人皮膚表皮干細(xì)胞外泌體的分離培養(yǎng)與鑒定

李碧優(yōu) ，馬 潔，張啟宇，章華兵，朱云平,

表皮干細(xì)胞(epidermal stem cells，EPSCs)主要位于表皮細(xì)胞的基底層。在皮膚創(chuàng)傷時，可從基底層遷移到創(chuàng)傷部位，促進(jìn)傷口的修復(fù)和愈合[1]。EPSCs 隨年齡增長逐漸減少，因此分離培養(yǎng) EPSCs變得尤為重要，而人源 EPSCs 的分離和培養(yǎng)一直存在易污染、易分化的難點(diǎn)[2]。外泌體(exosomes, EVs)直徑在30～150 nm的細(xì)胞外囊泡[3]，干細(xì)胞是最常見的外泌體分泌細(xì)胞[4]，相比干細(xì)胞，外泌體免疫原性低，內(nèi)容物穩(wěn)定易保存，以及易于量產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。外泌體的分離和提取一直是外泌體研究的難點(diǎn)[5]。

目前干細(xì)胞外泌體研究主要聚焦于間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞，大都來源于大小鼠或細(xì)胞系[6]，人源表皮干細(xì)胞外泌體(epidermal stem cells-exosomes，EPSCs-Exo)的研究甚少。該研究聚焦于體外分離培養(yǎng)人源 EPSCs，并探究EPSCs-Exo 體外分離純化方法，為進(jìn)一步研究人源 EPSCs-Exo生物學(xué)功能及作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)其臨床治療和轉(zhuǎn)化。

1 材料與方法

1.1 組織來源皮膚組織來源于北京協(xié)和醫(yī)院。經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，倫理號：ZS-2556，本研究中共使用了 3 例男性患者的皮膚組織，年齡為 30～40歲，無其他疾病。患者本人知情同意，在進(jìn)行包皮手術(shù)時，取多余的包皮組織用于分離EPSCs。

1.2 主要試劑Advanced DMEM/F12培養(yǎng)液、MEM非必需氨基酸溶液(NEAA，100×)、B-27無血清添加物(50×)、GlutaMAX(100×)、N-2羥乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸(HEPES, 1mol/L)、DispaseII酶、0.25%Trypsin/EDTA酶均購自Gibco公司。N-乙?；?L-半胱氨酸(NAce，1 mmol/L)、TGFβ激活酶/激活素受體激酶抑制劑(A83-01)、人重組表皮生長因子(rhEGF)、wnt3a均購自Sigma-Aldrich公司。腺苷酸環(huán)化酶激活劑(Forskolin)購自Selleck公司，青霉素/鏈霉素(S/P，100×)、Matrigel膠購自Corning公司。兔抗人integrin-α6(貨號：27189-1-AP)、integrin-β1(貨號：12594-1-AP)、鼠抗人CD9(貨號：60232-1)、兔抗人Calnexin(貨號：10427-2)購自Proteintech公司，兔抗人Tsg101(貨號：125011)、CK19(貨號：ab52625)購自Abcam公司，兔抗人P63(貨號：D2K8X-13109)購自Cell Signaling Technology公司，兔抗人CD63(貨號：sc-5275)購自Santa Cruz公司，外泌體裂解液(貨號：UR33101)購自Umibio公司。

1.3 主要儀器CO2培養(yǎng)箱、低溫高速離心機(jī)、超高速低溫離心機(jī)(美國，Thermo Scientific)，電泳儀、半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀(美國，Bio-Rad Laboratories)，超靈敏多功能凝膠成像系統(tǒng)(瑞典，Cytiva)，全電動倒置熒光顯微鏡(日本，Nikon)，透射電子顯微鏡(美國，捷克Delong Instruments)，納米流式分析儀(中國，福流生物)。

1.4 人EPSCs的分離培養(yǎng)EPSCs改良2D培養(yǎng)液的配置：在無菌環(huán)境下，向100 ml的Advanced DMEM/F12培養(yǎng)液中分別加入1 ml NEAA、2 ml B-27、1 ml GlutaMAX、1 ml HEPES、25 μl wnt3a、1 ml NAce、20 μl hEGF、10 μl A83-01、10 μl Forsklin、1 ml 青霉素/鏈霉素(S/P)雙抗配成培養(yǎng)液。

