殼寡糖的制備及其對(duì)三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎模型的治療作用

胡 凱，何 歡，袁曉箏，喬 靜

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是臨床常見的慢性消化道疾病，包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎[1]。炎癥性腸病的發(fā)病機(jī)制尚不明確，現(xiàn)有的研究支持黏膜免疫失調(diào)在IBD發(fā)病機(jī)制中的核心作用，進(jìn)而導(dǎo)致黏膜屏障破壞和纖維化病變[2]。在腸道黏膜免疫中，核因子kappa-B(nuclear factor kappa-B, NF-κB)炎癥通路被激活，進(jìn)一步誘導(dǎo)白細(xì)胞介素1β(interleukin 1 beta, IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)的表達(dá)，過(guò)量的TNF-α進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)[3]。

殼寡糖(chitosan oligosaccharide, COS)是一種海洋多糖，它是一種天然抗氧化劑。有研究[4]表明，COS具有免疫調(diào)節(jié)活性，包括抑制NF-κB信號(hào)通路的激活及其下游反應(yīng)。關(guān)于COS治療IBD的相關(guān)研究尚少。該研究將COS用于2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitro-benzene sulfonic acid, TNBS)誘導(dǎo)的大鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型的治療，探究COS對(duì)炎癥、黏膜屏障和腸纖維化方面的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley大鼠24只，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)溫度(22±2)℃，濕度50%，12 h光照與12 h黑暗交替。

1.1.2主要材料 TNBS購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。殼聚糖購(gòu)自青島弘海生物技術(shù)有限公司。IL-1β、TNF-α和白細(xì)胞介素6(interleukin 6, IL-6)ELISA試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。NF-κB1抗體購(gòu)自中國(guó)博士德生物工程有限公司。collagen I、α-SMA抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。Masson染液試劑盒、糖原PAS染液購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1COS的制備與表征 取40 g殼聚糖于400 ml蒸餾水中，攪拌使其充分溶解，調(diào)節(jié)pH至5.5，將殼聚糖酶加到反應(yīng)體系中，于40 ℃恒溫水浴鍋中攪拌反應(yīng)48 h，之后65 ℃水浴反應(yīng)1h來(lái)滅活殼聚糖酶。4 000 r/min離心10 min后收集反應(yīng)產(chǎn)物，將產(chǎn)物置于-80 ℃過(guò)夜后進(jìn)行真空冷凍干燥，得到酶解產(chǎn)物COS。對(duì)產(chǎn)物采用KBr壓片法進(jìn)行紅外光譜(FTIR)檢測(cè)。電離質(zhì)譜(ESI-MS)檢測(cè)：取20 mg COS樣品溶解于甲醇中，使用三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)生成樣品的電離質(zhì)譜圖。薄層色譜法用來(lái)鑒定殼聚糖酶解產(chǎn)物，使用的展開劑為異丙醇、氨水和水。產(chǎn)物上樣量為1 μl，待不同的COS單體爬板完成后用大茴香醛顯色。核磁共振(1HNMR)檢測(cè)：稱取一定量的酶解產(chǎn)物樣品溶解在D2O中，震蕩溶解后轉(zhuǎn)移至核磁管中，管中加入數(shù)滴丙酮作為內(nèi)參，采用核磁共振儀獲取COS的1HNMR圖譜。

1.2.2動(dòng)物模型的構(gòu)建和管理 實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，采用隨機(jī)分組法將大鼠均分為正常對(duì)照組(CON)、結(jié)腸炎模型組(TNBS)、5-氨基水楊酸(5-aminosalicylic acid, 5-ASA)治療組(TNBS+5-ASA)、COS治療組(TNBS+COS)。大鼠造模前12 h禁食，將1根直徑約2 mm 連接5 ml注射器的導(dǎo)管由肛門緩慢插入結(jié)腸腔內(nèi)約8 cm處，隨后將1 ml結(jié)腸炎誘導(dǎo)劑(50%乙醇溶液為溶劑+100 mg/kg TNBS)推入導(dǎo)管，最后將大鼠尾巴提起，持續(xù)倒置1 min。造模結(jié)束后第2天開始灌胃給予治療劑0.5 ml，灌腸劑及治療劑設(shè)置如下：CON組(50%乙醇溶液+蒸餾水)、TNBS組(結(jié)腸炎誘導(dǎo)劑+蒸餾水)、TNBS+5-ASA組(結(jié)腸炎誘導(dǎo)劑+120 mg/kg 5-ASA)、TNBS+COS組(結(jié)腸炎誘導(dǎo)劑+120 mg/kg COS)。每天給藥1次，連續(xù)14 d。使用內(nèi)窺鏡對(duì)大鼠結(jié)腸進(jìn)行觀察。實(shí)驗(yàn)期間對(duì)疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index, DAI)進(jìn)行評(píng)估，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1[5]。在灌胃后的第14天，戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心10 min，分離血清置于-80 ℃冰箱保存，用于細(xì)胞因子檢測(cè)。分離結(jié)腸組織，拍照后取病變明顯處分別用于固定包埋，5 μm切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色、糖原PAS染色、Masson染色及免疫組織化學(xué)染色。

