GBP1在肺結(jié)核中的表達(dá)及臨床意義

葉國(guó)敏，沈世杰，張 博，鄧思齊，馮 真，李衛(wèi)民，張萬(wàn)江，陳創(chuàng)夫，吳江東

結(jié)核病(tuberculosis, TB)是一種主要由結(jié)核分枝桿菌感染引起的傳染性疾病。近幾十年來(lái)，它已成為全球傳染病死亡的主要原因之一[1-3]。但隨著耐藥菌的出現(xiàn)使得結(jié)核病的治愈又進(jìn)入了瓶頸期，全球平均治愈率僅維持在55%左右[4]。因此，尋找特異性的早期診斷生物標(biāo)志物對(duì)于肺結(jié)核的診斷和治療非常重要。鳥苷酸結(jié)合蛋白1(guanylate binding protein 1, GBP1)屬于鳥苷酸結(jié)合蛋白家族,是一種干擾素誘導(dǎo)蛋白[5]，對(duì)細(xì)菌的增殖起到抑制作用，有助于預(yù)防某些病毒感染促進(jìn)炎癥反應(yīng)形成，在抗病原微生物反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[6]。但GBP1在肺結(jié)核感染過(guò)程中的作用未見報(bào)道。該研究基于臨床樣本及公共數(shù)據(jù)庫(kù)，探討GBP1在肺結(jié)核患者的肺組織及血液樣本中的表達(dá)情況及潛在的信號(hào)通路，為GBP1在肺結(jié)核的早期診斷及臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 肺結(jié)核標(biāo)本收集石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科存檔的樣本，本研究總共包括88例肺結(jié)核樣本、36例對(duì)照組樣本(肺癌旁組織)。患者基本信息如下：肺結(jié)核組樣本患者年齡中位值為58歲，男49例，女39例；對(duì)照組肺結(jié)核組樣本患者年齡中位值為54歲，男26例，女10例。本研究的樣本納入標(biāo)準(zhǔn)為：經(jīng)胸片、胸部CT、胸腔B超、痰或胸水、涂片、痰或胸水培養(yǎng)、結(jié)核菌素試驗(yàn)、胸水常規(guī)生化檢查，臨床診斷為肺結(jié)核，且結(jié)核分枝桿菌抗體陽(yáng)性抗酸染色、結(jié)核熒光PCR均為陽(yáng)性的樣本納入為肺結(jié)核樣本。所有樣本均經(jīng)患者或家屬知情同意而獲得，本研究得到石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(倫理批準(zhǔn)號(hào)：KJ2019-149-01)。

1.2 免疫組織化學(xué)染色用蘇木精-伊紅染色試劑盒(E607318-0200, 上海生工)對(duì)組織切片進(jìn)行EnVision二步法免疫組織化學(xué)技術(shù)染色。所有切片用二甲苯脫蠟，用無(wú)水乙醇水化，使用3%過(guò)氧化氫處理10min，阻斷內(nèi)源過(guò)氧化物酶活性，抗原在pH值為9的EDTA高壓鍋中進(jìn)行抗原修復(fù)，持續(xù)4 min， PBS洗3次，每次3 min，在37℃與GBP1一抗(1 ∶400，ab131255, 美國(guó)Abcam公司)孵育1 h，與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗37 ℃下孵育30 min，37℃蘇木精染色30 s。GBP1陽(yáng)性判讀：隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×200)，計(jì)數(shù)GBP1陽(yáng)性細(xì)胞并計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞占比。陽(yáng)性率>5%的樣本記為GBP1陽(yáng)性，≤5%的樣本記為GBP1陰性。

1.3 數(shù)據(jù)來(lái)源和數(shù)據(jù)處理經(jīng)過(guò)篩選得到美國(guó)基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Expression Omnibus, GEO)數(shù)據(jù)庫(kù)中樣本量大于等于8以上的數(shù)據(jù)集共兩個(gè)，即GSE83456和GSE34608；對(duì)GBP1的表達(dá)做了進(jìn)一步的驗(yàn)證，肺結(jié)核相關(guān)數(shù)據(jù)集的微陣列信息見表1；運(yùn)用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析了與GBP1相關(guān)的蛋白[7]，用Cytoscape軟件(Version: 3.8.2)進(jìn)行可視化，并對(duì)相關(guān)蛋白對(duì)應(yīng)基因之間的相關(guān)性做了進(jìn)一步的分析。

