人體內(nèi)微生物游離DNA在病原微生物檢測中的應用

江婷婷，林彥鋒 綜述 李 鵬，宋宏彬 審校

感染性疾病是人類健康的重大威脅，目前可導致人類感染性疾病的微生物超過1 000種[1]。然而，目前只有少數(shù)的病原體可以識別出來。微生物分離培養(yǎng)是感染性疾病診斷的金標準，且許多常見的病原體難以培養(yǎng)[2]。PCR等分子生物學檢測只適用于有限的已知病原體診斷[3-4]。宏基因組測序已廣泛應用于已知或未知病原體的鑒定[5-6]，但該技術依賴于采集感染部位的樣本[7]。

游離DNA(cell-free DNA, cfDNA)是指游離于細胞外的部分降解了的DNA，于1948年首次在癌癥患者的血清中發(fā)現(xiàn)[8]，已用于腫瘤檢測[9]、無創(chuàng)產(chǎn)檢[10]、器官移植[11]等。cfDNA高度片段化，長度大部分在100～200 bp之間[12]。cfDNA存在于外周血循環(huán)中，主要來源于人的基因組DNA、線粒體DNA[13]。血液中還存在微生物來源的cfDNA(microbial cell-free DNA，mcfDNA)，其長度短于人源cfDNA，為40～100 bp[14]，侵入性病原體通過微生物的易位及感染或在機體出現(xiàn)物理損傷時進入血液[15]。

基于cfDNA的液體活檢在臨床感染實時診斷中表現(xiàn)出巨大應用價值，在敗血癥[16]、寄生蟲[17]和結(jié)核病[18]等病原檢測中表現(xiàn)出可靠的識別能力，研究者們針對多種病原體及不同類型樣本開展了相關工作。

1 mcfDNA用于細菌性感染檢測

1.1 血液樣本血流感染是臨床上眾多挑戰(zhàn)之一，在許多病例中預后較差，會導致敗血癥甚至死亡，病原體的早期識別有助于降低患者的病死率。一項前瞻性研究表明，256份膿毒癥發(fā)病時血培養(yǎng)樣本的陽性率為33%，而基于mcfDNA二代測序的病原體鑒定陽性率則為72%[19]?；趍cfDNA測序，Chen et al[20]通過對正常樣本和敗血癥樣本檢測的細菌構建共生網(wǎng)絡，從有限的敗血癥樣本中鑒定出引起敗血癥的目標細菌。研究[21]還發(fā)現(xiàn)，病原體cfDNA持續(xù)可檢測的時間跨度明顯長于傳統(tǒng)的病原分離培養(yǎng)，且其持續(xù)時間與轉(zhuǎn)移性感染風險增加有關。對復發(fā)性或難治性的兒科腫瘤患者的臨床血樣進行cfDNA測序，Goggin et al[22]發(fā)現(xiàn)在感染癥狀出現(xiàn)的3日前就可在患者血液中檢測到病原體的cfDNA序列，檢測靈敏度和病原序列數(shù)隨時間推移而升高，對常見血流感染病原體的特異性達到91%。

此外，基于血液樣本的cfDNA也能用于識別非血流感染的原位感染病灶病原體。Echeverria et al[23]對53名確診為髖關節(jié)或膝關節(jié)假體感染的血液樣本進行cfDNA測序，將病原體檢測率從87%提高到94%，并發(fā)現(xiàn)了傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法無法獲得的14種微生物。重癥肺炎患者的下呼吸道樣本不易獲取，研究者通過對患者外周血進行cfDNA檢測，在67%(12/18)的病例中檢測到一種或多種肺炎病原體，并得到臨床確認[24]。通過比較囊性纖維化患者和健康志愿者的血液cfDNA測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)71%的患者血液中存在呼吸道病原體的cfDNA，且豐度在統(tǒng)計學上顯著高于健康對照組[25]。

肺結(jié)核早期診斷對治療極為關鍵，但傳統(tǒng)方法難以對病原體進行及時檢測。Pan et al[26]發(fā)現(xiàn)cfDNA可以作為檢測肺結(jié)核免疫相關的微生物標志物，與使用單核細胞-淋巴細胞比率來檢測肺結(jié)核相比，基于cfDNA檢測肺結(jié)核的靈敏性和特異性分別提高到79.2%和84.2%。此外，臨床上從培養(yǎng)物收集到確認結(jié)核分枝桿菌的檢測時間中位數(shù)平均為41 d，而基于cfDNA的檢測可將總時間縮短為4 d左右，顯著提升了檢測時效性[27]。

