腹腔注射同種異體糞便濾液建立大鼠膿毒癥模型

劉 輝，劉軍超，王偉寶，杜會(huì)博，李福龍，牛春雨，趙自剛,5

嚴(yán)重感染以及由創(chuàng)傷、燒傷等嚴(yán)重致病因素引起腸道菌群移位，導(dǎo)致細(xì)菌入血并快速繁殖，造成機(jī)體免疫功能失衡，從而引發(fā)膿毒癥[1]。膿毒癥病情急驟，病死率極高，研究其病理生理機(jī)制以探尋有效的治療措施，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，因此建立穩(wěn)定、可靠、符合臨床實(shí)際的膿毒癥動(dòng)物模型就顯得尤為重要。目前，建立動(dòng)物模型的方法主要以靜脈輸入脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)或菌液、腹腔注射LPS或菌液、盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)、結(jié)腸支架植入腹膜炎(colon ascendens stent peritonitis，CASP)等最為常見[2]，但這模型均在不同程度上存在一些優(yōu)缺點(diǎn)。臨床研究[3]顯示膿毒癥第二大致病因素為腹腔感染，因此，該研究結(jié)合文獻(xiàn)[4]報(bào)道并進(jìn)行改良后，采取向大鼠腹腔內(nèi)注射同種異體糞便濾液的方法建立模型，用以反映腹腔感染引起膿毒癥的臨床病程，旨在探索一種更簡便、穩(wěn)定、重復(fù)性好的膿毒癥模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠48只，購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司(許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0010)，260～300 g。大鼠在清潔環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于本實(shí)驗(yàn)，環(huán)境溫度(23±2)℃，濕度40%～60%，12 h晝夜交替，自由飲食。所有動(dòng)物管理與實(shí)驗(yàn)流程均依據(jù)河北北方學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例進(jìn)行，并得到河北北方學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理批準(zhǔn)編號(hào)：2021-1-9-10。

1.2 主要試劑及儀器戊巴比妥鈉(P11011)購自德國默克公司；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素-6(interleukin-6, IL-6)、D-乳酸(D-lactic acid, D-LA)、血清腸型脂肪酸結(jié)合蛋白(serum intestinal fatty acid binding protein, I-FABP)試劑盒(批號(hào)分別為CD31063、CD30219、CD30088、CD30257)購自武漢純度生物科技有限公司；血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase, AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT)試劑盒(批號(hào)分別為101370、102370)購自北京艾威德醫(yī)療科技有限公司；BUN、Cr試劑盒[批號(hào)分別為3030-717(S)、3020-717(S)]購自寧波瑞源生物科技有限公司。小動(dòng)物肺功能檢測系統(tǒng)(Buxco)購自美國Data Sciences International (DSI)公司；無創(chuàng)血壓監(jiān)測儀(BP-2010A)購自北京軟隆生物科技有限公司；全自動(dòng)生化檢測儀(7600-010型)購自日立公司；自動(dòng)脫水機(jī)(ASP200S型)購自德國Leica公司；光學(xué)顯微鏡(CKX31型)購自日本Olympus公司。

1.3 同種異體大鼠糞便濾液的制備參照文獻(xiàn)[4]以腹腔注射自體糞便制備大鼠膿毒癥模型的方法，本研究經(jīng)過改良創(chuàng)新后采取注射糞便濾液的方式實(shí)施。收集正常大鼠糞便，在(23±2)℃、濕度30%～50%的清潔環(huán)境中自然晾曬3 d，使其充分干燥；然后，將干燥糞便充分研磨后，采用規(guī)格為0.5 mm的尼龍網(wǎng)過濾器去除顆粒物，制備糞便粉末；取糞便粉末，按照1 g/10 ml的濃度加入5%葡萄糖，室溫靜置1 h，放入搖床充分混勻后，用網(wǎng)眼大小0.5 mm×0.5 mm的尼龍布過濾，留取濾液，用于腹腔注射。