人包皮組織用含5×S/P、預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗至無血污，剪去皮下的肌肉和脂肪，并切成1 cm2方塊大小；組織移至6孔板中，加入足量的Dispase II酶，37 ℃消化2 h，直至表皮和真皮輕松分離；用鑷子輕輕分離皮膚的表皮層和真皮層后，用含有5×S/P、預(yù)冷的PBS緩沖液分別進(jìn)行清洗；將分離的表皮放入新的6孔板中，加入適量的0.25%Trypin-EDTA，消化5～10 min，待有大量單細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)時終止消化，防止細(xì)胞消化過度，影響存活狀態(tài)。細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管，1 000 r/min 離心5 min，棄上清液，加入預(yù)冷的PBS洗滌3次，40 μm無菌篩網(wǎng)過濾，再次離心，棄上清液。EPSCs培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀，輕輕吹打混勻，加入Matrigel基質(zhì)膠包被的6孔板中，37 ℃ 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天拍照觀察，原代分離細(xì)胞首次2～3 d換液/次，待有較大的細(xì)胞克隆時改為1 d換液/次，以維持細(xì)胞生長所需要的營養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到75% 左右進(jìn)行傳代。醫(yī)院患者包皮樣本通過物理剝離和改良的Tryspin-EDTA酶的化學(xué)消化法，成功分離出人的EPSCs。

1.5 人EPSCs的鑒定EPSCs 含有多種蛋白，如整合素、核蛋白 P63。糖蛋白和角蛋白目前已經(jīng)作為 EPSCs 常見的標(biāo)志物[7]。本研究采用integrin-α6、integrin-β1、P63和 CK19 作為 EPSCs 的標(biāo)志物，分別采用免疫熒光染色和Western blot 進(jìn)行鑒定。

1.5.1人 EPSCs 標(biāo)志蛋白的免疫熒光染色鑒定 6孔板中EPSCs用4%多聚甲醛固定30 min，滴加10%正常山羊血清，室溫封閉60 min；滴加抗integrin-β1單抗、抗P63單抗、抗CK19單抗于濕盒4 ℃過夜，加入相應(yīng)的熒光二抗，室溫孵育1 h，DAPI染核后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5.2人EPSCs標(biāo)志蛋白的 Western blot鑒定 EPSCs用0.25%Trypsin/EDTA 酶消化 3～5 min, EPSCs重懸至 10 ml 的離心管中，1 200 r/min 離心 5 min,棄上清液，取6孔板，按照150 μl/孔加入混合裂解液(RIPA裂解液 ∶PMSF=100 ∶1)，吹打10～20次，冰上靜置 30 min 后轉(zhuǎn)入 1.5 ml EP管中，4 ℃、12 000 r/min 離心 15 min，取上清液，上清即目的蛋白，BCA法測蛋白濃度，配制 SDS-PAGE 凝膠行蛋白質(zhì)電泳，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜，5% 脫脂奶粉封閉，用 integrin-α6(1 ∶500)、P63(1 ∶500)、CK19(1 ∶500)、GAPDH(1 ∶1 000)的一抗 4℃ 抗孵育過夜，TBST 清洗 3 次．添加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1 ∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST 清洗 3 次，加 ECL 發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光成像,檢測 integrin-α6、P63、CK19、GAPDH 的表達(dá)情況。

1.6 人EPSCs-Exo的分離與純化6孔板中的 EPSCs 以1 ∶4傳至 10 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)皿中, 加入配置好的EPSCs培養(yǎng)液，待細(xì)胞密度至75%時，更換不含有因子的Advanced DMEM/F12的培養(yǎng)液，24 h收集細(xì)胞上清液，直至細(xì)胞邊緣透明化，停止收集。收集的細(xì)胞上清液暫時放置于4 ℃，長時間放置于-80 ℃儲存。收集P2-P5代的細(xì)胞上清液180 ml，4 ℃、1 348 r/min離心10 min，取上清液，3 692 r/min離心30 min，取上清液，4 ℃、33 028 r/min 離心2 h, 去除上清液，每管用5 ml預(yù)冷的PBS重懸，輕輕吹打重懸，再依次轉(zhuǎn)移到32 ml預(yù)冷的離心管中，并用預(yù)冷的PBS將體積補(bǔ)足至30 ml。 4 ℃、3 328 r/min離心 2.5 h，離心后輕輕吸去上清液，用 50～150 μl 的 PBS 重懸，得到外泌體，放至-80 ℃保存。

