雄激素受體基因各功能域片段的原核表達與功能鑒定

張雨琪，丁明珠，吳金鳳，鄭海香，張 磊，王 星

雄激素受體(androgen receptor，AR)屬Ⅰ型類固醇類激素受體，主要與雄激素特異性結(jié)合后對生殖及非生殖系統(tǒng)行使重要生理功能。AR由4個結(jié)構(gòu)域組成，為N端轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(N-terminal domain，NTD)、高度保守的DNA結(jié)合區(qū)(DNA-binding domain)、鉸鏈區(qū)(hinge)和配體結(jié)合區(qū)(ligand-binding domain, LBD)，分別行使AR轉(zhuǎn)錄激活、識別結(jié)合DNA、調(diào)節(jié)AR空間構(gòu)象與高度特異結(jié)合雄激素等功能[1-2]。近年來，越來越多的腫瘤和病毒感染性疾病被發(fā)現(xiàn)與雄激素信號軸調(diào)控異常密切相關(guān)[3-5]，并對病毒有直接調(diào)控作用[6]。肆虐全球的新型冠狀病毒感染同樣表現(xiàn)出性別偏倚，男性患者的癥狀更嚴重，死亡率更高[7]。AR能以經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄因子角色促進腫瘤病毒的基因表達及致瘤，但此作用是否經(jīng)由AR與病毒基因組的直接結(jié)合而發(fā)生目前未知，因此系統(tǒng)性構(gòu)建AR全長及各功能域的GST融合蛋白，將為后續(xù)開展GST-pull down等直接相互作用研究及明確最小互作域等提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及抗體大腸埃希菌感受態(tài)細胞DH5α、BL21(DE3)菌種(ZEC-0005-20、ZEC-0014-20)購自中國福州載基生物科技有限公司；pGEX-4T-1質(zhì)粒、AR-FL-pcDNA 3.1/Hygro質(zhì)粒由福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院消化道惡性腫瘤教育部重點實驗室保存并提供；α-AR抗體(貨號：ab74272)購自美國Abcam公司，GST標簽抗體、兔抗小鼠IgG抗體、小鼠抗兔IgG抗體(貨號：2622、7074、5127)購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 主要試劑PrimeSTAR Max Premix (2×) DNA聚合酶(貨號：R045A, Takara Bio Inc.)；XhoI、BamH I、T4 DNA連接酶(貨號：R0146L、R0136L、M0202L, New England Biolabs Inc.)；考馬斯亮藍染色溶液(貨號：C462151, Bio Basic Inc.)；RIPA裂解液、溶菌酶(貨號：ST206、P0013B，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；谷胱甘肽還原型[貨號：A600229，生工生物工程(上海)股份有限公司]；IPTG(貨號：80909-1.5，北京天恩澤基因科技有限公司)；谷胱甘肽瓊脂糖珠子(貨號：17075601, 美國GE Healthcare公司)；蛋白酶抑制劑(貨號：HY-K0010, MedChemExpress LLC)。通用型DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒[貨號：DP214-02、DP118-02，天根生化科技(北京)有限公司]；BCA蛋白定量試劑盒(貨號：23227, Thermo Fisher Scientific Inc.)。

1.3 基于pGEX-4T-1質(zhì)粒構(gòu)建AR全長及功能域截短體的重組質(zhì)粒

1.3.1AR全長及截短目的基因的擴增和回收 根據(jù)pGEX-4T-1質(zhì)粒骨架和AR基因序列選擇BamH I與Xho I酶切位點，以本實驗室保存的ARFL-pcDNA 3.1/Hygro質(zhì)粒為模板，聚合酶鏈式(polymerase chain reaction，PCR)反應(yīng)擴增并純化回收AR全長及截短目的基因片段，上下游引物序列見表1。擴增參數(shù)為98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s，62 ℃退火5 s，72 ℃延伸30 s，總共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