1.4 大鼠膿毒癥模型的建立與生存率觀察分別按照0.5、1、2 g/kg的劑量給大鼠進(jìn)行腹腔注射(分別為SP1、SP2、SP3組，每組6只。為了保證腹腔注射濾液的體積一致，0.5 g/kg組所用濾液加3倍生理鹽水，1 g/kg組所得濾液加等量生理鹽水，然后以20 ml/kg的劑量依次進(jìn)行腹腔注射，對(duì)照組(n=6)腹腔注射等體積的生理鹽水。腹腔注射糞便濾液后，將每只大鼠置于獨(dú)立的飼養(yǎng)籠中，觀察大鼠一般情況，通過視頻監(jiān)控系統(tǒng)記錄大鼠生存率。腹腔注射糞便濾液24 h后，測量存活大鼠的體溫、心率，并應(yīng)用無創(chuàng)血壓監(jiān)測儀測量大鼠的平均動(dòng)脈血壓(mean arterial pressure, MAP)。超過72 h存活的大鼠視為長期存活，腹腔注射過量戊巴比妥鈉麻藥實(shí)施安樂死。

結(jié)合嚴(yán)重腹腔感染誘發(fā)膿毒癥患者未實(shí)施治療的死亡率在70%～80%之間[5]，根據(jù)各組大鼠的存活時(shí)間，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇1 g/kg劑量建立模型。實(shí)驗(yàn)過程中，參照膿毒癥嚴(yán)重程度評(píng)價(jià)，統(tǒng)計(jì)以1 g/kg劑量建立膿毒癥模型的造模成功率，并觀察造模成功與失敗大鼠腹腔腸管病變情況。同時(shí)，將12只大鼠均分為對(duì)照組、膿毒癥組，觀察肺、肝、腎功能與組織結(jié)構(gòu)、血清炎癥因子等指標(biāo)。

1.5 大鼠膿毒癥嚴(yán)重程度評(píng)價(jià)隨機(jī)選取以1 g/kg 劑量建立膿毒癥模型的18只大鼠，參照動(dòng)物膿毒癥嚴(yán)重程度評(píng)價(jià)表[6]，評(píng)估變量包括外觀表現(xiàn)、意識(shí)狀態(tài)、活動(dòng)量、對(duì)觸覺和聽覺刺激的反應(yīng)、眼睛閉合程度、呼吸頻率和性質(zhì)(勞力性呼吸困難)。每個(gè)變量評(píng)分在0～4之間，總分值大于10分為中重度膿毒癥。在評(píng)分基礎(chǔ)上，統(tǒng)計(jì)造模成功率，并觀察造模成功與失敗大鼠腹腔腸管病變情況。

1.6 大鼠肺功能檢測大鼠在腹腔注射糞便濾液后24 h或?qū)φ战M大鼠在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，應(yīng)用Buxco小動(dòng)物肺功能檢測系統(tǒng)檢測肺功能。方法如下：1%戊巴比妥鈉(5 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，10 min后將大鼠固定于小動(dòng)物手術(shù)臺(tái)，充分暴露頸部皮膚并備皮，采用頸部正中切口依次分離皮下組織、頸部肌肉，暴露氣管，于氣管第3～4軟骨環(huán)做切口，用內(nèi)徑3 mm的氣管導(dǎo)管插管并用手術(shù)縫線結(jié)扎固定，穩(wěn)定5 min后將大鼠放入體積描記艙內(nèi)，待大鼠適應(yīng)艙內(nèi)環(huán)境后將氣管導(dǎo)管連接在呼吸閥上，關(guān)閉艙體，依次檢測功能殘氣量(functional residual capacity，F(xiàn)RC)、氣道阻力(airway resistance，RI)、前100毫秒用力呼氣容積(forced breath volume at the 100th millisecond，F(xiàn)EV100)、呼氣峰流量(peak expiratory flow，PEF)、動(dòng)態(tài)肺順應(yīng)性(dynamic lung compliance，Cdyn)、深吸氣量(inspiratory capacity，IC)。

1.7 血清炎性因子及生化指標(biāo)檢測活體肺功能檢測結(jié)束后，做腹部正中切口，逐層分離腹部肌肉，探查暴露腹主動(dòng)脈后，用一次性采血針穿刺取血2 ml，3 000 r/min離心15 min，取上清液，采用ELISA法檢測TNF-α、IL-6、D-LA、I-FABP濃度。采用7600-010型全自動(dòng)生化檢測儀檢測血清AST、ALT、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，Cr)水平反應(yīng)肝、腎功能變化。

