一種黏性止血雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的制備及性能評估

丁宇帆，蘇 睿，潘 釗，聞慧琴

大出血易并發(fā)休克危及生命一直是臨床棘手的問題，而早期止血可有效降低死亡率。近年來高質(zhì)量止血材料的發(fā)展，為臨床提供了多重選擇，大大保障了人民生命健康安全[1]。富水性的水凝膠材料因與細(xì)胞外基質(zhì)具有高度相似性，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域被廣泛研究。天然大分子水凝膠，如明膠、殼聚糖等，生物安全性高，但力學(xué)性能脆弱，特別是組織黏合性能的不足限制了其在止血領(lǐng)域的應(yīng)用[2]。構(gòu)建雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠是一種穩(wěn)定天然大分子水凝膠結(jié)構(gòu)、改善其力學(xué)性能的有效方法[3]。強生物黏附力可使材料牢固封堵出血位點。在水凝膠聚合物鏈中引入正電荷基團(tuán)后，可以吸附聚積血液中表面帶負(fù)電荷的血細(xì)胞，通過化學(xué)途徑促進(jìn)凝塊形成[4]。該研究通過光引發(fā)形成聚陽離子網(wǎng)絡(luò)，并與明膠網(wǎng)絡(luò)互穿，構(gòu)建出力學(xué)性能優(yōu)異、表面帶有正電荷的雙網(wǎng)絡(luò)黏性水凝膠，并通過力學(xué)性能測試和體外止血效果評估此水凝膠用于控制出血的可行性。

1 材料與方法

1.1 合成材料及主要儀器合成材料：丙烯酰胺(acylamide，AM)，明膠(gelatin)，甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨(methacryloxyethyltrimethyl ammonium chloride，METAC)，光引發(fā)劑1173購自上海阿拉丁公司；N,N-亞甲基雙丙烯酰胺(methylene-bis-acrylamide，MBA)購自美國Sigma-Aldrich公司。

主要儀器：恒溫磁力攪拌器(S10-3，上海思樂儀器有限公司)，真空紫外箱(自主設(shè)計，購自淘寶)，力學(xué)萬能測試機(Instron 5565A，美國英斯特朗公司)，推注泵(LSP01-1BH，蘭格恒流泵有限公司)，掃描電子顯微鏡(ZeissMerlin Compact，德國蔡司基團(tuán))。

1.2 水凝膠前驅(qū)液的配制分別稱取明膠1.25 g、AM 2.17 g、METAC 3.64 g，置于避光小棕瓶中，加入少量MBA和光引發(fā)劑1173后添加去離子水11.4 ml。60 °C水浴攪拌加熱至固體溶解、溶液澄清透明備用。

1.3 水凝膠的制備及微觀形貌觀測將前驅(qū)液注入提前準(zhǔn)備好的模板，氮氣保護(hù)下365 nm紫外燈交聯(lián)1h，脫模后制得目標(biāo)水凝膠。將成功交聯(lián)的水凝膠凍干脫水、蒸金、制樣后使用掃描電鏡(SEM)拍攝其截面微觀形貌。

1.4 水凝膠力學(xué)性能的評價拉伸強度測試使用力學(xué)萬能測試機完成。將水凝膠材料裁剪為長7.5 cm、寬2.5 cm的樣品，以50 mm/min速度拉伸，記錄拉伸位移與載荷。在組織黏合性能測試中，選取新鮮豬皮、豬肝臟、豬主動脈、豬脾臟和豬心肌組織為測試基底，采用搭接剪切試驗(美國材料與試驗學(xué)會國際標(biāo)準(zhǔn)ASTMF2255)評估水凝膠對幾種組織基底的黏合性能。

1.5 水凝膠體外止血效果評估

1.5.1體外全血凝結(jié)實驗 將直徑8 mm的圓形水凝膠置于潔凈24孔板中，取170 μl健康成人抗凝全血(3.2%枸櫞酸鈉，1 ∶9)滴加在待測水凝膠樣品表面，加入10 μl氯化鈣(0.2 mol/L)重鈣化后，在所需時間點用生理鹽水輕柔洗滌各孔，去除未凝結(jié)的游離紅細(xì)胞，至清洗液呈無色透明狀，觀察各孔血液凝結(jié)狀況。將1 min時間點洗滌后水凝膠固定、凍干，拍攝SEM圖片。