表1 AR全長及截短目的基因引物的名稱和序列

1.3.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 用限制性內(nèi)切酶BamH I與Xho I對質(zhì)粒與目的基因片段在37 ℃中進行酶切5 h，酶切后兩者以1 ∶5比例用T4連接酶16 ℃連接2 h以上。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)感受態(tài)菌株中，以100 μg/ml氨芐青霉素(ampicillin，Amp)篩選抗性單克隆。以菌液為模板，上下游引物與擴增參數(shù)同1.3.1項，進行PCR擴增鑒定。進一步對PCR結(jié)果陽性的菌液進行質(zhì)粒抽提，同上對質(zhì)粒行BamH I與Xho I的雙酶切鑒定，并將鑒定結(jié)果陽性的質(zhì)粒送鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測序。

1.4 AR全長及功能域截短體融合蛋白的誘導(dǎo)表達及條件優(yōu)化取測序正確的菌液以4%接種于Amp LB培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)菌體處于對數(shù)生長期(OD值為0.6～0.8)，留取1.5 ml菌液誘導(dǎo)前對照。設(shè)置不同IPTG濃度(0.1、0.5、1 mmol/L)，不同誘導(dǎo)溫度(30、37 ℃)，并在不同時間點(6、12 h)收集1.5 ml誘導(dǎo)后菌液，離心得到細菌沉淀。用100 μl RIPA裂解液重懸細菌沉淀并冰上裂解10 min，冰浴超聲破碎菌體，于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝中電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamidegel electrophoresis，SDS-PAGE)，考馬斯亮藍染色膠塊，分析各組間目的蛋白表達效率，選擇最佳的誘導(dǎo)表達條件進行大量重組菌的誘導(dǎo)表達，并用谷胱甘肽瓊脂糖樹脂進一步純化。

1.5 Western blot鑒定融合蛋白表達將誘導(dǎo)前菌液、誘導(dǎo)后菌液與純化后蛋白上樣于SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白300 mA、1.5 h轉(zhuǎn)至PVDF膜上，于5%牛血清白蛋白中室溫封閉1 h。將膜與AR和GST的特異性抗體(1 ∶1 000)于4 ℃過夜孵育結(jié)合，次日，用洗膜液(含0.1% Tween 20的1×TBST)快速轉(zhuǎn)動洗膜3次，分別加入HRP標記的兔抗小鼠IgG抗體、小鼠抗兔IgG抗體(1 ∶10 000)，室溫孵育1 h。洗膜后均勻滴加ECL化學(xué)發(fā)光底物，置于ImageQuant LAS 4000凝膠成像儀中進行曝光。

1.6 凝膠遷移實驗(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)鑒定純化蛋白功能將純化后融合蛋白、GST(150 pmol)與一種能和AR結(jié)合的病毒熒光探針(熒光探針的設(shè)計及擴增同先前研究[6]，30 pmol)在EMSA結(jié)合緩沖液中混勻，25 ℃孵育30 min。配置20 ml 6.5%非變性PAGE膠：將1 ml 10×TBE、4.4 ml 30%丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺溶液、1 ml 50%甘油、20 μl TEMED、13.6 ml ddH2O均勻混合，室溫靜置10 min脫氣，再加入120 μl 10%過硫酸胺吹打混勻，灌膠后室溫放置2 h以上。在0.5×TBE電泳緩沖液中120 V冰上預(yù)電泳至電流穩(wěn)定在15 mA左右。將孵育后的蛋白-DNA探針復(fù)合物小心上樣于膠孔內(nèi)，120 V冰上電泳2 h以上。用ODYSSEY CLx雙色紅外激光成像儀分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 設(shè)計與擴增AR全長及各功能域截短體基因片段本文共設(shè)計了4個截短體AR，使其缺失或僅存在一個功能域(圖1A)。依次為全長AR(AR-FL，1-919 aa)及缺失LBD(AR△LBD，1-669 aa)、缺失LBD與鉸鏈區(qū)(僅余N端轉(zhuǎn)錄激活域與DNA結(jié)合域)(AR-NTD+DBD，1-625 aa)、缺失LBD、鉸鏈區(qū)(Hinge)和DBD的N端轉(zhuǎn)錄激活域(AR-NTD，1-537 aa)、配體結(jié)合域(AR-LBD，669-919 aa)的截短體AR。PCR擴增產(chǎn)物上樣于2%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示在標準分子量Marker相對應(yīng)長度2 763、2 004、1 872、1 608、753 bp處，分別出現(xiàn)單一清晰的擴增條帶，成功獲得AR-FL、AR△LBD、AR-NTD+DBD、AR-NTD、AR-LBD目的基因片段(圖1B)。