1.8 肺、肝、腎組織結(jié)構(gòu)觀察取固定位置肺、肝、腎組織于4%多聚甲醛固定24 h后，修塊，使用自動(dòng)脫水機(jī)脫水后，常規(guī)石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡觀察各組織結(jié)構(gòu)變化。采用等級(jí)評(píng)分對(duì)肺組織損傷程度進(jìn)行評(píng)價(jià)[7]：0分為無任何病理改變；1分為病變范圍<25%；2分為病變范圍 25%～50%；3分為病變范圍 51%～75%；4分為病變范圍>75%。依據(jù)文獻(xiàn)[8]對(duì)肝腎組織損傷程度進(jìn)行評(píng)價(jià)。肝組織：0分為未見異常；1分為滿足以下條件中的三項(xiàng)且必須包含①：① 匯管區(qū)有中性粒細(xì)胞浸潤，② 肝細(xì)胞腫脹，③ 肝細(xì)胞嗜酸性變，④ 肝細(xì)胞灶性壞死，⑤ 肝細(xì)胞可見雙核現(xiàn)象，⑥ 庫普弗細(xì)胞增殖、肥大；2分為在滿足評(píng)分1分的前提下有散在肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死；3分為在評(píng)分2分的基礎(chǔ)上有肝細(xì)胞大片壞死。腎臟組織：0分為未見異常；1分為腎小球未見明顯異常，腎小管上皮腫脹，管腔狹窄，蛋白管型，腎間質(zhì)水腫；2分為腎小球毛細(xì)血管充血，腎小管上皮壞死，間質(zhì)水腫，炎性細(xì)胞浸潤；3分為在評(píng)分2分基礎(chǔ)上可見腎小管上皮片狀壞死。

2 結(jié)果

2.1 大鼠生存率的觀察觀察注射不同劑量糞便濾液大鼠的生存情況并記錄死亡時(shí)間，如圖2所示，建模24 h內(nèi)，SP1組100%(6/6)存活，SP2組83.3%(5/6)存活，SP3組全部死亡；建模48 h內(nèi)，SP1組83.3%(5/6)存活，SP2組16.7%(1/6)存活；建模72 h內(nèi)，SP1組66.7%(4/6)存活，SP2組16.7%(1/6)存活；對(duì)照組全部存活，見圖1。

圖1 腹腔注射同種異體糞便濾液后大鼠生存狀況

2.2 大鼠的一般狀況腹腔注射同種異體糞便濾液24 h后，大鼠表現(xiàn)為精神倦怠，行動(dòng)遲緩，毛發(fā)無光澤，背部豎毛，寒戰(zhàn)，喘息樣呼吸，口周有血性分泌物，眼角帶血絲、病變嚴(yán)重者伴隨拉惡臭稀便等情況，見圖2。

2.3 大鼠體溫、心率、MAP的變化腹腔注射同種異體糞便濾液后24 h，SP1組大鼠體溫、心率、MAP與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；SP2組大鼠體溫、心率明顯高于對(duì)照組、SP1組(P<0.01，P<0.05)，MAP明顯低于對(duì)照組、SP1組(P<0.01，P<0.05)。由于SP3組大鼠在24 h內(nèi)全部死亡，故未觀察這些指標(biāo)。

圖2 大鼠一般狀況觀察

表1 腹腔注射同種異體糞便濾液24 h后體溫、心率、MAP的變化

2.4 大鼠膿毒癥嚴(yán)重程度評(píng)價(jià)以及造模成功率的觀察本研究采用1 g/kg質(zhì)量糞便制備濾液建立膿毒癥模型的大鼠共18只，建模24 h后對(duì)模型情況進(jìn)行評(píng)價(jià)，依據(jù)膿毒癥嚴(yán)重程度評(píng)分量表，有14只大鼠評(píng)分大于10分，結(jié)合生命體征的變化和剖腹后肺、肝、腎臟充血水腫，腸管腫脹壞死，膿性或血性惡臭腹腔積液，即判定大鼠出現(xiàn)了中重度膿毒癥表現(xiàn)，造模成功率為77.8%(14/18)。對(duì)建模失敗的大鼠麻醉后剖腹探查發(fā)現(xiàn)，大網(wǎng)膜的包裹使炎癥局限，腹腔炎性病變較輕，見圖3。

