磷酸二酯酶4D純合子敲除小鼠的構(gòu)建

朱振鐸，蘇甜甜，程慧娟，江春如，方茹紅，管秋韻，何 鳳，葛明麗，魏 偉，汪慶童

磷酸二酯酶(phosphodiesterase, PDE)是21個(gè)基因編碼的11種不同亞型酶(PDE1-PDE11)的超級(jí)大家族[1]，PDE4D亞型在心臟、肝臟、腎臟等組織中表達(dá)較高。PDE4D的主要功能是通過(guò)與環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)結(jié)合并將其降解為5′-腺嘌呤核苷酸(adenosine 5′-monophosphate，5′AMP)[2]。PDE4D表達(dá)升高會(huì)增加房顫的易感性和心源性中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)，也在非酒精性脂肪肝、阿爾茨海默病等疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3]，PDE4D可能為這些疾病的潛在治療靶點(diǎn)。構(gòu)建PDE4D基因敲除小鼠對(duì)充分闡明PDE4D的病理作用機(jī)制及藥物靶點(diǎn)的明確具有重要意義。該研究與江蘇集萃藥康生物科技有限公司合作，利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建PDE4D基因純合敲除(PDE4D-/-)小鼠，對(duì)后代子鼠進(jìn)行基因型鑒定，檢測(cè)PDE4D-/-小鼠主要器官組織中PDE4D蛋白的表達(dá)水平，超聲影像學(xué)和HE染色觀察小鼠主要器官形態(tài)、功能與組織學(xué)特征，從而驗(yàn)證PDE4D-/-小鼠構(gòu)建的結(jié)果，為以PDE4D為靶點(diǎn)的疾病和藥物研究提供基因工程動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠在SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)及繁殖。實(shí)驗(yàn)室光照和黑暗時(shí)間各12 h交替，小鼠飼料、墊料以及飲用水均經(jīng)過(guò)高溫高壓消毒滅菌處理。本研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理審查批準(zhǔn)號(hào)為L(zhǎng)LSC 20190307。

1.2 主要試劑及儀器PGK1.1線性載體由江蘇集萃藥康生物科技有限公司提供；核酸染料購(gòu)自中國(guó)Meilunbio公司；瓊脂糖凝膠購(gòu)自中國(guó)Biosharp公司；Genotyping Mix 購(gòu)自中國(guó)Vazyme公司；抗 GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；抗PDE4D抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；辣根酶標(biāo)記的山羊抗鼠 IgG 購(gòu)自美國(guó)Jackson公司。Tanon-1600全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)購(gòu)自上海天能公司，Visual Sonics Vevo 2100系統(tǒng)購(gòu)自加拿大 FUJI FILM公司，Pannoramic MIDI高分辨玻片掃描系統(tǒng)購(gòu)自匈牙利3D HISTECH公司，Tanon-5200成像系統(tǒng)購(gòu)自上海天能公司。

1.3 方法

1.3.1先導(dǎo)RNA載體構(gòu)建 PDE4D基因共有20個(gè)轉(zhuǎn)錄本，由至少18個(gè)外顯子組成，分布在150 kb的基因組DNA上。根據(jù)PDE4D基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，選擇PDE4D的外顯子4、外顯子5 (ENSMUST00000122041.7)為敲除區(qū)域，該區(qū)域包含229bp的編碼序列，敲除該區(qū)域?qū)?dǎo)致PDE4D蛋白質(zhì)缺失(圖1)。利用CRISPR Design軟件設(shè)計(jì)篩選得到先導(dǎo)RNA(single guide RNA, sgRNA)，分別為5S1-(GTGAGCCGACTGTAAAGTGC)、5S2-(AAG GTACAACTTGGACCATC)、3S1-(AATGGGACCTTGA ATACCTT)、3S2-(AGATCTACCCAAGGTATTCA)，各自識(shí)別前間區(qū)序列鄰近基序CGG、CGG、GGG、AGG。構(gòu)建sgRNA表達(dá)載體，將載體線性化和純化后作為模板用于體外轉(zhuǎn)錄。

1.3.2PDE4D-/-小鼠獲得 將Cas9 mRNA和轉(zhuǎn)錄后的sgRNA顯微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵原核中，然后移植入C57BL/6J假孕雌性小鼠子宮中，繁育后獲得陽(yáng)性F0(PDE4D+/-)小鼠，陽(yáng)性F0代小鼠與C57BL/6J小鼠交配產(chǎn)生具有雜合基因型(PDE4D+/-)的穩(wěn)定F1后代模型。PDE4D+/-小鼠之間進(jìn)一步雜交產(chǎn)生F2代純合子小鼠(PDE4D-/-)，通過(guò)PCR和基因測(cè)序確認(rèn)小鼠基因序列。

