布比卡因?qū)Ω伟〩epG2細胞增殖、侵襲和凋亡及miR-191/KLF6信號軸的影響*

張振翼 袁增江 張 欣 趙孟雷 徐殿國

1.邯鄲市中心醫(yī)院普外科 (河北 邯鄲，056000) 2.河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖教研室

肝癌是一種常見的惡性腫瘤，由于其高轉(zhuǎn)移潛力，已成為癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1]。盡管在肝癌的診斷和治療方面已經(jīng)取得了很大的進步，但是患者的預(yù)后仍較差[2]。因此，探索其潛在的病理機制對于尋找可以改善肝癌患者治療水平的新策略尤為重要。微小RNA(miRNA)作為基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，通過靶向蛋白質(zhì)編碼基因的3'-非翻譯區(qū)(3'-UTR)發(fā)揮其功能，該蛋白參與調(diào)節(jié)眾多生物學(xué)過程。研究證實在多種人類癌癥中都發(fā)現(xiàn)了改變的miRNA水平，并且在腫瘤發(fā)生中起著關(guān)鍵作用[3]。微小RNA-191(miR-191)作為一種高度保守的血清外泌體miRNA，在20多種不同的癌癥類型中均異常表達，也是肝細胞癌(HCC)治療的潛在致癌靶標。在HCC癌細胞中，miR-191被證明具有調(diào)節(jié)作用，通過DNA甲基化并參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的調(diào)控[4]。Krüppel樣因子(KLF)屬于控制基本細胞過程的鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族。KLF6是KLF家族的成員，在細胞生長和細胞周期進程中起著至關(guān)重要的作用[5]。研究表明，KLF6抑制了細胞周期蛋白D的表達，導(dǎo)致HCC衍生細胞中的G1細胞周期停滯[6]。有研究報道，布比卡因可抑制胰腺癌細胞和人前列腺癌細胞侵襲、遷移和增殖[7,8]。目前尚無關(guān)于布比卡因?qū)Ω伟┘毎饔脵C制的研究，本研究擬探討布比卡因?qū)Ω伟〩epG2細胞增殖、侵襲和凋亡及miR-191/KLF6信號軸的影響，為肝癌的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞、試劑及儀器 肝癌HepG2細胞系(上海漢博生物科技有限公司，批號SCSP-917)，布比卡因(岳陽市嘉誠生物科技有限公司，原料藥，純度99%，批號2180-95-3)，順鉑注射液(江蘇豪森藥業(yè)集團有限公司，批號20200516)，胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基、細胞計數(shù)試劑盒8(CCK-8)、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)細胞凋亡試劑盒(北京泰澤嘉業(yè)科技發(fā)展有限公司，批號YH5778、YH6019、YH7119、YH5007)，TRIzol試劑、TAQMAN MICRORNA定量PCR試劑盒、裂解緩沖液、蛋白含量測定試劑盒、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(北京百奧萊博科技有限公司，批號BL-11335、BL-16472、BL-20176、BL-20135、BL-30017)，兔抗KLF6抗體、兔抗GAPDH抗體、山羊抗兔二抗、增強的化學(xué)發(fā)光試劑盒(上海恪敏生物科技有限公司，批號BY-5784R、BY-0844R、EM-1009、BY-2911R)，CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司，型號240i)，酶標儀(上海寶予德科學(xué)儀器有限公司，型號K3 Plus)，Transwell小室(北京優(yōu)尼康生物科技有限公司，型號3415)，光學(xué)顯微鏡(德國LIOO公司，型號JDS300)，流式細胞儀(廣州吉源生物科技有限公司，型號CyFlow Cube6)，熒光定量PCR系統(tǒng)(杭州博日科技股份有限公司，型號FQD-16A)，凝膠成像系統(tǒng)(杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司，型號GIS300)。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組 肝癌HepG2細胞復(fù)蘇后，加入到含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，并在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞覆蓋率為70%左右時使用胰蛋白酶消化、傳代。

將肝癌HepG2細胞隨機分為肝癌HepG2細胞組、順鉑組(3.0 μg/ml)[9]、布比卡因低劑量組(2.5 mg/ml)、布比卡因高劑量組(5.0 mg/ml)[8]。

肝癌HepG2細胞組：肝癌HepG2細胞液(細胞濃度為5×106個/ml)在10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。順鉑組、布比卡因低劑量組、布比卡因高劑量組：細胞培養(yǎng)方法同肝癌HepG2細胞組，分別加入濃度為3.0 μg/ml的順鉑、2.5 mg/ml、5.0 mg/ml的布比卡因。以上各組設(shè)8個平行樣，培養(yǎng)72 h。