圖1 設(shè)計和擴增AR全長和各功能域截短體基因片段

2.2 構(gòu)建并鑒定AR全長及各功能域的原核表達質(zhì)粒以菌液為模板進行PCR擴增檢測，如圖2A所示，在相應(yīng)分子量大小處出現(xiàn)單一清晰的擴增條帶。陽性質(zhì)粒雙酶切后出現(xiàn)兩條泳帶，靠近膠孔的條帶為酶切后的pGEX-4T-1質(zhì)粒，遠離膠孔的則是酶切出的插入片段(圖2B)。對雙重鑒定中均顯示陽性的克隆進行測序，將插入片段測序結(jié)果與NCBI GenBank標準株氨基酸序列(NG-009014.2)進行比對(圖2C)，AR全長、AR-NTD+DBD、AR-LBD序列與標準株一致， AR-NTD的第460個氨基酸由甘氨酸突變?yōu)樘於彼帷Ｗ罱K成功構(gòu)建4個重組質(zhì)粒，分別為AR-FL-pGEX-4T-1、AR-NTD+DBD-pGEX-4T-1、AR-NTD-pGEX-4T-1、AR-LBD-pGEX-4T-1。

2.3 誘導(dǎo)表達各GST融合蛋白SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色分析重組菌在誘導(dǎo)后產(chǎn)生的可溶性蛋白，結(jié)果顯示，與未加IPTG的陰性對照組相比，加入IPTG后可誘導(dǎo)空載、AR-FL-pGEX-4T-1、AR-NTD+DBD-pGEX-4T-1、AR-NTD-pGEX-4T-1、AR-LBD-pGEX-4T-1重組菌分別在26、129、96、86、54 ku處出現(xiàn)了非菌體蛋白的大量表達條帶(圖3，紅色箭頭指示處)。對比兩個誘導(dǎo)時間，誘導(dǎo)12 h比6 h的蛋白條帶總體染色更濃，但相應(yīng)分子量處目的蛋白的表達條帶差異不明顯。對比兩個誘導(dǎo)溫度，細菌在30 ℃誘導(dǎo)時蛋白表達量略優(yōu)于37 ℃，特別是GST蛋白明顯在30 ℃條件下表達量更大。并且當IPTG終濃度為1 mmol/L時細菌蛋白總量有所下降，表現(xiàn)出一定的試劑毒性。因此，IPTG終濃度0.1 mmol/L、30 ℃、200 r/min誘導(dǎo)6 h為最佳誘導(dǎo)條件，在此條件下小量誘導(dǎo)的目的蛋白條帶最明顯。

圖2 重組質(zhì)粒的菌液PCR、雙酶切鑒定及同源比對結(jié)果

2.4 Western blot與EMSA鑒定各融合蛋白表達及其功能Western blot檢測了重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達蛋白，結(jié)果顯示(圖4A)，AR-NTD+DBD-pGEX-4T-1、AR-NTD-pGEX-4T-1重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達后的粗提總蛋白與純化蛋白中均能檢測出特異性AR蛋白表達，分別位于96、86 ku處。用GST標簽抗體作為一抗時，3種質(zhì)粒的誘導(dǎo)后細菌裂解液與純化蛋白均能被GST標簽抗體檢測出，且GST空載組蛋白經(jīng)過純化后雜帶消失，僅在26 ku處出現(xiàn)一單一條帶。重組質(zhì)粒表達的截短體AR融合蛋白在目的位置大小處存在目的條帶(圖4，紅色箭頭指示處)。EMSA結(jié)果顯示熒光游離探針與AR-NTD+DBD、AR-NTD融合蛋白復(fù)合物泳帶較GST組顯著滯后(圖4B)，證明兩個融合蛋白經(jīng)純化后在體外具有與DNA直接結(jié)合的功能。