1.2 其他體液樣本mcfDNA也廣泛存在于尿液、胸腔積液、肺泡灌洗液、腦脊液等其他類型人體體液樣本中。研究者通過識別73例尿液樣本中肺結(jié)核特異性的mcfDNA片段，表明該方法的特異性達到100%[28]。此外，cfDNA測序結(jié)果中還包含細菌組成、抗菌素敏感性等信息，從而可對臨床抗菌藥物敏感性進行評估[29]。結(jié)合臨床患者信息，cfDNA測序還可用于評估患者所患疾病的嚴重程度。Cheng et al[30]對腎移植受體的尿液進行cfDNA測序分析，發(fā)現(xiàn)cfDNA來源的宿主組織和細胞類型與患者感染狀態(tài)密切相關，并確認腎臟和膀胱組織損傷與細菌感染相關。

基于mcfDNA的檢測方法對于傳統(tǒng)方法難以檢測的細菌具有重要意義。臨床結(jié)核性胸膜炎診斷極具挑戰(zhàn)，Che et al[31]對患者胸腔積液樣本同時進行傳統(tǒng)方法檢測和cfDNA檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)后者對結(jié)核分支桿菌檢測的敏感性為75%，特異性則達到100%，顯著高于傳統(tǒng)分離培養(yǎng)和Xpert檢測方法。肺炎克雷伯菌易導致肺炎，胸腔積液中的肺炎克雷伯菌的臨床分離培養(yǎng)較為困難。Ren et al[32]建立了基于mcfDNA的肺炎克雷伯菌感染檢測系統(tǒng)，與痰培養(yǎng)結(jié)果相比，該檢測方法的敏感性及特異性分別為91%、95%以上，其陽性檢出率也遠高于傳統(tǒng)檢測，為臨床診治提供了重要指導。

2 cfDNA用于真菌性感染檢測

侵入性真菌感染在臨床日趨常見，但真菌分離培養(yǎng)較為困難，且不易分離破壁，宏基因組測序也難以檢出。毛霉病是一種罕見的真菌感染引起的疾病，Martin-Blais et al[33]基于血液樣本的mcfDNA測序確診了1例侵入性胃腸毛霉病，同時該方法還可以檢出煙曲霉菌等其他絲狀真菌[34]。研究者通過對真菌感染患者的血液樣本進行mcfDNA二代測序，與通過肺組織、胰腺假性囊腫液和頭皮傷口等侵入性檢測結(jié)果一致[35]。Hong et al[36]對9例經(jīng)培養(yǎng)證實真菌感染的患者血液進行mcfDNA測序，在其中7例患者中檢測到真菌，也與活檢組織鑒定結(jié)果相同。mcfDNA還可用于浸潤性霉菌感染的檢測，敏感性為79%，陽性預測值則達到100%[37]。與傳統(tǒng)的檢測方法相比，mcfDNA可有效識別多種類型的真菌感染。基于二代測序，Yan et al[38]對34例疑似敗血癥患兒的血液樣本進行mcfDNA檢測，發(fā)現(xiàn)耶氏肺孢子蟲等19種潛在的致病性真菌。以上研究說明基于mcfDNA測序可以用于臨床指導真菌性感染病原體的檢測。

3 cfDNA用于寄生蟲性感染檢測

目前，臨床上主要通過對患者的血液、組織液、排泄物、分泌物或活體組織等來檢查寄生蟲，檢出率低，輕度感染者需要反復檢查，且不適用于異位寄生的寄生蟲感染。肺泡棘球蚴病是由多房棘球絳蟲幼蟲引起的嚴重的寄生蟲病，研究者分析了149例血漿樣本的cfDNA序列，發(fā)現(xiàn)在術前診斷為肺泡棘球蚴病患者血漿中含有不同棘球絳蟲特異性序列，而在術前診斷為非肺泡棘球蚴病患者和健康志愿者均無相應序列，且棘球絳蟲特異性cfDNA序列數(shù)量與肺泡棘球蚴病病變嚴重程度相關，從而為治療后患者恢復的定量評估提供重要參考[18]。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)瘧疾患者總血漿中cfDNA水平隨疾病嚴重程度的增加而升高，這為寄生蟲感染的識別和病癥嚴重程度判斷提供了新的依據(jù)[39]。Zhao et al[40]收集了9例囊性棘球蚴病患者治療前后的血液樣本并測序，發(fā)現(xiàn)棘球絳蟲cfDNA濃度及片段大小發(fā)生顯著變化，治療后濃度及片段長度均增加，這表明mcfDNA也可作為評估患者恢復情況的潛在標志物。血吸蟲病的診斷主要通過對宿主的糞便或尿液標本中寄生蟲蟲卵進行檢測，但不易檢出輕度及早期活動性感染。研究者通過聚合酶鏈式反應，對血吸蟲感染區(qū)域的人群體液樣本進行血吸蟲cfDNA檢測，發(fā)現(xiàn)該方法的敏感性為100%，表明血吸蟲cfDNA具有作為指示活動性血吸蟲感染標志物的巨大潛力[41]。

