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    基于miRNA-132信號(hào)通路探究胡椒堿對(duì)肝癌血管形成及腫瘤抑制作用*

    2023-03-02 09:03:12康助習(xí)權(quán)瑞泉
    關(guān)鍵詞:堿組胡椒肝癌

    康助習(xí) 匡 黎 郭 俊 權(quán)瑞泉 魏 英

    國(guó)藥東風(fēng)總醫(yī)院腫瘤科 (湖北 十堰,442000)

    原發(fā)性肝癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,主要病因是肝細(xì)胞及膽管細(xì)胞發(fā)生癌變,惡性程度及轉(zhuǎn)移率較高[1,2]。原發(fā)性肝癌全球發(fā)病率正逐年增長(zhǎng),在全球惡性腫瘤的發(fā)病率中排名第五,死亡率位居第三[3]。近年來(lái),肝癌的診斷方法、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)研究的快速發(fā)展,臨床上對(duì)肝癌的發(fā)生發(fā)展、診斷及治療有了進(jìn)一步認(rèn)識(shí),但肝癌患者的預(yù)后仍差,特別是對(duì)難以切除或已經(jīng)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的肝癌的治療方法和手段有限,預(yù)后極差。胡椒堿是一種從胡椒屬植物中提取的生物堿,在中國(guó)和印度是常用的食品和傳統(tǒng)藥物[4]。研究表明,胡椒堿具有抗感染、抗氧化、抗驚厥、抗炎、保肝、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等廣泛的藥理作用[5]。學(xué)者通過(guò)研究黑色素瘤誘導(dǎo)的肺轉(zhuǎn)移發(fā)現(xiàn),胡椒堿可通過(guò)抑制其轉(zhuǎn)移而減少腫瘤的形成,由此可見(jiàn),胡椒堿對(duì)抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移有一定的作用[6]。然而有關(guān)胡椒堿對(duì)肝癌的作用機(jī)制研究較少。微小RNA(miR)是一類長(zhǎng)度20~24 nt的內(nèi)源性、非編碼的RNA基因產(chǎn)物,可與mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)相結(jié)合而達(dá)到抑制其翻譯,或通過(guò)與mRNA翻譯區(qū)結(jié)合而直接引起mRNA的剪切,從而負(fù)調(diào)控靶基因[7]。人類miR-132位于第17號(hào)染色體上,是眾多具有潛在調(diào)控腫瘤的miRNA之一[8]。有研究發(fā)現(xiàn),miR-132在肝癌、骨肉瘤、結(jié)直腸癌等組織中表達(dá)水平明顯低于正常組織,同時(shí)與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系,有望成為抑制惡性腫瘤的新靶點(diǎn)[9]。本研究基于miRNA-132信號(hào)通路的基礎(chǔ)上,探究胡椒堿對(duì)肝癌的血管形成及腫瘤的抑制作用。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株HepG2購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。將HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1×105U/L的青霉素和鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中,每48 h換液1次。待細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí),用0.25%胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞,傳代培養(yǎng)。細(xì)胞傳代2~3 d 1次,實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞。

    1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c雄性裸鼠55只,SPF級(jí),4周齡,體質(zhì)量15~18 g,均購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,動(dòng)物生產(chǎn)許可證:SCXK(京)2016-0006。將裸鼠全部置于22~26℃、相對(duì)濕度40%~60%的環(huán)境中,自由攝食飲水,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理原則,經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

    1.3 試劑與儀器 胡椒堿(中國(guó)藥品生物制品檢定所);DMEM培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素(美國(guó)Hyclone公司);miR-132 類似物(銳博生物科技有限公司);兔抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、E2F3單克隆抗體(美國(guó)Epitmics公司);MTT試劑盒、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);CO2培養(yǎng)箱(德國(guó)Binder公司);XDS-1B型顯微鏡(上海光學(xué)儀器廠);TGL16型離心機(jī)(長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司);流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