圖1 利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建PDE4D基因敲除策略

1.3.3基因型鑒定

1.3.3.1鼠尾DNA的提取 子代小鼠在14日齡時(shí)剪尾，剪取組織長(zhǎng)度約0.2 cm。在EP管中加入鼠尾裂解液(50 ml裂解液中含25 ml Tris HCl, 0.292 3 g NaCl, 10 ml EDTA pH=8, 0.5 g SDS, 37.5 ml ddH2O)和蛋白酶K(10 mg/ml)，渦旋后置入60 ℃水浴鍋過(guò)夜。次日煮沸10 min終止裂解。高速離心10 min去除組織或毛發(fā)殘留，吸取上清液，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，上下輕柔顛倒。室溫靜置10 min，離心去上清液，加入預(yù)冷的70%乙醇溶液，離心去上清液。室溫30 min，待乙醇揮發(fā)，加入20 μl DEPC水，溶解作為DNA樣本保存在4 ℃。

1.3.3.2PCR擴(kuò)增反應(yīng) 引物設(shè)計(jì)策略為F1、R1針對(duì)KO小鼠設(shè)計(jì)，F(xiàn)2、R2針對(duì)野生型小鼠設(shè)計(jì)(圖2)。引物由上海生工公司合成。引物序列為F1(GCATGAAGGATACTTCCCAAGACTG)、R1(GACTGGGGTGCCTCTGAGCTTTTA)、F2(GAACAGACATAGAGCACCTTCCACA)、R2(CCTTGAGCCTGTTAGTGCTGGGAT)。PCR反應(yīng)體系總體積共25μl，包含2×Taq Master Mix 12.5 μl，ddH2O 9.5 μl，正向引物1 μl，反向引物1 μl，DNA樣本1 μl。PCR反應(yīng)程序依次為95 ℃ 5 min，(98 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s)共20個(gè)循環(huán)，(98 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s)經(jīng)過(guò)20個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min, 4 ℃ 保存。

圖2 引物設(shè)計(jì)策略

1.3.3.3凝膠電泳 配制1%瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖0.3 g加入1×TAE buffer 30 ml中。加入3 μl的核酸染料，取上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μl電泳，電壓120 V，電泳30 min，在全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)中觀察分析條帶。

1.3.4超聲影像學(xué)檢查 為評(píng)價(jià)PDE4D小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能，用Visual Sonics Vevo 2100系統(tǒng)和MS 550探頭監(jiān)測(cè)經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖。褪去小鼠胸腹部毛發(fā)，異氟烷誘導(dǎo)麻醉。當(dāng)小鼠被麻醉后，置于加熱墊上，心率保持在每分鐘400～500次。在B-mode下掃描短軸切面獲得乳頭肌切面，用M-mode分析心臟收縮功能，得到3個(gè)心臟周期的左心室射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction,EF)和左心室縮短分?jǐn)?shù)(fractional shortening, FS)。使用脈沖波多普勒評(píng)估心臟舒張功能。從脈沖波多普勒頻譜波形中，測(cè)量二尖瓣E/A比值(mitral valve E to A ratio, MV E/A)、左心室等容舒張時(shí)間(left ventricular isovolumic relaxation time, IVRT)。轉(zhuǎn)換探頭角度獲取肝臟和腎臟的超聲圖像，觀察其所在位置、大小、形態(tài)及內(nèi)部回聲情況。

1.3.5小鼠體質(zhì)量和重要器官的HE染色 將野生型小鼠、PDE4D+/-和PDE4D-/-稱重后，麻醉小鼠處死取其心臟、肝、腎組織，用4%多聚甲醛固定，包埋在石蠟中切成4 μm的切片進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色。使用高分辨玻片掃描系統(tǒng)收集HE染色的圖像。