1.7 人EPSCs-Exo 的鑒定國際細(xì)胞外囊泡學(xué)會(ISEV)在 2014 年提議，對于分離獲得的外泌體需要從三個層面進(jìn)行鑒定：① 透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)鑒定外泌體形態(tài)；② 納米顆粒示蹤分析(nanoparticle tracking analysis, NTA)鑒定外泌體大小; ③ Western blot鑒定外泌體表面標(biāo)志物[8]。國際囊泡學(xué)會在2018年進(jìn)行了補(bǔ)充，對于鑒定外泌體表面標(biāo)志蛋白，必須包含3個陽性蛋白和1個陰性蛋白對照，陽性蛋白位于外泌體膜上或者細(xì)胞內(nèi)的蛋白，陰性蛋白表明分離的效率。在外泌體研究中，細(xì)胞膜蛋白CD63、CD9、CD81以及胞內(nèi)Tsg101、Hsp70、Alix等是最常用的標(biāo)志物[9-10]。本研究采用 Tsg101、CD9、CD63作為EPSCs-Exo的陽性標(biāo)志物，Calnexin作為EPSCs-Exo的陰性標(biāo)志物，采用Western blot進(jìn)行鑒定，同時使用TEM和NTA法觀測外泌體形態(tài)及大小。

1.7.1TEM下觀察人EPSCs-Exo 采用 PBS 重懸提取的外泌體，滴于孔徑 2 nm 的載樣銅網(wǎng)上，室溫靜置 2 min，用濾紙從濾網(wǎng)側(cè)邊吸干液體，用3%磷鎢酸溶液在室溫下負(fù)染 5 min，濾紙吸干負(fù)染液，室溫晾干，使用透射電鏡觀察拍照。

1.7.2NTA法檢測人 EPSCs-Exo 將收集的外泌體顆粒通過光學(xué)顯微鏡收集其散射光信號及其在溶液中的布朗運(yùn)動并進(jìn)行拍照、追蹤和分析，從而計(jì)算出外泌體粒徑的大小和粒子的數(shù)目。

1.7.3Western blot法檢測人 EPSCs-Exo 標(biāo)志蛋白表達(dá) 分離得到的外泌體與外泌體專用裂解液(1 ∶1)冰上裂解 10 min，4 ℃、33 028 r/min離心 5 min，吸取上清液加上樣緩沖液加熱變性，配制 SDS-PAGE 凝膠行蛋白質(zhì)電泳，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜，5% 脫脂奶粉封閉，加入 Tsg101(1 ∶1 000)、CD9(1 ∶1 000)、CD63(1 ∶200)、Calnexin(1 ∶500)的一抗，4 ℃孵育過夜，TBST 清洗 3 次．添加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1 ∶5 000)，室溫孵育 1 h，TBST 清洗 3 次，加ECL發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光成像，檢測 Tsg101、CD9、CD63、Calnexin、GAPDH 的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 人皮膚組織分離EPSCs將用4%多聚甲醛固定 24 h 的 2 cm2大小的包皮組織用石蠟進(jìn)行包埋，切成4 μm厚的切片，對石蠟切片進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果顯示，核蛋白 P63、CK14、CK10 在皮膚組織中均表達(dá)陽性并呈分層狀(圖1)。核蛋白 P63 在皮膚組織具有增生潛能的基底層表達(dá)，表明細(xì)胞具有增生的潛能；CK14 在組織的基底層表達(dá)，是短暫擴(kuò)增細(xì)胞分化成EPSCs的階段；CK10 在皮膚組織表皮層表達(dá)，代表接近成熟的表皮細(xì)胞。通過皮膚組織染色進(jìn)行 EPSCs 的組織溯源，顯示了表皮細(xì)胞從干性到成熟，不斷自我更新，從基底層、顆粒層、棘層、表皮層逐步遷移的過程，EPSCs可以來源于短暫擴(kuò)增細(xì)胞或者分裂的 EPSCs，在空間上從基底層逐步分化成表皮細(xì)胞。

