KIRREL在胃癌中的表達(dá)及其對(duì)胃癌血管生成的影響

陳 碩，張明軍，王 濤

胃癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率居世界第5位，死亡率居第4位[1]。其5年生存率僅有18%左右[2]。目前胃癌主要的治療手段包括手術(shù)、化療、放療、免疫治療與靶向治療。其中在靶向治療領(lǐng)域中，與其他惡性腫瘤相比，針對(duì)胃癌的靶向治療藥物相對(duì)較少，如雷莫蘆單抗(靶點(diǎn)為VEGFR-2)和曲妥珠單抗(針對(duì)HER-2陽性患者)。因此，有必要進(jìn)一步探索新的基因來作為胃癌治療的新靶點(diǎn)。

類IRRE蛋白1系屬(Kin of IRRE-like protein 1，KIRREL)是免疫球蛋白超家族的一員，在腎足細(xì)胞的過濾縫隙中表達(dá)，在結(jié)構(gòu)和序列上與腎病蛋白(nephrin)相似。該蛋白的C端結(jié)構(gòu)域能與足突蛋白(Podocin，NPHS2)相互作用[3]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)KIRREL在多種惡性腫瘤中高表達(dá)。然而，KIRREL與胃癌相關(guān)的研究較少，其在胃癌中的作用機(jī)制尚不明確。為了明確KIRREL在胃癌中的作用，該研究擬檢測KIRREL在胃癌中的表達(dá)，并初步探討KIRREL沉默或過表達(dá)對(duì)胃癌血管生成的影響。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本選取胃癌組織及癌旁組織各10例，均來自安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，其中男性7例，女性3例，年齡40～70歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：① 術(shù)前通過胃鏡和病理檢查明確診斷為胃癌的患者；② 擬行胃癌根治手術(shù)者；③ 心、肺等重要的臟器功能良好,能夠承受胃癌手術(shù)打擊；④ 已簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 有其他惡性腫瘤病史；② 既往有放化療病史。本研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理評(píng)審委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理批號(hào)YX2022075(F1)。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、SNU-5，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)購于北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器CO2培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(北京六一生物科技有限公司)；DYY-7B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(美國Bio-Rad公司)；垂直電泳槽、轉(zhuǎn)移電泳槽(美國伯樂公司)；轉(zhuǎn)膜儀(美國Hoefer公司)；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)等。

1.4 主要試劑完全RPMI-1640培養(yǎng)基、完全F12培養(yǎng)基(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；MCE完全培養(yǎng)基(美國SCIENCELL公司)；RIPA細(xì)胞裂解液(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)；HIF-1α一抗、VEGF一抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；KIRREL一抗(美國Bioss公司)；GAPDH一抗、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)二抗、辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG(H+L)二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；DAB顯色試劑盒、中性樹脂(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；蘇木精染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)等。

1.5 構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系將AGS、SNU-5細(xì)胞復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)，加入轉(zhuǎn)染試劑與Opti-MEM，分別轉(zhuǎn)染KIRREL過表達(dá)和干擾質(zhì)粒，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)8 h，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后24 h判定轉(zhuǎn)染效率，確定轉(zhuǎn)染成功后，再次更換培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。KIRREL引物序列F：5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′，R：5′-AGTCCCGTCCTAAAATGTC-3′；shRNA引物序列見表1。

表1 shRNA的引物序列

1.6 Western blot用移液槍吸棄培養(yǎng)皿中的細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入100 μl細(xì)胞裂解液，置于冰上20 min。12 000 r/min離心10 min取上清液，測定蛋白濃度。蛋白變性，上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，3%脫脂牛奶孵育1 h。分別在KIRREL(1 ∶1 000稀釋)、HIF-1α(1 ∶2 000稀釋)、VEGF(1 ∶1 000稀釋)、GAPDH(1 ∶2 000稀釋)一抗溶液中孵育，4 ℃過夜；洗膜后，將加入目的一抗的膜在1 ∶2 000稀釋的根酶標(biāo)記山羊抗兔二抗溶液中室溫孵育2 h，加入內(nèi)參一抗的膜在1 ∶2 000稀釋的辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠二抗溶液中室溫孵育2 h。再次洗膜，在膜上滴加ECL發(fā)光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用“Quantity one”軟件分析各條帶灰度值。