表1 GEO數(shù)據(jù)集中肺結(jié)核相關(guān)的平臺(tái)信息

1.4 肺結(jié)核樣本的基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)為研究GBP1潛在的信號(hào)通路在肺結(jié)核患者中的作用，基于GEO數(shù)據(jù)集，根據(jù)GBP1的表達(dá)量中位值，將肺結(jié)核樣本分為GBP1高表達(dá)組和GBP1低表達(dá)組；應(yīng)用GSEA 軟件(version 4.0.3)對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行了GSEA分析，運(yùn)用分子特征數(shù)據(jù)庫(kù)的三個(gè)預(yù)定義基因集，包括KEGG富集分析、GO富集分析和Hallmark富集分析，揭示其潛在的分子機(jī)制。反應(yīng)某基因在信號(hào)通路中的富集程度用標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)(normalized enrichment score，NES)表示；統(tǒng)計(jì)顯著性閾值設(shè)置為P<0.05。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)于GBP1在結(jié)核樣本中的表達(dá)，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，通過(guò)Student′st-test檢驗(yàn)比較基因表達(dá)差異的顯著性;根據(jù)GBP1在對(duì)照組及結(jié)核組中的表達(dá)值，建立回歸模型，進(jìn)行受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC曲線)分析。ROC曲線下的面積(area under curve，AUC)越接近于1，說(shuō)明診斷效果越好。AUC在 0.5～0.7時(shí)有較低準(zhǔn)確性，AUC在0.7～0.9時(shí)有一定準(zhǔn)確性，AUC≥0.9有較高準(zhǔn)確性。GBP1與其他基因之間表達(dá)的相關(guān)性采用皮爾遜相關(guān)系數(shù)及其顯著性檢驗(yàn)(Pearson correlation coefficient)，相關(guān)系數(shù)r閾值為0.8；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GBP1在肺結(jié)核樣本中高表達(dá)與對(duì)照組相比，GBP1在肺結(jié)核標(biāo)本中的表達(dá)存在差異。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，GBP1蛋白在肺結(jié)核樣本中高表達(dá)，且定位于細(xì)胞質(zhì)(圖1A)，而在對(duì)照組中低表達(dá)或不表達(dá)(P<0.000 1)，見圖1B。在對(duì)照組中，GBP1蛋白陽(yáng)性率為16.7%(6/36)；在肺結(jié)核樣本中，GBP1蛋白陽(yáng)性率為73.8%(65/88)，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.012)，見表2?；跀?shù)據(jù)集GSE83456和GSE34608的表達(dá)矩陣，顯示GBP1 mRNA在肺結(jié)核的血液樣本中高表達(dá)(P<0.0001)，見圖1C、1D。表明GBP1基因在肺結(jié)核患者的血液與肺組織中均呈高表達(dá)，且具有良好的一致性。

表2 GBP1蛋白在肺結(jié)核組和對(duì)照組中的陽(yáng)性表達(dá)情況比較

2.2 數(shù)據(jù)集中對(duì)照組和肺結(jié)核患者之間的ROC曲線ROC曲線是反映敏感性和特異性連續(xù)變化的綜合指標(biāo)。為了進(jìn)一步分析評(píng)估GBP1診斷肺結(jié)核的價(jià)值，基于肺結(jié)核患者樣本及GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇對(duì)照組和肺結(jié)核患者的表達(dá)矩陣?yán)L制ROC曲線。肺結(jié)核患者樣本的陽(yáng)性百分比數(shù)據(jù)顯示，肺結(jié)核患者肺組織樣本的AUC為0.94(P<0.000 1),見圖2A，數(shù)據(jù)集GSE83456和GSE34608中肺結(jié)核患者血液樣本的AUC分別為0.97和0.99(P<0.000 1),見圖2B。圖2表明，對(duì)于肺組織樣本和血液樣本，GBP1對(duì)肺結(jié)核患者的診斷均具有良好的預(yù)測(cè)價(jià)值。

2.3 與GBP1表達(dá)密切相關(guān)的基因分析通過(guò)STRING平臺(tái)構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析，與GBP1密切相關(guān)的Top10蛋白包括CXCL10、IFIT2、IFI44L、IFIH1、SQSTM1、GBP2、STAT1、SAMD9L、IFIT3和IFI44(圖3)。然后，基于GEO數(shù)據(jù)集的表達(dá)矩陣分析了GBP1與這些蛋白對(duì)應(yīng)基因的相關(guān)性。如表3所示，在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中，GBP1的表達(dá)與STAT1、SAMD9L、IFI44 的表達(dá)均密切相關(guān)(P<0.05)，其中在數(shù)據(jù)集GSE83456中，GBP1與STAT1、SAMD9L和IFI44 的相關(guān)系數(shù)r分別為0.90、0.80、0.63，P值均小于0.000 1，在數(shù)據(jù)集GSE34608中，GBP1與STAT1、SAMD9L、IFI44 的相關(guān)系數(shù)r分別為0.75、0.85、0.69，P值分別為0.040、0.006、0.040。

圖1 GBP1在肺結(jié)核患者各樣本中高表達(dá)

圖2 基于肺結(jié)核患者樣本及GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的ROC曲線

圖3 GBP1及相關(guān)基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)