表1 DAI評(píng)分

1.2.3組織病理學(xué)檢查 病理染色后，光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)視野進(jìn)行觀察，并進(jìn)行組織病理學(xué)計(jì)數(shù)和評(píng)分[6]。

1.2.4細(xì)胞因子和生化指標(biāo)測(cè)定 ELISA試劑盒檢測(cè)各組大鼠血清IL-1β、TNF-α和IL-6的含量。血細(xì)胞分析儀檢測(cè)全血中紅細(xì)胞(red blood cell, RBC)、血紅蛋白(hemoglobin, HGB)、血清總蛋白(total protein, TP)和血漿白蛋白(albumin, ALB)含量。

1.2.5免疫組化檢測(cè) 檢測(cè)結(jié)腸組織中NF-κB1、collagen I和α-SMA的表達(dá)。NF-κB1、collagen Ⅰ、α-SMA的一抗稀釋濃度分別為1 ∶100、1 ∶200和1 ∶500，以磷酸鹽緩沖液(PBS)作為陰性對(duì)照。使用ImageJ軟件對(duì)陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.2 大鼠日常狀態(tài)觀察和體質(zhì)量變化CON組大鼠精神狀態(tài)良好、毛色光澤、活動(dòng)靈敏、飲食水正常。造模大鼠在TNBS造模處理后第2天出現(xiàn)異常，TNBS造成的結(jié)腸損傷明顯，大鼠飲食飲水量明顯減少，出現(xiàn)腹瀉，動(dòng)作遲緩，精神萎靡不振，體質(zhì)量下降。大部分出現(xiàn)便血。使用內(nèi)窺鏡對(duì)大鼠結(jié)腸進(jìn)行觀察(圖2A)，與TNBS組相比，TNBS+COS組恢復(fù)的更快。TNBS組DAI評(píng)分高于TNBS+COS組(P<0.01)(圖2C)。

2.3 COS對(duì)結(jié)腸炎大鼠腸道功能恢復(fù)的影響大鼠的血液學(xué)分析表明(表2)，與TNBS組相比，TNBS+COS組的HGB顯著升高(P<0.01)。COS治療后增加了血漿蛋白含量(TP和ALB)(P<0.01)。

2.4 COS對(duì)結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織病理的影響大鼠結(jié)腸組織的HE染色結(jié)果如圖所示，TNBS造成的損傷明顯，TNBS組黏膜層空泡變性并伴有強(qiáng)烈的炎癥浸潤(rùn)、肌肉層變性和腸系膜增生(圖3A)。與TNBS組相比，TNBS+COS組減輕了炎癥浸潤(rùn)(P<0.01)。Masson染色顯示與CON組相比，TNBS組明顯的膠原纖維增多(圖3B)。COS治療組細(xì)胞外基質(zhì)沉積與TNBS組有顯著性差異(P<0.01)。

圖1 COS的表征

TNBS的誘導(dǎo)不僅使杯狀細(xì)胞數(shù)量減少，還引起杯狀細(xì)胞空泡變形，導(dǎo)致黏膜層破壞。與TNBS組相比，COS組的杯狀細(xì)胞數(shù)量增多(P<0.01)。

2.5 COS對(duì)結(jié)腸炎大鼠血清細(xì)胞因子的影響通過(guò)ELISA法檢測(cè)大鼠血清中的細(xì)胞因子含量，結(jié)果顯示，與TNBS組相比，TNBS+COS組IL-1β、TNF-α、IL-6水平均下降(P<0.01)，見表3。