1.7 免疫組化將胃癌組織和癌旁組織進(jìn)行石蠟包埋后，組織切片進(jìn)行免疫組化檢測。在1 ∶200稀釋的KIRREL一抗溶液中孵育，4 ℃過夜；復(fù)溫后加入1 ∶100稀釋的辣根酶標(biāo)記山羊抗兔二抗，孵育30 min。DAB顯色5 min。蘇木精染5 min，接著分化、返藍(lán)、脫水、透明、封片、鏡檢。目的蛋白為棕色，細(xì)胞核為藍(lán)紫色。根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例和染色程度進(jìn)行分析。

1.8 血管形成實(shí)驗(yàn)收集AGS細(xì)胞、SNU-5細(xì)胞的各組上清液，重懸HUVEC進(jìn)行成管實(shí)驗(yàn)。將在4 ℃中融化的基質(zhì)膠鋪在提前預(yù)冷的24孔板中，每孔250 μl，注意不要出現(xiàn)氣泡，放置在培養(yǎng)箱中凝固30 min；接著將各組細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每孔8×104個(gè)細(xì)胞，6 h后拍照觀察細(xì)胞成管情況，圖像從5個(gè)連續(xù)的視野中獲得，放大倍數(shù) ×100。選取管長度和節(jié)點(diǎn)進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 KIRREL在胃癌組織中的表達(dá)分析為了檢測KIRREL在胃癌中的表達(dá)水平，將臨床收集的10對(duì)胃癌組織和癌旁組織分別提取目的蛋白。首先通過免疫組化法檢測發(fā)現(xiàn)：KIRREL在胃癌組織中呈高表達(dá)，而在癌旁組織中呈低表達(dá)，見圖1A、1B。其次，Western blot結(jié)果表明在大約70%(7/10)的胃癌組織中,KIRREL的蛋白表達(dá)高于癌旁組織。其中，在胃癌組織、癌旁組織中的表達(dá)量分別為1.05±0.22及0.63±0.14，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.257，P<0.05)，見圖1C。

圖1 KIRREL在胃癌組織中的表達(dá)分析

2.2 構(gòu)建KIRREL干擾和過表達(dá)胃癌細(xì)胞株根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇高表達(dá)KIRREL的胃癌細(xì)胞株SNU-5和低表達(dá)KIRREL的胃癌細(xì)胞株AGS作為研究對(duì)象。在SNU-5細(xì)胞中誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染了穩(wěn)定的KIRREL基因慢病毒干擾載體(LV-shKIRREL),在AGS細(xì)胞中誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染了穩(wěn)定的KIRREL基因慢病毒過表達(dá)載體(LV-KIRREL),同時(shí)分別設(shè)置了一組轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的細(xì)胞株(LV-shNC，LV-NC)。以GAPDH作為內(nèi)參，使用Western blot檢測各組細(xì)胞中KIRREL的蛋白表達(dá)量，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。結(jié)果如圖,與LV-NC組比較，LV-KIRREL組的KIRREL蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)(t=3.748，P<0.05)，驗(yàn)證結(jié)果過表達(dá)有效，見圖2A；KIRREL慢病毒LV-shKIRREL1組和KIRREL慢病毒LV-shKIRREL3組的KIRREL蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)(t=8.249、8.648，P<0.05)，見圖2B。本研究選擇了KIRREL慢病毒LV-shKIRREL1組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 KIRREL對(duì)胃癌血管生成的影響為了驗(yàn)證KIRREL對(duì)胃癌血管生成的影響， Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)，在AGS細(xì)胞中，與LV-NC組相比，LV-KIRREL組HIF-1α、VEGF的蛋白表達(dá)量增多；而在SNU-5細(xì)胞中，LV-shKIRREL組與LV-shNC組相比，HIF-1α、VEGF的蛋白表達(dá)量明顯減少，見圖3A。另外，體外血管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在AGS細(xì)胞中，與LV-NC組相比，LV-KIRREL組HUVEC的管長度和節(jié)點(diǎn)明顯增加(t=7.603、5.041，P<0.01)，而在SNU-5細(xì)胞中，與LV-shNC組相比，LV-shKIRREL組的管長度和節(jié)點(diǎn)明顯減少(t=2.851、4.930，P<0.05)，見圖3B。