圖1 人皮膚組織免疫熒光染色結(jié)果 ×10

圖2 細(xì)胞貼壁法分離培養(yǎng)的EPSCs形態(tài)學(xué)觀察 ×10

2.2 人 EPSCs 的培養(yǎng)與鑒定

2.2.1人EPSCs的形態(tài)學(xué)觀察 原代培養(yǎng)的人皮膚 EPSCs，在 matrigel 膠包被的板子上貼壁生長，當(dāng)細(xì)胞密度到達(dá)75%進(jìn)行傳代，觀察分離后不同天數(shù)的細(xì)胞生長狀態(tài)。如圖3所示，在第2天時，原代細(xì)胞貼壁生長(圖2A)，在第4～7天時，細(xì)胞逐漸形成克隆(圖2B、2C)，在第10天時，細(xì)胞克隆已生長成可以傳代的密度，未分化的原代 EPSCs 排列整齊緊密，形態(tài)呈現(xiàn)規(guī)則的鋪路石狀，且細(xì)胞邊緣光滑(圖2D)。

2.2.2人EPSCs標(biāo)志蛋白的鑒定 在細(xì)胞水平上，對P3代的EPSCs進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色，F(xiàn)ITC熒光信號呈綠色，激發(fā)波長為488 nm, RFP熒光信號呈紅色，激發(fā)波長為568 nm。對integrin-β1(ITGB1)、P63用綠色熒光標(biāo)記，CK19用紅色熒光標(biāo)記，結(jié)果顯示在EPSCs中高度表達(dá)EPSCs的標(biāo)志分子integrin-β1和P63，中度表達(dá)CK19(圖3A)。在蛋白水平上，將分離培養(yǎng)的EPSCs提取蛋白，對integrin-β1的同源標(biāo)志物integrin-α6、P63、CK19和GAPDH進(jìn)行Western blot分析，每組平行重復(fù)2個樣本，結(jié)果顯示EPSCs標(biāo)志物integrin-α6、P63、CK19及GAPDH表達(dá)均呈陽性(圖3B)。這些結(jié)果說明分離培養(yǎng)的EPSCs純度較高，符合實(shí)驗(yàn)的要求，為外泌體的分泌奠定了基礎(chǔ)。

2.3 人EPSCs-Exo的分離與純化將 EPSCs從P2-P5代加入改良的EPSCs 2D培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，待其密度達(dá)到50%～60%時收集細(xì)胞上清液，連續(xù)收集3～5 d，共收集400 ml的細(xì)胞上清液，對收集的細(xì)胞上清液進(jìn)行低速和超速離心獲得較純的EPSCs-Exo。EPSCs的上清液通過優(yōu)化的低速和超速離心法依次去除死細(xì)胞、細(xì)胞碎片和其他細(xì)胞雜質(zhì)，最終獲得高純度的EPSCs-Exo。

圖3 人EPSCs的鑒定

2.4 人EPSCs-Exo的鑒定通過TEM對EPSCs-Exo進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，EPSCs-Exo具有非常明顯的膜邊界，呈大小不一的茶托或杯狀結(jié)構(gòu)(圖4A)。NTA法檢測結(jié)果表明，外泌體形態(tài)均勻，大小從80～150 nm，在127 nm處達(dá)到峰值,粒子數(shù)目為4.9E+9個(圖4B)。對優(yōu)化的低速和超速離心獲得的EPSCs-Exo進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果顯示Tsg101、CD9、CD63這三個外泌體表面標(biāo)志物在EPSCs-Exo和EPSCs表達(dá)均呈陽性，且EPSCs-Exo的表達(dá)比EPSCs的表達(dá)稍強(qiáng)，Calnexin、GAPDH在EPSCs的表達(dá)中呈陽性，在EPSCs-Exo中表達(dá)呈陰性，符合國際細(xì)胞外囊泡學(xué)會對外泌體鑒定的要求，表明EPSCs-Exo分離純度高(圖4C)。以上結(jié)果表明本研究成功分離獲得了純度較高的人EPSCs-Exo。