2.6 COS對(duì)結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸NF-κB1、collagen Ⅰ、α-SMA表達(dá)的的影響通過(guò)免疫組化檢測(cè)大鼠結(jié)腸組織的NF-κB1的表達(dá)，與TNBS組相比，COS處理后NF-κB1表達(dá)下降(圖4A)(P<0.01)。免疫組化的結(jié)果顯示，與TNBS+COS組相比，TNBS組出現(xiàn)明顯的collagen Ⅰ和α-SMA陽(yáng)性區(qū)域。TNBS+COS組α-SMA表達(dá)減少與TNBS組有顯著性差異(P<0.01)。

3 討論

IBD是一種腸道慢性炎癥性疾病，近年來(lái)發(fā)病率逐年升高并且難以治愈。目前臨床上主要使用5-ASA制劑、免疫抑制劑和糖皮質(zhì)激素來(lái)治療，但是均存在藥物不良反應(yīng)，因此尋找開發(fā)一種新型安全的藥物顯得尤為重要。

COS是無(wú)毒害作用的小分子海洋天然產(chǎn)物，容易被機(jī)體吸收，具有很多被證實(shí)的生物學(xué)功能。在生物醫(yī)藥方面，COS能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并起到免疫調(diào)節(jié)作用，在生物醫(yī)學(xué)工程方面COS可用做基因遞送的載體、抗菌材料、表皮傷口敷料等，其緩解炎癥作用已得到公認(rèn)和重視[7]。但是將COS的抗炎作用運(yùn)用到IBD治療方面的報(bào)道很少。本研究使用已經(jīng)成熟的TNBS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性大鼠結(jié)腸炎模型技術(shù)，利用120 mg/kg COS進(jìn)行干預(yù)治療。TNBS刺激腸道上皮會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞過(guò)度活化，釋放大量的炎癥因子IL-6、TNF-α等，從而造成炎癥[8-9]。因此，抑制炎癥因子的釋放有利于減輕炎癥反應(yīng)。在腸道上皮細(xì)胞的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，COS則被證實(shí)能抑制這些炎癥因子釋放[10-11]。LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞中IL-6、TNF-α過(guò)量表達(dá)，COS干預(yù)后能夠抑制他們的上調(diào)[12]。與上述結(jié)果一致的是，本研究檢測(cè)大鼠血清中炎癥因子含量，發(fā)現(xiàn)COS處理后能有效緩解TNBS誘導(dǎo)的IL-6、TNF-α上調(diào)。

圖2 大鼠日常狀態(tài)觀察

表2 各組大鼠血液中RBC、HGB、TP和ALB含量變化

圖3 結(jié)腸組織病理染色結(jié)果

表3 大鼠血清細(xì)胞因子含量

圖4 結(jié)腸組織免疫組化結(jié)果

腸道組織是體內(nèi)重要的免疫代謝調(diào)控器官，其穩(wěn)態(tài)的維持對(duì)于腸道生理功能的發(fā)揮和抵抗病原微生物的侵入至關(guān)重要。在健康的結(jié)腸中，黏液層厚達(dá)1 mm，并且每小時(shí)進(jìn)行一次完整的更新，主要是由杯狀細(xì)胞形成[13]。通過(guò)對(duì)大鼠結(jié)腸的PAS染色結(jié)果觀察可知，TNBS組大鼠的腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量減少。而經(jīng)過(guò)COS處理后，以上情況得到了緩解。說(shuō)明COS通過(guò)增加杯狀細(xì)胞數(shù)量來(lái)改善腸道屏障功能。

肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化以α-SMA標(biāo)志蛋白為主要形態(tài)學(xué)特征，在腸道纖維化發(fā)生和發(fā)展中起到至關(guān)重要的作用[14]。Masson染色結(jié)果顯示COS干預(yù)后能明顯緩解由TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠模型腸道collagen Ⅰ和α-SMA的表達(dá)，減緩纖維化的進(jìn)展，表明COS可能參與抑制腸道纖維化的過(guò)程。

綜上所述，本研究結(jié)果表明COS是一種安全有效的實(shí)驗(yàn)性IBD治療藥物，能夠抑制炎癥反應(yīng)相關(guān)因子、改善大鼠結(jié)腸組織膠原纖維沉積引起的纖維化病變，同時(shí)恢復(fù)腸道黏膜屏障。本研究結(jié)果為IBD的治療提供了一個(gè)潛在的候選藥物。