1.3.6主要器官PDE4D蛋白水平檢測(cè) 麻醉小鼠后處死取其心臟、肝、腎提取組織蛋白。使用含有10 mmol/LPMSF和10 mmol/L磷酸酶抑制劑的裂解緩沖液中提取蛋白質(zhì)。制備SDS聚丙烯酰胺凝膠，電泳，將目的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂牛奶37 ℃封閉2 h，在PDE4D一抗中4 ℃過(guò)夜。用相應(yīng)的二抗在37 ℃下孵育2 h。最后在成像系統(tǒng)上應(yīng)用ECL底物對(duì)膜進(jìn)行成像，ImageJ軟件對(duì)條帶進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 獲得PDE4D雜合敲除F1代小鼠將sgRNA顯微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，獲得陽(yáng)性F0代小鼠，通過(guò)基因測(cè)序?qū)ζ溥M(jìn)行基因型鑒定，測(cè)序結(jié)果比對(duì)野生型小鼠基因序列(圖3A)，可以確定在小鼠的基因組序列中，PDE4D基因缺失。為了構(gòu)建穩(wěn)定遺傳的PDE4D-/-小鼠，F(xiàn)0代PDE4D+/-小鼠與C57BL/6J小鼠交配得到F1代小鼠，編號(hào)為39、41、43、45。F1代子鼠DNA經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后，凝膠電泳結(jié)果顯示在383 bp處和385 bp處均有陽(yáng)性條帶(圖3B)，表明成功繁育出PDE4D+/-小鼠。

圖3 F0代和F1代小鼠基因鑒定

2.2 獲得PDE4D基因純合敲除小鼠為獲得PDE4D-/-小鼠，F(xiàn)1代PDE4D雜合子小鼠交配繁育得到F2代小鼠，通過(guò)PCR擴(kuò)增對(duì)其進(jìn)行基因型鑒定(圖4)。編號(hào)13、21、33為純合子小鼠。凝膠電泳結(jié)果顯示編號(hào)13、21、33號(hào)在383 bp處有陽(yáng)性條帶，而385 bp處沒(méi)有陽(yáng)性條帶，提示成功建立PDE4D-/-小鼠，且具有穩(wěn)定遺傳性。

圖4 F2代小鼠基因鑒定

2.3 驗(yàn)證PDE4D敲除對(duì)小鼠體內(nèi)主要臟器的影響與PDE4D+/+小鼠相比，PDE4D-/-小鼠外觀及生理表現(xiàn)未見(jiàn)明顯異常。稱重后發(fā)現(xiàn)同窩小鼠PDE4D敲除小鼠體質(zhì)量相比于PDE4D+/+小鼠減輕(P<0.01)(圖5A)。獲取小鼠心臟、肝、腎等體內(nèi)重要臟器的超聲圖像和超聲指標(biāo)。超聲心動(dòng)圖結(jié)果顯示PDE4D敲除小鼠心臟形態(tài)無(wú)明顯改變。紅圈和藍(lán)圈區(qū)分腎臟和肝臟超聲圖像。肝臟大小正常，包膜光滑，肝臟下緣角銳利。腎形態(tài)大小均一，腎實(shí)質(zhì)回聲均勻(圖5B)。心臟收縮功能參數(shù)EF和FS與PDE4D+/+小鼠相比沒(méi)有明顯改變，心臟舒張功能參數(shù)E/A、IVRT指標(biāo)也無(wú)明顯變化(圖5C)。小鼠麻醉后，取出其心臟、肝腎組織包埋后染色，HE結(jié)果顯示PDE4D-/-小鼠的心臟乳頭肌部位心肌細(xì)胞排列整齊，心肌細(xì)胞大小無(wú)明顯差異。肝細(xì)胞形態(tài)完整，胞核無(wú)明顯改變，肝小葉形態(tài)完整。腎臟組織結(jié)構(gòu)正常，腎小球無(wú)萎縮，腎小管排列緊密(圖5D)。以上結(jié)果可提示PDE4D敲除對(duì)小鼠生長(zhǎng)有抑制作用，但對(duì)體內(nèi)重要器官心、肝、腎等無(wú)明顯影響。

2.4 PDE4D敲除小鼠體內(nèi)PDE4D表達(dá)情況為驗(yàn)證PDE4D小鼠的敲除情況，用PDE4D小鼠心臟、肝、腎提取組織蛋白。結(jié)果顯示，在心臟、肝臟、腎臟組織中，PDE4D+/-小鼠PDE4D蛋白表達(dá)與PDE4D+/+小鼠相比明顯降低(P<0.05)，PDE4D-/-小鼠PDE4D蛋白幾乎無(wú)表達(dá)(P<0.001)(圖6)，以上結(jié)果驗(yàn)證了PDE4D基因在小鼠體內(nèi)成功敲除，且敲除效果較好。