圖4 人EPSCs-Exo的特征鑒定

3 討論

皮膚作為人體最大的器官，在防止外界病菌侵入、保持體溫、防止水分蒸發(fā)、感受冷熱痛等功能方面尤為重要[9]。EPSCs是皮膚中具有自我增殖和修復(fù)能力的干細(xì)胞，在燒傷、遺傳性疾病引起的皮膚損傷等臨床治療研究中發(fā)揮了重要作用。本研究利用EPSCs慢周期性和自我增殖的特性[11]，改良了EPSCs 2D培養(yǎng)液，通過添加各種可以滋養(yǎng)EPSCs、對抗其分化的營養(yǎng)因子，維持EPSCs分裂性和增殖性，延緩EPSCs分化和成熟，增加了EPSCs原代分離后的生存率，可以連續(xù)培養(yǎng)4代人源的EPSCs。不同于其他鼠源和細(xì)胞系來源的EPSCs，本研究選用臨床患者的皮膚組織，運(yùn)用細(xì)胞消化的方法，相比于組織培養(yǎng)法，細(xì)胞生長速度明顯加快，細(xì)胞污染的概率降低，為臨床提供了種子材料，有助于后續(xù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的開展。

不同干細(xì)胞分泌外泌體能力不同，目前尚未發(fā)表針對于人源EPSCs-Exo分離純化的技術(shù)。根據(jù)現(xiàn)已發(fā)表的研究，筆者嘗試參考脂肪干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的分離條件對EPSCs-Exo進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)低速離心次數(shù)太多、時間太長易導(dǎo)致EPSCs-Exo得率不高，且破壞其形態(tài)結(jié)構(gòu)，無法獲得純度較高的EPSCs-Exo。因此筆者優(yōu)化了差速離心條件：選用小轉(zhuǎn)速、短時間的低速離心和大轉(zhuǎn)速、長時間的超速離心法，成功獲得了高純度的人皮膚組織來源的EPSCs-Exo。

研究[4,12]表明，干細(xì)胞來源的外泌體可以有效轉(zhuǎn)運(yùn)mRNA、microRNA及蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)，具有減少細(xì)胞凋亡、減輕炎癥反應(yīng)、促進(jìn)血管生成、抑制纖維化、提高組織修復(fù)潛力等重要生物學(xué)功能，在調(diào)控組織再生方面存在良好的臨床應(yīng)用前景。相比于EPSCs，EPSCs-Exo易獲取、無倫理審查的限制，可以穿過細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用[13]；因此采用EPSCs-Exo代替EPSCs治療皮膚損傷將成為下一階段的研究熱點(diǎn)。而目前外泌體治療的技術(shù)難點(diǎn)在于外泌體分離和提取的難度大，純度低，產(chǎn)量低，損耗大，結(jié)果不穩(wěn)定[14]。本研究擴(kuò)大細(xì)胞上清液的收集量，優(yōu)化差速離心條件的方法，調(diào)整轉(zhuǎn)速和超離時間，運(yùn)用超速離心的方法，從而從細(xì)胞上清中穩(wěn)定地提取到EPSCs-Exo。相比于PEG沉淀法、超濾、排阻等其他外泌體分離純化的方法，超速離心法的純度高，雜質(zhì)少，為皮膚組織損傷修復(fù)提供了新的材料。

綜上所述，本研究運(yùn)用改良的Tryspin-EDTA酶從人皮膚組織中成功分離出EPSCs，添加 EPSCs改良的 2D培養(yǎng)液在體外進(jìn)行培養(yǎng)，延緩人EPSCs分化，增加了EPSCs的生存率，刺激其持續(xù)分泌EPSCs-Exo；通過優(yōu)化超速離心的條件，高效高純度提取人源EPSCs-Exo。