1.5.2體外皮膚出血模擬 體外皮膚出血通路是以豬皮模擬人體皮膚，將健康成人抗凝全血(3.2%枸櫞酸鈉，1 ∶9)用推注泵以400、300、200、100 μl/min速度從豬皮表面人為制造的缺損處擠出，模擬出血時血液從皮膚創(chuàng)口流出的過程，缺損處使用水凝膠止血封堵后，觀察血液滲漏狀態(tài)。

1.6 水凝膠血液相容性洗滌全血后制備5% 紅細(xì)胞懸液，分別在生理鹽水、去離子水、水凝膠浸出液中加入200 μl上述紅細(xì)胞懸液，37 °C共同孵育15 min后，測量各組在540 nm處的吸光度，計算得到各組溶血率。

2 結(jié)果

2.1 水凝膠制備流程及形態(tài)365 nm紫外光照下，均勻分散的AM和METAC水溶液在光引發(fā)劑1173和交聯(lián)劑MBA的作用下聚合為聚METAC-AM陽離子水凝膠，與溶液中溫度響應(yīng)交聯(lián)的明膠網(wǎng)絡(luò)互穿后形成雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠(MA水凝膠)(圖1)。SEM結(jié)果(圖2A)顯示該方法聚合制備水凝膠具有典型的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

2.2 力學(xué)性能評估拉伸強度采用拉伸測試，水凝膠的拉伸特征曲線以拉伸應(yīng)變?yōu)闄M坐標(biāo)，拉伸應(yīng)力為縱坐標(biāo)，結(jié)果如圖2B所示。相同條件下重復(fù)測試5個樣品，取平均值可得MA水凝膠的平均拉伸應(yīng)變?yōu)?08.65%，平均拉伸應(yīng)力可達(dá)46.42 kPa。

生物黏合能力使用接搭剪切試驗評估(圖3A)，分別用新鮮離體豬皮、豬肝臟、豬主動脈、豬脾臟、豬心臟作為測試基底，可觀察到MA水凝膠在各組織基底上呈現(xiàn)出不盡相同但趨勢一致的特征曲線(圖3B-3G)。多次測量統(tǒng)計后可發(fā)現(xiàn)五種組織基底中，MA水凝膠對豬皮的黏附力最大，動脈次之，脾臟和肝臟因表面光滑潮濕呈現(xiàn)最小的黏合力。

2.3 體外止血效果體外止血效果評估也分為兩部分。首先進(jìn)行體外全血凝結(jié)試驗，由圖4A各孔結(jié)果可看出，10 s時可見MA水凝膠表面吸附有大量紅細(xì)胞，1 min時即形成肉眼可見凝塊。SEM觀察結(jié)果顯示，1 min時水凝膠表面可見少量纖維蛋白包裹的紅細(xì)胞和伸出偽足的血小板，說明血小板被激活、凝血級聯(lián)發(fā)生(圖4B)。

在體外皮膚出血模擬評估實驗(圖4C)中，以400、300、200、 100 μl/min等多個速度模擬自由出血20 s后，MA水凝膠在150 s內(nèi)均可有效阻止血液從出血點泄露，明顯好于醫(yī)用紗布組(圖4D)，以200 μl/min的流速，使用150 s為示例。

2.4 血液相容性各組分別與紅細(xì)胞共孵育，測定并處理540 nm下吸光度值，得到圖4E。MA水凝膠的溶血率為4.51%，小于5%的國家標(biāo)準(zhǔn)，顯示材料良好的血液相容性。

圖2 MA水凝膠的理化性能

3 討論

創(chuàng)傷性出血不及時處理非常兇險，致殘致死率在臨床一直居高不下，因此早期快速止血、閉合創(chuàng)面是外科醫(yī)學(xué)的關(guān)鍵[5]。傳統(tǒng)止血材料以醫(yī)用紗布為代表，止血速度有限，且從創(chuàng)面移除時會對組織造成二次傷害。沸石類止血劑在緊急止血中應(yīng)用廣泛，但止血時伴有大量放熱，易繼發(fā)不良反應(yīng)?？纱x的纖維蛋白膠及人工合成氰基丙烯酸酯類膠黏劑近年來被應(yīng)用于臨床。但纖維蛋白膠封堵效果受弱的力學(xué)性能限制，無法提供穩(wěn)定的止血能力；氰基丙烯酸酯類膠黏劑由于爆聚反應(yīng)放出大量熱以及代謝產(chǎn)物的組織毒性使它無法應(yīng)用于內(nèi)腔止血[6]。