圖3 不同轉(zhuǎn)歸大鼠腹部解剖外觀

2.5 膿毒癥大鼠肺功能及形態(tài)學(xué)的變化與對(duì)照組比較，膿毒癥組大鼠FRC、Cdyn、FEV100、PEF明顯下降，RI、IC明顯增高(P<0.05)，見圖4。膿毒癥組大鼠肺臟外觀可見充血水腫，組織濕干比值高于對(duì)照組(P<0.05)；組織學(xué)觀察顯示，膿毒癥組大鼠肺泡間隔增寬、大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡壁增厚、肺泡腔變小，對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)基本正常；膿毒癥組大鼠肺組織損傷評(píng)分高于對(duì)照組(P<0.05)，見圖5。

2.6 膿毒癥大鼠肝、腎功能與形態(tài)學(xué)的變化圖6所示，與對(duì)照組相比，膿毒癥組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)紊亂，球-囊間隙擴(kuò)大，腎小管細(xì)胞水腫；肝細(xì)胞出現(xiàn)輕度水腫，匯管區(qū)有炎性細(xì)胞浸潤。膿毒癥組大鼠肝臟和腎臟的病理學(xué)評(píng)分以及血清ALT、AST、BUN、Cr濃度均高于對(duì)照組(P<0.05)。

2.7 膿毒癥大鼠血清炎性因子的變化與對(duì)照組相比，膿毒癥組大鼠TNF-α、IL-6濃度明顯增高(P<0.05)，見圖7。

圖4 膿毒癥大鼠肺功能變化

圖6 膿毒癥大鼠肝腎功能及組織形態(tài)學(xué)變化

圖7 膿毒癥大鼠血清炎性因子變化

2.8 膿毒癥大鼠血清D-LA、I-FABP的變化與對(duì)照組相比，膿毒癥組大鼠血清D-LA、I-FABP的濃度明顯增高(P<0.05)，見圖8。

圖8 膿毒癥大鼠血清D-LA、I-FABP的變化

3 討論

動(dòng)物模型的可信性、重復(fù)性、相似性是評(píng)價(jià)模型應(yīng)用價(jià)值的主要指標(biāo)。膿毒癥的病理生理機(jī)制極其復(fù)雜，病死率仍居高不下，因此建立膿毒癥動(dòng)物模型并深入研究其病理生理機(jī)制，對(duì)于降低膿毒癥病死率、致殘率具有非常重要的意義。

目前人類膿毒癥診斷主要是依據(jù)SOFA評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，通過對(duì)意識(shí)狀態(tài)、心血管、呼吸、腎、肝和血小板功能的綜合判斷來確診，但這一評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)并不適用于動(dòng)物模型。故本研究對(duì)動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)主要依據(jù)目前較常用的大鼠膿毒癥評(píng)分表，并結(jié)合大鼠一般狀態(tài)和生命體征參數(shù)、自然死亡率、炎癥反應(yīng)、受累靶器官組織學(xué)改變等方面指標(biāo)，以及傳統(tǒng)動(dòng)物模型全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)診斷標(biāo)準(zhǔn)中的體溫與心率變化進(jìn)行判斷，進(jìn)一步觀察肺、肝、腎功能與組織結(jié)構(gòu)變化，多方面驗(yàn)證本模型的可信性。

本研究顯示，注射糞便濾液后大鼠出現(xiàn)不同程度精神狀態(tài)、活動(dòng)量的改變，同時(shí)體溫升高、心率增快、呼吸增快、血壓降低、腹腔存在嚴(yán)重感染，這些指征均支持膿毒癥的診斷。研究[9]顯示血清TNF-α、IL-6在造模后24 h明顯升高，提示發(fā)生了早期炎癥反應(yīng)。肺臟是膿毒癥最易累及的靶器官之一，SIRS發(fā)生后免疫細(xì)胞激活并釋放大量的炎癥因子，從而造成肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞活化、白細(xì)胞遷移、毛細(xì)血管滲漏、肺間質(zhì)水腫、肺不張等病理變化[10]，本研究建模后24h大鼠肺功能出現(xiàn)明顯異常，氣道阻力增加，功能殘氣量降低，肺順應(yīng)性下降，這些指標(biāo)均表明膿毒癥后出現(xiàn)肺功能障礙，結(jié)合肺組織結(jié)構(gòu)以及反映水腫的濕干比指標(biāo)的變化，證明了肺損傷的存在。D-LA是胃腸道微生物糖酵解后的產(chǎn)物，腸屏障損傷后，腸黏膜通透性增加，D-LA釋放入血[11]。I-FABP由腸黏膜頂端成熟的腸細(xì)胞釋放，生理?xiàng)l件下，外周血中I-FABP含量很少，腸損傷后血清I-FABP水平明顯增高[12]，本研究結(jié)果顯示血清D-LA和I-FABP水平明顯增高，表明膿毒癥后出現(xiàn)了腸組織損傷。腎臟、肝臟也存在不同程度的細(xì)胞水腫和炎性細(xì)胞浸潤，并伴有肝腎功能血清生化指標(biāo)的增高。以上這些器官的病理變化支持“機(jī)體對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙”這一最新膿毒癥的定義[13]。對(duì)模型剖腹觀察發(fā)現(xiàn)，膿毒癥大鼠腹腔廣泛粘連、腸管水腫壞死、大量惡臭腹水滲出，進(jìn)一步佐證了該模型的成功建立。本研究注射不同劑量糞便濾液后，通過觀察大鼠注藥后一般狀態(tài)、生命體征和生存率篩選出適合后期研究的藥物劑量，參考膿毒癥嚴(yán)重程度評(píng)價(jià)量[6]對(duì)造模成功率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，成功率在77.8%，滿足建模要求。