圖3 考馬斯亮藍染色分析pGEX-4T-1空載和AR各重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達

圖4 Western blot與EMSA鑒定各融合蛋白表達及其功能

3 討論

本文詳述了構(gòu)建重組質(zhì)粒與誘導(dǎo)原核蛋白表達的實驗過程，針對其中的重難點以及所遇到的問題，總結(jié)得出以下結(jié)論：① 設(shè)計高特異性的引物是PCR實驗成功的關(guān)鍵。② 在重組質(zhì)粒的構(gòu)建過程中，連接效率與DNA和載體比例密切相關(guān)，適當提高DNA比例或能得到更高的連接效率。過長的目的基因也是連接效率低下的重要原因，結(jié)果顯示在同一連接體系條件下，短片段DNA更易與載體重組成功。③ 為避免影響后續(xù)實驗進度，應(yīng)嚴格驗證重組質(zhì)粒。以菌液為模板擴增目的片段可能出現(xiàn)假陽性，需行雙酶切鑒定。在菌液PCR與雙酶切鑒定雙陽性的情況下，有一定概率出現(xiàn)堿基缺失或增補造成突變。所以為確保載體正常表達，測序結(jié)果才是驗證重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功的金標準。分析測序結(jié)果需同時對核苷酸和氨基酸序列進行比對，分析有無移碼、無義或點突變。本研究對ARΔLBD-pGEX-4T-1重組質(zhì)粒測序結(jié)果進行核苷酸的同源比對時，顯示其發(fā)生了移碼突變，但鑒于與AR-NTD+DBD-pGEX-4T-1相比較前者在結(jié)構(gòu)上僅缺少鉸鏈區(qū)，而非AR的重要功能域，故在兩次測序錯誤后未重新構(gòu)建。④ 誘導(dǎo)表達實驗中，誘導(dǎo)溫度、時間、轉(zhuǎn)速及誘導(dǎo)劑濃度都會影響菌株表達目的蛋白的能力，預(yù)實驗中可以在不同時間點留取菌液以摸索出最佳的目的蛋白表達條件。通過降低溫度與誘導(dǎo)劑濃度，能在一定程度上減小誘導(dǎo)劑對菌體生長的毒性作用，且搖培過程需保障足夠的菌通氣量。也有部分蛋白即使在插入片段無誤的情況下，仍無法誘導(dǎo)表達出蛋白。實驗結(jié)果顯示，不同表達載體與不同長度的基因插入片段都會影響細菌蛋白的表達。分子量越大的GST融合蛋白越難表達，例如在誘導(dǎo)129 ku的GST融合AR全長蛋白表達時，出現(xiàn)了僅表達GST，不表達目的蛋白的情況。此外，細菌沉淀的充分裂解超聲是純化蛋白純度和濃度的基本保證。⑤ 蛋白純化實驗需嚴格在冰上操作，并補加蛋白酶抑制劑防止蛋白降解。本研究通過Western blot分析明確了AR蛋白的特異性，但泳道中同時也出現(xiàn)了一些小于目的蛋白分子量的蛋白雜帶，在實驗操作規(guī)范的前提下，綜合分析認為此蛋白雜帶是由于載體本身性質(zhì)所致的無法避免的蛋白降解條帶，載體起始密碼子的上游在RNA編碼區(qū)有類似于核糖體結(jié)合位點的間隔序列，導(dǎo)致其在第二點起始翻譯。后續(xù)通過對目的基因進行密碼子優(yōu)化或更換載體等措施或能得到表達量更大、更穩(wěn)定的融合蛋白。