1.3 細胞增殖測定 各組肝癌HepG2細胞培養(yǎng)結(jié)束后，在96孔板中每孔加入1×104個肝癌HepG2細胞，48 h后加入10 μl CCK-8試劑，在37℃下放置4 h后，使用酶標儀在450 nm處測量吸光度(OD)，根據(jù)OD計算細胞存活率，另設(shè)空白對照組(只加培養(yǎng)液、CCK-8試劑)，細胞存活率=實驗組OD/空白對照組OD×100%。

1.4 細胞侵襲水平測定 各組肝癌HepG2細胞培養(yǎng)結(jié)束后，將肝癌HepG2細胞(8×103個/ml)接種在基質(zhì)膠包被的Transwell小室上腔中，將含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基添加到Transwell小室下腔中，在37℃下培養(yǎng)24 h后，將上腔室中的細胞移出，并將下腔室中的細胞在室溫下使用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，隨機選取6個視野用顯微鏡計數(shù)穿膜細胞，實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.5 細胞凋亡水平測定 各組肝癌HepG2細胞培養(yǎng)結(jié)束后，用胰蛋白酶消化并用PBS洗滌兩次，將細胞用70%的冰冷乙醇固定，重懸于PBS中，采用Annexin V-FITC/PI試劑盒于流式細胞儀上檢測細胞凋亡情況。

1.6 細胞miR-191、KLF6 mRNA水平測定 使用TRIzol試劑從肝癌HepG2細胞中分離總RNA，將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用TAQMAN MICRORNA定量PCR試劑盒在實時熒光定量PCR系統(tǒng)上進行反應(yīng)。引物由上?？党缮锕こ逃邢薰驹O(shè)計并合成。引物序列如下：miR-191正向5′-GCATCCTGACGTGTCAGACTA-3′，miR-191反向5′-TACGACGATACGGGATAAGTC-3′；KLF6正向5′-GCAATACTCGCCTTACGGCT-3′，KLF6反向5′-TACACACCTTGTAGTACGCC-3′；GAPDH正向5′-ACAAC-TTTGGTATCGTGGAAGG-3′，GAPDH反向5′-GACCTAGATGGCCTAAACGCTT-3′；熱循環(huán)的條件：95℃ 5 min，95℃ 15 s共40個循環(huán)，60℃ 30 s退火/延伸。使用2-ΔΔCt方法計算miR-191、KLF6 mRNA的相對表達水平。

1.7 細胞KLF6蛋白水平測定 使用裂解緩沖液裂解肝癌HepG2細胞，提取總蛋白，測定蛋白含量之后通過凝膠電泳分離蛋白質(zhì)(50 μg/泳道)，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，在室溫下用5%脫脂奶封閉膜3 h，將兔抗KLF6抗體(1∶500)和GAPDH抗體(1∶500)在4℃下與PVDF膜孵育過夜，用PBS洗滌3次后，將膜與山羊抗兔二抗孵育3 h，使用增強的化學(xué)發(fā)光試劑盒和Quantity One軟件分析蛋白質(zhì)條帶的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組肝癌HepG2細胞存活率、穿膜數(shù)、凋亡率比較 見表1，顯微鏡下計數(shù)穿膜細胞見圖1。流式細胞儀上檢測的細胞凋亡情況見圖2。

表1 各組肝癌HepG2細胞存活率比較

圖1 各組肝癌HepG2細胞穿膜數(shù)比較(結(jié)晶紫染色，×200) (A：肝癌HepG2細胞組，B：順鉑組，C：布比卡因低劑量組，D：布比卡因高劑量組)

圖2 各組肝癌HepG2細胞凋亡率比較 (A：肝癌HepG2細胞組，B：順鉑組，C：布比卡因低劑量組，D：布比卡因高劑量組)

2.2 各組肝癌HepG2細胞miR-191、KLF6 mRNA水平及KLF6蛋白水平比較 見表2。KLF6蛋白印跡圖見圖3。

表2 各組肝癌HepG2細胞miR-191、KLF6 mRNA水平比較

圖3 各組肝癌HepG2細胞KLF6蛋白印跡圖 (A：肝癌HepG2細胞組，B：順鉑組，C：布比卡因低劑量組，D：布比卡因高劑量組)