4 cfDNA用于病毒性感染檢測

病毒是引起呼吸道感染性疾病的常見病原體之一，早期準確地識別病原體可以減少抗感染藥物的濫用。Munjal et al[42]基于mcfDNA檢測，在1例患者的血漿中檢測出愛潑斯坦-巴爾病毒的存在。說明cfDNA的檢測可以為臨床實踐提供重要的信息。高危型人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)是引起鱗狀細胞癌的主要因素，HPV-cfDNA從原發(fā)腫瘤脫落到體循環(huán)中，通過cfDNA的液體活檢可以在治療和隨訪期間進行連續(xù)采樣，從而在早期疾病和治療后疾病進展中監(jiān)測HPV-cfDNA，具有高敏感性，可以用作篩查測定[43]。另外cfDNA可作為損傷的生物標志物，預測冠狀病毒感染的臨床結(jié)局[44]。綜上，基于cfDNA的檢測可以早期識別病毒性感染，并有效改善預后。

5 cfDNA用于其他病原體感染檢測

臨床對細菌、真菌、寄生蟲以外的其他病原體檢測能力極為不足，主要依賴癥狀出現(xiàn)后的篩查與對癥治療。Centeno et al[45]對10例傷寒立克次體感染患者采用mcfDNA測序，發(fā)現(xiàn)檢測的特異性達到100%，高于血清學檢測。Branda et al[46]對患者血漿中的伯氏疏螺旋體進行檢測，發(fā)現(xiàn)mcfDNA檢測的靈敏度為64%，顯著高于PCR(7%)及血清學(50%)檢測結(jié)果，聯(lián)合cfDNA和血清學檢測可將靈敏度提高到86%。Karius檢測是基于mcfDNA二代測序的非侵入性血液測試，可鑒定1 000多種細菌、DNA病毒、真菌和寄生蟲，國外已應用于臨床。Branda et al[46]采用Karius定量微生物檢測cfDNA方法，對游走性紅斑患者的血漿樣本進行分析，檢測到伯氏疏螺旋體及其他兩種媒介傳播的病原體：立克次體和土拉桿菌，后續(xù)對1例對照受試者進行土拉桿菌血清學檢測，結(jié)果為強陽性。

6 展望

作為一種微創(chuàng)快速的檢測病原方法，cfDNA日益廣泛用于感染性疾病病原檢測，成為臨床重要的輔助手段。病原體cfDNA從感染部位釋放到非侵入性樣本(如外周靜脈血、尿液等)中，其采樣過程相對無創(chuàng)，且實驗過程不需裂解細胞、檢測周期短，也可對多病原混合感染進行識別。結(jié)合納米孔測序可進一步縮短mcfDNA檢測周期，使得臨床快速識別病原體成為可能。對不同測序平臺中cfDNA識別病原體的能力進行評估，結(jié)果表明二代測序的敏感性和特異性可達到79%和91%，但檢測周期需要24 h以上，納米孔測序?qū)毦拿舾行院吞禺愋苑謩e達到75%和81%，且可在6 h內(nèi)完成病原體鑒定。在血流感染發(fā)生前就可以檢出病原cfDNA序列，即使是抗生素治療后仍然可以檢出，這為臨床感染的早期預警和篩查提供了重要參考。

樣本的cfDNA容易受到污染和干擾，測序分析對背景信號的降噪要求很高，通過對低生物量背景進行校正可提高檢測效果。此外，樣本采集及處理中的多個因素也會給cfDNA檢測靈敏度帶來影響，如：采樣管或尿液防腐劑的類型，樣本延遲處理，核酸提取試劑盒的選擇等，通過優(yōu)化樣本前處理方式及更高效的核酸提取方法對cfDNA的檢測至關重要?，F(xiàn)有的病原微生物的數(shù)據(jù)庫的完整性、數(shù)據(jù)更新速度和頻率等也影響基于cfDNA的病原檢測。同時，cfDNA作為一種短片段DNA，依賴二代測序平臺，測序成本高且檢測周期仍相對較長。納米孔測序?qū)Χ唐螜z測的數(shù)據(jù)量和準確性仍有一定局限，但相對于二代測序成本較低，且具有實時性。隨著納米孔測序技術的發(fā)展，短片段模式的開發(fā)，使得納米孔測序用于cfDNA檢測具有了可行性。隨著各種測序平臺技術與多種擴增等樣本處理方法的發(fā)展，cfDNA在臨床感染性疾病的診斷中將會發(fā)揮更重要的作用。