    1.4 模型制備和分組 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的HepG2細(xì)胞,1 000 r/min離心5 min,用PBS溶液重懸,與Matrigel等體積混合,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/ml,皮下注射于45只裸鼠右側(cè)腋下部位,接種量為0.2 ml,5 d后可見(jiàn)裸鼠右上肢腋下觀察有黃豆大小腫瘤生成,至腫瘤生長(zhǎng)至20~40 mm3時(shí)視為造模成功,40只裸鼠成功制備肝癌模型。剩余10只小鼠不接種HepG2細(xì)胞,設(shè)為空白組。待裸鼠瘤體積生長(zhǎng)至100~150 mm3時(shí),將成功制備肝癌模型40只小鼠隨機(jī)分為模型組(肝癌小鼠模型組)、胡椒堿組(肝癌小鼠模型給予胡椒堿干預(yù)組)、miR-132組(肝癌小鼠模型給予miR-132類似物組)、聯(lián)合組(肝癌小鼠模型給予胡椒堿聯(lián)合miR-132類似物組),每組10只。

    1.5 給藥 胡椒堿組小鼠經(jīng)腹腔注射50 μmol/L胡椒堿;miR-132組小鼠經(jīng)腹腔注射200 μl miR-132類似物干預(yù);聯(lián)合組小鼠經(jīng)腹腔注射50 μmol/L胡椒堿和200 μl miR-132類似物干預(yù);空白組和模型組小鼠腹腔注射等量的生理鹽水干預(yù)。1次/d,共14 d。

    1.6 觀察指標(biāo)

    1.6.1 腫瘤體積測(cè)定 從第1次腹腔注射給藥開(kāi)始,每隔1 d用游標(biāo)尺測(cè)量腫瘤的最大長(zhǎng)經(jīng)與短經(jīng),2 d 1次,同時(shí)計(jì)算小鼠體內(nèi)的腫瘤體積均數(shù),繪制腫瘤的生長(zhǎng)曲線。瘤體積=(長(zhǎng)×寬2)/2。

    1.6.2 抑瘤率測(cè)定 于第15天處死各組部分裸鼠,取出裸鼠腫瘤組織,稱取其質(zhì)量,計(jì)算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率=(1-治療組腫瘤質(zhì)量/對(duì)照組腫瘤質(zhì)量)×100%。

    1.6.3 腫瘤組織病理學(xué)觀察 麻醉處死各組部分裸鼠,取出腫瘤組織,固定于4%多聚甲醛溶液中24 h,石蠟包埋組織,用切片機(jī)將組織切成厚度為4 μm的薄片,二甲苯脫蠟、乙醇脫水后,用蘇木精染色切片3 min,伊紅染色1 min。中性樹(shù)膠將清洗后的切片組織封片。光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤組織的病理學(xué)變化。

    1.6.4 ELISA檢測(cè)血清VEGF含量 取各組裸鼠眼球血,將血液置于冰浴中1~2 h,于4℃環(huán)境4 000 r/min離心10 min,收集上層血清。用ELISA試劑盒檢測(cè)血清中VEGF含量。

    1.6.5 腫瘤組織微血管密度(MVD)檢測(cè) MVD檢測(cè)操作步驟按照試劑使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,按照Weidner標(biāo)準(zhǔn),現(xiàn)將切片在低倍光鏡下(×100)確定腫瘤內(nèi)CD34染色陽(yáng)性的微血管密集區(qū)域,在陽(yáng)性染色最密集區(qū)域,在高倍光鏡視野下(×100)選取5個(gè)視野進(jìn)行血管計(jì)數(shù),取平均值為切片的MVD值。