水凝膠因與人體細(xì)胞外基質(zhì)的理化性質(zhì)高度相似而在生物醫(yī)藥領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。針對傳統(tǒng)水凝膠材質(zhì)較脆弱、力學(xué)性能不足的問題，北海道大學(xué)研究團(tuán)隊成功構(gòu)建了一種既強又韌的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠體系，被廣泛應(yīng)用于各類水凝膠力學(xué)性能的改善，為水凝膠在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的運用提供材料基礎(chǔ)[7]。在此基礎(chǔ)上，陸軍軍醫(yī)大學(xué)研究團(tuán)隊將凝血酶HC引入水凝膠，成功制備出“超級止血黏合劑”，將體外止血時間縮短至45 s[8]。麻省理工學(xué)院研究團(tuán)隊仿照藤壺膠的作用原理，開發(fā)出一種在溫和壓力下15 s內(nèi)與創(chuàng)面組織形成牢固黏附的水凝膠基糊劑，賦予其不依賴天然凝血機制的封堵止血功能[9]。雖然已發(fā)展的水凝膠止血材料體系性能優(yōu)異，但止血性能的發(fā)揮多依賴于單一的化學(xué)信號激活凝血系統(tǒng)，或物理封堵避免血液流失，鮮有同時利用兩種止血機制協(xié)同作用進(jìn)一步提升水凝膠止血性能的報道。

圖3 MA水凝膠的生物黏合性能

圖4 MA水凝膠的止血性能評估

本研究構(gòu)建了一種黏性止血雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠，通過水凝膠分子鏈基團(tuán)設(shè)計，實現(xiàn)物理化學(xué)協(xié)同止血機制。首先基于低免疫原型、生物相容性和可降解性的需求，采用天然高分子明膠作為強網(wǎng)絡(luò)[10]。以丙烯酰胺為主體材料[11]，以陽離子單體METAC為功能單元[12]，共聚形成柔性水凝膠網(wǎng)絡(luò)。拉伸強度測試揭示MA水凝膠具有優(yōu)異的拉伸性能，為材料閉合創(chuàng)口、封堵出血提供支撐作用。生物黏合性能測試發(fā)現(xiàn)，MA水凝膠對多種組織都具有非常牢固的黏合效果(圖2B、2C，圖3)，為材料閉合創(chuàng)口、封堵出血提供附著基礎(chǔ)。體外皮膚出血模擬實驗也證實MA水凝膠可有效封閉出血點，達(dá)到快速止血目的。MA水凝膠中METAC分子提供的豐富正電荷，與血液接觸后，可以快速中和紅細(xì)胞和血小板表面的負(fù)電荷，促進(jìn)血細(xì)胞之間相互聚集，對血凝塊的形成和收縮起正向調(diào)控作用[13]。與此同時，明膠分子可以活化血小板，加速纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)的生成[14]。體外全血凝結(jié)實驗顯示，MA水凝膠可有效地將凝塊出現(xiàn)時間從6 min縮減至1 min，表明MA水凝膠具有良好的促凝血能力。全血孵育后水凝膠的SEM觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)生凝血時，紅細(xì)胞與血小板首先黏附于材料上，隨后血小板被激活發(fā)生形變，互相聚集并連接纖維蛋白，促使纖維蛋白包裹在紅細(xì)胞表面，最終形成凝塊。但不能忽視的是丙烯酰胺類水凝膠的溶脹體積變化是其應(yīng)用的限制之一，關(guān)于此種止血材料的研發(fā)應(yīng)針對該類水凝膠吸水性的調(diào)控做進(jìn)一步的延伸性研究。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了一種黏性止血雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠，通過與創(chuàng)口組織表面形成牢固黏合作用，實現(xiàn)物理封堵止血；同時水凝膠網(wǎng)絡(luò)中的陽離子活性基團(tuán)，通過靜電相互作用，吸附帶負(fù)電的紅細(xì)胞和血小板，并激活化學(xué)凝血程序，實現(xiàn)化學(xué)止血。該水凝膠采用的物理化學(xué)協(xié)同止血機制，實現(xiàn)了快速、穩(wěn)定止血效果，為止血材料的設(shè)計提供新思路，為臨床出血管理技術(shù)的發(fā)展提供了材料基礎(chǔ)。