(fā)生及病情發(fā)展中MUC5AC起著重要的調(diào)節(jié)作用；此外，毛細支氣管對哮喘的發(fā)病具有很大的影響，MUC5AC高表達意味著氣道黏液高分泌，其水平升高伴隨著喘息次數(shù)增加，可預(yù)測喘息發(fā)作，亦可為哮喘早期防止提供依據(jù)。

上皮下纖維化、細胞外基質(zhì)(ECM)沉積、基底膜增厚等均為臨床氣道重塑的常見病理特征，可造成持續(xù)性的氣道高反應(yīng)和不可逆的氣流阻塞，在呼吸道重構(gòu)過程中TIMP-1是一個重要因子，若其表達水平異常升高則提示可能出現(xiàn)哮喘氣道重塑的標志[15-16]。TIMP-1對成纖維細胞增生和膠原的合成以及上皮細胞增殖或纖維化具有促進作用，還具有細胞生長因子的作用，在氣道重塑的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[17]。TIMP-1和金屬基質(zhì)蛋白-9(MMP-9)在機體健康的狀態(tài)下水平處于相對平衡狀態(tài)，但在支氣管疾病發(fā)生發(fā)展過程中，因TIMP-1對MMP-9具有生理抑制性，在支氣管疾病發(fā)生時，TIMP-1水平隨MMP-9水平的升高而升高，進而加重ECM在氣道內(nèi)沉積，最終導(dǎo)致氣道重塑[18]。本文數(shù)據(jù)分析得出，TIMP-1在毛細支氣管炎患兒血清中表達異常升高且喘息次數(shù)越多、TIMP-1表達越高，其作用機制可能為高表達TIMP-1促進MMP-9的活性增加，進而破壞氣道和肺部的細胞外基質(zhì)及基底膜在氣道和肺重建中起左右，破壞呼吸系統(tǒng)細胞外基質(zhì)和基底膜，TIMP-1與喘息密切相關(guān)，是喘息氣道重塑的重要標識因子。據(jù)既往研究結(jié)果顯示[19-21]，毛細支氣管炎患兒喘息多次復(fù)發(fā)的可能率高達85%，日后有可能發(fā)展為支氣管哮喘。在本文研究中，MUC5AC、TIMP-1表達升高與喘息次數(shù)密切相關(guān)，可作為毛細支氣管炎反復(fù)喘息的預(yù)測指標仍值得進一步研究。

綜上所述，本文研究結(jié)果顯示，MUC5AC、TIMP-1在毛細支氣管炎患兒血清中呈異常高表達，MUC5AC、TIMP-1是毛細支氣管發(fā)生的影響因素，且其水平升高、喘息次數(shù)越多，兩者水平與喘息次數(shù)呈正相關(guān)。但本文研究仍存在不足之處，如樣本量小、研究對象單一、病例來源受地域限制，故在今后研究中需增加樣本量、納入多中心研究對象并擴大病例來源范圍，以證實本文研究的準確性。