    1.6.6 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)肝組織中miR-132、GP73表達(dá) 取各組裸鼠肝組織200 mg,冰上剪碎組織,用裂解液裂解組織成組織懸液,4℃ 12 000 r/min離心10 min,收集上層血清,用BCA法對(duì)總蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。將組織置于12% SDS-PAGE上,隨后轉(zhuǎn)至PVDF膜上,用5% BSA封閉。加入一級(jí)抗體,抗miR-132(1∶1 000),抗GP73(1∶1 000),β-actin(1∶1 000),于4℃條件下孵育1~2 h。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗,在室溫環(huán)境下結(jié)合1 h。用ECL系統(tǒng)試劑盒觀察所有條帶。通過(guò)Image J軟件分析條帶密度。

    1.6.7 雙熒光素酶報(bào)告靶基因熒光檢測(cè) 利用生物信息學(xué)軟件(TargetScan7.1),預(yù)測(cè)miR-132調(diào)控高爾基體糖蛋白73(GP73)基因結(jié)合序列,設(shè)計(jì)合成GP73 3'-UTR序列及突變后GP73 3'-UTR序列,將合成的兩種目的基因片段分別克隆到pmir GLO熒光素酶報(bào)告基因載體,構(gòu)建GP73 3'-UTR雙熒光素酶報(bào)告基因載體(pmiR-GLO-wt-survivin)及其突變型載體(pmir GLO-mut-survivin)。

    使用LipofectamineTM3000分別將這兩種重組載體質(zhì)粒與miR-132 mimics(miR-132)或miR-132陰性對(duì)照(NC)共同轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞。48 h后對(duì)熒光素酶活性進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

    2 結(jié)果

    2.1 各組裸鼠腫瘤體積比較 給藥結(jié)束后,模型組裸鼠的瘤體積生長(zhǎng)為(151.32±10.16)mm3,和模型組相比,miR-132組(103.67±7.62)mm3、胡椒堿組(98.36±7.15)mm3和聯(lián)合組(58.45±4.21)mm3裸鼠的瘤體積均顯著降低,且聯(lián)合組瘤體積較胡椒堿組和miR-132組降低更明顯(P<0.05);miR-132組和胡椒堿組裸鼠瘤體積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    2.2 各組裸鼠腫瘤生長(zhǎng)抑制率比較 模型組腫瘤生長(zhǎng)抑制率為0,miR-132組、胡椒堿組、聯(lián)合組裸鼠腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為(31.1±4.13)%、(33.2±4.25)%與(56.3±5.22)%。和模型組相比,miR-132組、胡椒堿組和聯(lián)合組裸鼠腫瘤生長(zhǎng)抑制率顯著增加(P<0.05);聯(lián)合組裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)抑制率明顯高于miR-132組和胡椒堿組(P<0.05)。

    2.3 各組裸鼠腫瘤病理學(xué)比較 空白組為正常的肝組織,可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)完整,輪廓清晰,肝細(xì)胞以中央靜脈為中心的呈放射狀排列,肝小葉肝細(xì)胞分界清晰,無(wú)腫瘤細(xì)胞;模型組可見(jiàn)腫瘤形成,且腫瘤細(xì)胞狀態(tài)良好,數(shù)量較多,大小不等,排列緊密規(guī)則,核畸形,細(xì)胞核深染,核漿比失常;miR-132組、胡椒堿組和聯(lián)合組腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡,核質(zhì)皺縮,細(xì)胞輪廓不規(guī)則;聯(lián)合組腫瘤細(xì)胞凋亡顯著多于miR-132組和胡椒堿組(圖1)。

    圖1 各組裸鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn) (HE染色,×200)

    2.4 各組裸鼠血清中VEGF含量和MVD比較 見(jiàn)表1。

    表1 各組裸鼠血清中VEGF含量比較

    2.5 各組裸鼠肝組織中miR-132、GP73表達(dá)比較 和空白組相比,模型組裸鼠肝組織中miR-132表達(dá)顯著降低,GP73蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05);和模型組相比,miR-132組、胡椒堿組和聯(lián)合組裸鼠肝組織中miR-132表達(dá)均明顯增加,GP73蛋白表達(dá)均顯著降低,且聯(lián)合組中miR-132和GP73表達(dá)變化最大(P<0.05);miR-132組和胡椒堿組裸鼠肝組織中miR-132HE GP73表達(dá)比較均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。