圖5 PDE4D+/+、PDE4D+/-和PDE4D-/-小鼠體質(zhì)量及心、肝和腎的超聲圖像和心功能各指標(biāo)變化和組織變化比較

圖6 PDE4D+/+、PDE4D+/-和PDE4D-/-小鼠主要組織中PDE4D的表達(dá)情況

3 討論

通過(guò)PCR擴(kuò)增后凝膠電泳和基因測(cè)序技術(shù)以及Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PDE4D-/-小鼠PDE4D蛋白的表達(dá)情況，可以確定已經(jīng)繁育出穩(wěn)定遺傳的PDE4D純合子敲除小鼠。PDE4D-/-小鼠體質(zhì)量比同年齡野生型小鼠低，有研究報(bào)道稱PED4D敲除小鼠生長(zhǎng)延遲、排卵障礙、出生后生存能力降低[4]。PDE4D純合雌性小鼠表現(xiàn)出生育能力下降，研究者認(rèn)為是排卵障礙和顆粒細(xì)胞對(duì)促性腺激素的敏感性降低所致。本研究顯示雌性PDE4D-/-小鼠生育率低于野生型小鼠，雌性PDE4D-/-小鼠每籠生育4～6只，野生型小鼠每籠生育6～8只。為確定敲除PDE4D后是否對(duì)體內(nèi)臟器有影響，本研究采用超聲影像學(xué)技術(shù)檢測(cè)重要臟器心臟的功能、肝和腎的形態(tài)以及HE染色觀察心、肝、腎的病理變化，結(jié)果顯示PDE4D敲除小鼠體內(nèi)主要器官無(wú)明顯的病變，可以確保下一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的順利開(kāi)展。

PDE4D屬于磷酸二酯酶家族，在心血管疾病、自身免疫性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤等的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。PDE4D的表達(dá)是由胰島素受體、胰島素受體底物和G蛋白偶聯(lián)受體激酶2(G pro-tein-coupled receptor kinase 2，GRK2)和β-arrestin2依賴的β2腎上腺素受體(β2adrenergic receptor，β2AR)-細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)信號(hào)級(jí)聯(lián)反式激活介導(dǎo)。高脂飲食飼養(yǎng)使小鼠心臟中PDE4D的表達(dá)增加，導(dǎo)致心臟收縮和舒張功能障礙[5]。糖尿病大鼠心臟中同樣觀察到cAMP水平增加，PDE4D表達(dá)特異性上調(diào)[6]。PDE4D通過(guò)激活肝臟中的CD36-轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor，TGF-β1)信號(hào)傳導(dǎo)，在非酒精性脂肪肝和相關(guān)高血壓的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[7]。這些研究共同證實(shí)PDE4D是人體系統(tǒng)功能不可缺少的調(diào)節(jié)因子，正在逐漸成為臨床上疾病診斷治療靶點(diǎn)。因此，哺乳動(dòng)物PDE4D敲除小鼠為特定疾病的病理生理機(jī)制的研究提供了非常有價(jià)值的動(dòng)物模型。

雖然可以使用PDE4D抑制劑整體降低PDE4D的表達(dá)或活性用以探索其功能，但均存在局限性。常見(jiàn)的PDE4D抑制劑有多肽片段，重組腺相關(guān)病毒包裹的PDE4D短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)和小分子化合物等。抑制性多肽的半衰期通常較短，給藥途徑受限；重組腺相關(guān)病毒的組織特異性較差，干擾效率差異較大。已知小分子化合物BPN14770和CP-671305可選擇性抑制PDE4D的活性，BPN14770對(duì)PDE4D3的半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC50)為7.4 nmol/L，對(duì)PDE4D7的抑制IC50為7.8 nmol/L，而對(duì)其他PDE4D亞型的抑制率有待確定，CP-671305抑制PDE4D的IC50為3 nmol/L，但在較大濃度時(shí)，其也可以抑制PDE4的其他同工酶[8]。采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建PDE4D基因敲除小鼠，具有成本較低、周期短和效率高等優(yōu)點(diǎn)，可明確減少PDE4D的表達(dá)，為研究提供可靠的動(dòng)物模型[9]。

綜上所述，本研究成功建立了可穩(wěn)定遺傳的PDE4D純合敲除小鼠，敲除PDE4D未發(fā)現(xiàn)對(duì)體內(nèi)主要臟器產(chǎn)生明顯的影響，可用于PDE4D為靶點(diǎn)的疾病模型探索和新藥研發(fā)。