表3 肺結(jié)核中GBP1與其他互作基因的相關(guān)性分析

2.4 GSEA分析GBP1高表達(dá)的肺結(jié)核患者中潛在信號(hào)通路運(yùn)用GSEA富集分析，探索GBP1高表達(dá)的肺結(jié)核患者參與的一些信號(hào)通路。對(duì)于數(shù)據(jù)集GSE83456，根據(jù)Hallmark富集分析和GO富集分析的GSEA分析發(fā)現(xiàn)，GBP1高表達(dá)的結(jié)核病樣本主要與干擾素-γ/α(interferon-γ/α, IFN-γ/α)信號(hào)通路、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)信號(hào)通路、白細(xì)胞介素 6(interleukin 6,IL-6)信號(hào)通路等密切相關(guān)(圖4A)。對(duì)于數(shù)據(jù)集GSE34608，根據(jù)Hallmark富集分析和KEGG富集分析的結(jié)果顯示，GBP1高表達(dá)時(shí)，肺結(jié)核組織明顯參與炎癥反應(yīng)、IFN-γ/α反應(yīng)、通過(guò)核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號(hào)通路傳導(dǎo)的TNF-α信號(hào)傳導(dǎo)等(圖4B)。

圖4 在肺結(jié)核患者中GBP1基因的GSEA富集分析

3 討論

結(jié)核病是一種致死率較高的慢性傳染病，致死總?cè)藬?shù)高于艾滋病和瘧疾，成為全球重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。從2000年到2015年，結(jié)核病死亡數(shù)下降了 22%；但伴隨耐藥菌的出現(xiàn)，結(jié)核感染仍然是全球重要死因之一。另外，肺結(jié)核合并肺癌也是肺結(jié)核患者死亡的最常見原因，而早期肺癌與肺結(jié)核之間很難準(zhǔn)確鑒別。所以，尋找早期準(zhǔn)確的診斷、預(yù)后標(biāo)志物或有效的藥物靶點(diǎn)是必要和緊迫的[8]。

有研究[9]證實(shí)，在人體中GBP1可傳達(dá)針對(duì)細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌和寄生蟲的宿主防御能力信號(hào)，并激活炎性體途徑，過(guò)表達(dá) GBP1 可抑制流感病毒的復(fù)制，最終達(dá)到抗病毒的目的。本研究的免疫組織化學(xué)染色顯示，與對(duì)照組相比，GBP1蛋白在肺結(jié)核的肺組織中高表達(dá)，陽(yáng)性率占比達(dá)73.9%。此外，在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的肺結(jié)核患者血液樣本中，GBP1 mRNA也高表達(dá)。所以，GBP1的表達(dá)情況在患者病灶肺組織及血液中可能有良好的一致性。提示對(duì)感染早期、疑似或不宜手術(shù)的肺結(jié)核患者，GBP1的血液診斷是一個(gè)潛在的篩查選擇?；贕EO數(shù)據(jù)集，本研究分析了與GBP1蛋白表達(dá)密切相關(guān)的調(diào)控因子，包括STAT1、SAMD9L及IFI44。有研究[10]報(bào)道，在STAT1基因突變的結(jié)核分枝桿菌感染合并噬血細(xì)胞綜合征患兒中，其病情危重，容易發(fā)生嚴(yán)重、持續(xù)性或條件致病菌感染。SAMD9L 在多種癌癥中作為抑癌基因調(diào)控細(xì)胞增殖，可能是胃癌家系的易感基因[11]。IFI44是Ⅰ型干擾素(IFN)家族中的一員，在抗病毒應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并且在各種病毒感染過(guò)程中所起的作用因病毒種類不同而有所差異[12]。在糖代謝過(guò)程中，GBP1在炎性因子INF-γ誘導(dǎo)下產(chǎn)生，可發(fā)揮一定抗炎作用[13]。通過(guò)GSEA分析研究了肺結(jié)核患者GBP1的潛在信號(hào)通路，提示肺結(jié)核患者中GBP1的高表達(dá)與IFN-γ、TNF-α或IL-6介導(dǎo)的免疫反應(yīng)密切相關(guān)。相關(guān)研究[14]也表明IFN-γ、IL-10等參與機(jī)體炎癥反應(yīng)，與肺結(jié)核的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。故GBP1及相關(guān)調(diào)控因子可能在宿主抗結(jié)核感染過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

綜上所述，GBP1可能作為肺結(jié)核的早期診斷的標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)，為肺結(jié)核的早期篩查或治療策略提供進(jìn)一步的線索或啟示。但本研究存在一定的局限性，如相對(duì)于龐大的結(jié)核病患者群體，本研究涉及的患者樣本總量偏少；GBP1表達(dá)與抗肺結(jié)核感染的相關(guān)性、診斷價(jià)值及潛在生物學(xué)功能等皆以生物信息學(xué)分析為基礎(chǔ)，這些結(jié)論仍需要更多的體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)或臨床實(shí)踐來(lái)進(jìn)一步證實(shí)。