    與空白組相比,*P<0.05;與模型組相比,△P<0.05;與胡椒堿組相比,#P<0.05

    2.6 雙熒光素酶檢測(cè)報(bào)告 結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)miR-132可降低GP73活性(P<0.05),可見(jiàn)GP73是miR-132的靶基因,見(jiàn)表2。

    表2 雙熒光素酶檢測(cè)報(bào)告

    3 討論

    肝癌是我國(guó)男性發(fā)病率位居第2位的惡性腫瘤,其主要是由肝細(xì)胞、肝內(nèi)膽管細(xì)胞引發(fā)[10]。當(dāng)前臨床治療肝癌的方法有手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)及靶向、免疫介入治療等,盡管我國(guó)一直致力于對(duì)肝癌的研究,并在肝癌的檢測(cè)和治療方面取得進(jìn)展,但由于肝癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、早期診斷困難、治療水平限制及腫瘤進(jìn)展迅速且易轉(zhuǎn)移等,導(dǎo)致患者復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差等?,F(xiàn)行肝癌化學(xué)治療藥物以阿霉素和5-氟尿嘧啶等最為常用,但這些藥物的治療有效率低且無(wú)明顯延長(zhǎng)患者生存期效果,因此尋找和開(kāi)發(fā)新的特異性高、療效好的抗腫瘤藥物成為肝癌治療的焦點(diǎn)[11]。胡椒堿是生物堿類物質(zhì),是胡椒的主要生理活性成分之一。其化學(xué)結(jié)構(gòu)屬于桂皮酰胺類,已有研究證明這類化合物具有多種藥理活性,如鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥、骨骼肌松弛和抗抑郁等[12]。在抗腫瘤作用的研究中發(fā)現(xiàn),胡椒堿在體內(nèi)和體外均有良好的抗腫瘤特性,還可以通過(guò)抑制轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子和炎癥因子的產(chǎn)生來(lái)抑制金屬蛋白酶的活性等[13]。目前關(guān)于胡椒堿對(duì)肝癌腫瘤抑制作用的機(jī)制研究較少,因此本研究旨在研究胡椒堿對(duì)肝癌血管生成及腫瘤的抑制作用。

    本研究通過(guò)制備肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移瘤,研究結(jié)果顯示,胡椒堿可減少瘤重,抑制肝癌裸鼠的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng),且腫瘤抑制率和miR-132干預(yù)效果相似。腫瘤細(xì)胞HE染色顯示,模型組裸鼠腫瘤細(xì)胞狀態(tài)明顯好于胡椒堿組,胡椒堿組腫瘤細(xì)胞狀態(tài)和miR-132組相似。由此提示,胡椒堿可抑制肝癌腫瘤生長(zhǎng)有明顯的抑制作用,且miR-132類似物也可抑制肝癌所致的腫瘤生長(zhǎng),效果和胡椒堿相似。吉莉[14]研究證實(shí),胡椒堿對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和人肝癌細(xì)胞HepG2具有較好的抑制作用。