3 討論

布比卡因作為一種臨床局部浸潤麻醉藥物，最近的一些研究集中于其對癌細胞的潛在細胞毒性。Liu等[10]研究表明，布比卡因可通過調(diào)節(jié)核因子κB(NF-κB)信號通路抑制人結(jié)腸癌細胞增殖，促進其凋亡和自噬。Ju等[11]研究表明，布比卡因可降低胃癌細胞中環(huán)狀RNA 0000376(circRNA0000376)表達，提高微小miR-145-5p表達，進而抑制胃癌進展。有研究顯示布比卡因可呈劑量依賴性上調(diào)腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)表達進而抑制人膀胱癌細胞增殖，并誘導(dǎo)細胞凋亡[12]。鹿素青等[13]研究表明，布比卡因可能通過促進miR-381-3p表達，抑制E3泛素連接酶(HERC4)表達，進而抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。這些研究均表明布比卡因具有抗癌作用，可有效抑制癌細胞的發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，布比卡因低、高劑量組肝癌HepG2細胞存活率、穿膜數(shù)低于肝癌HepG2細胞組，凋亡率高于肝癌HepG2細胞組；且布比卡因高劑量組肝癌HepG2細胞存活率、穿膜數(shù)低于布比卡因低劑量組，凋亡率高于布比卡因低劑量組。這與上述研究結(jié)果一致，說明布比卡因能明顯抑制肝癌HepG2細胞增殖、侵襲，促進其凋亡。

肝癌的發(fā)生和發(fā)展涉及多種基因和環(huán)境因素，這些與許多病理過程和分子事件有關(guān)。miRNA參與腫瘤發(fā)生和進展，某些miRNA會提高腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，從而起到致癌性miRNA的作用；另外一些miRNA會抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲，并起抑癌性miRNA的作用[14]。而miR-191可發(fā)揮促癌作用，張琳琳等[15]臨床研究表明上皮性卵巢癌患者血漿miR-191表達水平明顯高于上皮卵巢良性腫瘤患者和健康體檢者。Hu等[16]研究表明，miR-191在宮頸癌細胞中高表達，抑制miR-191表達可降低宮頸癌細胞存活、轉(zhuǎn)移，促進宮頸癌細胞凋亡。臨床研究表明，胃癌患者血清中miR-191表達與正常人相比明顯上調(diào)，且miR-191高表達是化療不敏感的獨立危險因素，miR-191高表達患者預(yù)后生存率較低[17]。本研究結(jié)果顯示，布比卡因低、高劑量組肝癌HepG2細胞中miR-191水平低于肝癌HepG2細胞組，布比卡因高劑量組肝癌HepG2細胞中miR-191水平低于布比卡因低劑量組。表明布比卡因可抑制肝癌HepG2細胞中miR-191表達，進一步提示布比卡因?qū)Ω伟〩epG2細胞增殖、侵襲的抑制作用和對凋亡的促進作用，可能與其抑制miR-191的表達有關(guān)。

KLF6是一種抑癌基因。有學(xué)者研究表明宮頸癌組織KLF6高表達者化療敏感性高，且預(yù)后更好，KLF6可作為患者預(yù)后評價指標[18]。張倬等[19]研究顯示，食管癌細胞中KLF6 mRNA和蛋白表達下調(diào)，抑制miR-24-3p表達可上調(diào)KLF6 mRNA和蛋白表達，從而抑制食管癌細胞活力，誘導(dǎo)其凋亡。研究表明，抑制環(huán)狀RNA-SMAD7表達可使KLF6的mRNA和蛋白表達均顯著增加，卵巢癌細胞的遷移和侵襲受到明顯抑制[20]。相元翠等[21]研究表明，KLF6基因可通過磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路抑制宮頸癌細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡。以上研究均表明KLF6具有抑癌作用，可有效抑制癌細胞的發(fā)展。KLF6是miR-191的潛在靶標，熒光素酶報告系統(tǒng)驗證了miR-191和KLF6基因之間的相互作用[4]。本研究結(jié)果顯示：布比卡因低、高劑量組肝癌HepG2細胞中KLF6 mRNA和蛋白水平高于肝癌HepG2細胞組，布比卡因高劑量組肝癌HepG2細胞中KLF6 mRNA和蛋白水平高于布比卡因低劑量組。說明布比卡因可促進肝癌HepG2細胞中KLF6的表達，而KLF6 mRNA和蛋白水平的升高可能與布比卡因抑制miR-191的表達有關(guān)。

綜上所述，布比卡因能明顯抑制肝癌HepG2細胞增殖和侵襲，促進其凋亡；其機制可能與布比卡因降低肝癌HepG2細胞miR-191的表達進而促進KLF6的表達有關(guān)。