內(nèi)源性糞便污染造成的膿毒癥模型，很好地模擬了臨床上腹膜炎導(dǎo)致膿毒癥的發(fā)病過程。CLP是目前常用的膿毒癥模型制備方法[14]，病變通常在術(shù)后48 h顯著，但是盲腸結(jié)扎的長度、穿刺針大小、術(shù)者技術(shù)都直接影響模型的成功率，建模過程需要反復(fù)探索，耗費(fèi)時(shí)間，重復(fù)性差。CASP模型需要較高難度的技術(shù)。與CLP或CASP相比，本研究所用的腹腔注射糞便濾液方法，動(dòng)物不需要接受麻醉與外科手術(shù)，沒有麻醉與手術(shù)對(duì)動(dòng)物的影響，只需要簡單的腹腔注射即可。因此，從方法學(xué)上來說，本模型操作更為簡便。

靜脈或腹腔注射LPS、菌液的模型，具有損傷小、易于操作的優(yōu)點(diǎn)，通過調(diào)節(jié)LPS的數(shù)量及其生物活性模擬革蘭陰性桿菌引起的膿毒癥。然而，其不能誘導(dǎo)多重微生物感染的膿毒癥，另外有研究[15]顯示，LPS敏感性存在種內(nèi)和種間差異，大鼠LPS的半數(shù)致死量劑量大約比人類引起嚴(yán)重疾病和低血壓所需的劑量大1 000到10 000倍，這可能與大鼠血清中的一種與鐵結(jié)合的急性期蛋白血凝素有關(guān)，其可以抑制外周血單核細(xì)胞在內(nèi)毒素等刺激時(shí)產(chǎn)生促炎因子。同時(shí)，LPS或菌液的制備方法復(fù)雜，價(jià)格也比較昂貴。因此，與LPS相比，通過注射糞便濾液誘導(dǎo)多重微生物引發(fā)的腹腔感染，最大限度模擬了臨床上急性腹膜炎、腸源性感染造成的膿毒癥狀態(tài)，更接近臨床，同時(shí)糞便濾液的制備方法簡單，獲取容易，不需要經(jīng)費(fèi)。

對(duì)于應(yīng)用注射糞便濾液而言，國內(nèi)外學(xué)者也曾經(jīng)進(jìn)行了一些探討。Carrara et al[4]應(yīng)用同種同體糞便濾液建立了豬膿毒癥模型，消除了種屬不同的不足，但由于糞便濾液來自濕的糞便，不能很好地進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，這就增加了不同個(gè)體間的差異。為此，本研究對(duì)上述方法進(jìn)行了改良，首先，用同種糞便消除了種屬不同的不足；其次，將糞便自然干燥，一次性制備大量的糞便濾液，保證了糞便濾液的同質(zhì)化，最大限度減少了糞便來源對(duì)動(dòng)物個(gè)體的影響。糞便自然干燥的方法相比其他脫水方法(如低、高溫烘干或微波干燥)而言，病原體的變化不大，但本研究并沒有應(yīng)用腸道菌群及其代謝組學(xué)分析糞便濾液與腸道“原生態(tài)”病原微生物譜及毒素的差異，這也是今后需要進(jìn)一步關(guān)注的問題。