3 討論

KIRREL主要位于足細(xì)胞膜，能根據(jù)分子量、電荷和形狀限制大分子的通過，參與維持裂隙隔膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性。有研究[4]表明，KIRREL是一種信號(hào)分子，可以激活典型的蛋白激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)。雖然KIRREL在胃癌中的作用機(jī)制尚未見報(bào)道，但KIRREL已經(jīng)被證實(shí)在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，且與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。例如，Hu et al[5]綜合分析了3個(gè)胰腺癌相關(guān)的微陣列數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)KIRREL在胰腺癌中過表達(dá)，可作為胰腺癌的治療新靶點(diǎn)。Chen et al[6]對(duì)302例乳腺癌組織和50例正常乳腺組織進(jìn)行分析，結(jié)果提示KIRREL在乳腺癌中過表達(dá)，可作為乳腺癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)。還有研究[7]顯示KIRREL基因甲基化可能通過促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，從而在骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。

圖2 構(gòu)建KIRREL干擾和過表達(dá)胃癌細(xì)胞株

本課題組前期研究[8]顯示KIRREL基因在胃癌中呈高表達(dá)，表達(dá)水平的高低與腫瘤大小、T分期、年齡等因素相關(guān)，且高表達(dá)的KIRREL mRNA與總生存時(shí)間相關(guān)。在此次研究中，Western blot、免疫組化檢測結(jié)果均顯示，與癌旁組織相比，KIRREL在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，符合前期的研究結(jié)果。此外，該研究還通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了KIRREL可能促進(jìn)胃癌的血管生成。

在腫瘤進(jìn)展中，血管生成持續(xù)異常，這為增殖的腫瘤細(xì)胞提供了充足的營養(yǎng)和氧氣，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移[9-10]。研究[11]表明，胃癌是一種高度血管生成的癌癥。在低氧條件下，HIF-1α被激活，并通過識(shí)別啟動(dòng)子區(qū)域的共同缺氧反應(yīng)元件促進(jìn)血管生成因子的轉(zhuǎn)錄，這是腫瘤血管生成的前提條件[12]。且在這一過程中，VEGF是促進(jìn)腫瘤血管生成的關(guān)鍵細(xì)胞因子，刺激腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，抑制凋亡并調(diào)節(jié)其通透性[13]。因此，為了進(jìn)一步探討KIRREL與胃癌血管生成的關(guān)系，本研究通過Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)KIRREL過表達(dá)上調(diào)了HIF-1α和VEGF的表達(dá)，而KIRREL沉默則抑制了HIF-1α和VEGF的表達(dá)，這證實(shí)了KIRREL可能對(duì)胃癌血管生成具有促進(jìn)作用。此外，體外血管形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示KIRREL促進(jìn)了HUVEC的血管形成能力，這進(jìn)一步證實(shí)了KIRREL促進(jìn)胃癌血管生成這一觀點(diǎn)。

圖3 KIRREL對(duì)胃癌血管生成的影響

綜上所述，KIRREL在胃癌組織中過表達(dá)，并促進(jìn)胃癌的血管生成。這一結(jié)論為治療和預(yù)防胃癌提供了重要的理論依據(jù)。本研究的不足之處在于收集的臨床標(biāo)本數(shù)量較少，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可能存在偏倚，信服力偏低，要更好地了解KIRREL在胃癌中的潛在功能，還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量。