    惡性腫瘤最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移途徑包括淋巴轉(zhuǎn)移和血行轉(zhuǎn)移,而血管生成是腫瘤生成和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素。VEGF是目前已知作用最強(qiáng)的血管生成因子,又稱為血管通透因子,是由腫瘤細(xì)胞分泌并特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的一種生長(zhǎng)因子[15]。VEGF可以通過(guò)與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。腫瘤一般通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、基質(zhì)降解和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)發(fā)生癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移,血管生成和其在分子機(jī)制上極其相似,也是通過(guò)以上過(guò)程生成血管,可見(jiàn)腫瘤的血管生成和瘤轉(zhuǎn)移密不可分[16]。在治療腫瘤時(shí),可通過(guò)對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的抑制而降低血管的生成,進(jìn)而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。MVD代表著腫瘤的結(jié)構(gòu)血管數(shù)量,在腫瘤的血管形成評(píng)價(jià)中起重要作用,常作為新生血管生成程度的金標(biāo)準(zhǔn)。胡椒堿對(duì)多種惡性腫瘤細(xì)胞如乳腺癌、直腸癌、前列腺癌等均有抗腫瘤活性,而且胡椒堿在4T1細(xì)胞乳腺癌模型小鼠和道爾頓淋巴瘤模型小鼠體內(nèi)可以抑制瘤體的生長(zhǎng),延長(zhǎng)模型小鼠的生存期,并提高了藥物組的存活期。本研究結(jié)果顯示,胡椒堿組和miR-132組裸鼠血清中VEGF含量和MVD數(shù)量均低于模型組,且miR-132組血清中VEGF含量和MVD數(shù)量和胡椒堿組無(wú)顯著差異,提示胡椒堿在一定程度上具有抗腫瘤血管生長(zhǎng)的作用。丁文波等[17]研究證實(shí),雙丹膠囊聯(lián)合5-FU能抑制肝癌小鼠腫瘤的生長(zhǎng),并對(duì)肝癌小鼠的免疫器官有一定程度的保護(hù)作用,其機(jī)制可能與下調(diào)VEGF的表達(dá)而抑制腫瘤血管生成有關(guān)。

    miR-132定位于人類染色體17p13,是一類與炎癥、血管生長(zhǎng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的miRNA。有研究結(jié)果顯示,肝癌組織中miR-132表達(dá)顯著降低,其在肝癌中發(fā)揮抑癌基因的作用,過(guò)表達(dá)miR-132可抑制肝癌細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移[18]。本研究結(jié)果顯示,肝癌裸鼠中miR-132表達(dá)降低,miR-132過(guò)表達(dá)和胡椒堿均可提高miR-132表達(dá)。胡椒堿作為常用的調(diào)料已經(jīng)廣泛使用了上百年,其還用于醫(yī)藥、防腐劑和除蟲(chóng)等方面。胡椒堿類的抗癇靈是我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)第一個(gè)抗癲癇藥品??拱B靈是國(guó)際首位以兒童為對(duì)象的進(jìn)行臨床觀察的藥品,充分證明了該藥的低毒性和安全性。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),胡椒堿還有預(yù)防腫瘤發(fā)生發(fā)展的特性。GT73在正常肝細(xì)胞中呈低表達(dá)狀態(tài),其在病變的肝細(xì)胞尤其是肝癌細(xì)胞中表達(dá)水平顯著升高。近年來(lái),GP73作為一種肝癌血清新標(biāo)志物引起廣泛關(guān)注,其敏感度和特異性高于甲胎蛋白。此外,有研究結(jié)果顯示,肝癌患者血清GP73的升高可能是與肝癌細(xì)胞大量合成而分泌到血液中有關(guān)[19]。本研究結(jié)果顯示,miR-132和胡椒堿均可抑制肝癌裸鼠肝組織中GP73表達(dá),提示miR-132與GP73呈顯著復(fù)相關(guān)。雙熒光素酶結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)miR-132可降低GP73活性,進(jìn)一步證實(shí)了GP73是miR-132調(diào)控的直接靶基因。沙敏等[20]研究證實(shí),在肝癌患者血清中發(fā)現(xiàn)miR-212/miR-132均呈低表達(dá),且miR-212/miR-132均可對(duì)肝細(xì)胞中的GP73進(jìn)行調(diào)控,進(jìn)而抑制肝癌的增長(zhǎng)。

    綜上所述,胡椒堿可通過(guò)調(diào)控miR-132負(fù)向調(diào)控GP73抑制肝癌血管形成,同時(shí)也能顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

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