GSK-3β在斑馬魚(yú)腦缺氧/復(fù)氧損傷中的作用及其對(duì)微管相關(guān)蛋白2的影響

楊夢(mèng)思，張 麗，胡憲文

腦卒中或心臟驟停常導(dǎo)致缺氧缺血性神經(jīng)損傷。腦缺氧/復(fù)氧(cerebral hypoxia/reoxygenation，H/R)損傷的病理生理機(jī)制十分復(fù)雜，包括ATP喪失、自由基產(chǎn)生和細(xì)胞死亡等[1]。因此，探討H/R損傷的作用機(jī)制至關(guān)重要。

磷酸酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/糖原合成酶激酶3β(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B/glycogen synthase kinase-3beta,PI3K/Akt/GSK-3β)通路是參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元凋亡[2]的重要信號(hào)機(jī)制。GSK-3β特異性抑制劑4-芐基-2-甲基-1,2,4-噻二唑烷-3,5-二酮(4-benzyl-2-methyl-1,2,4-thiadiaz olidine-3,5-dione，TDZD-8)預(yù)處理可顯著改善缺氧腦損傷[3]。細(xì)胞骨架是維持神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的重要基礎(chǔ)，當(dāng)受到應(yīng)激等相關(guān)刺激時(shí)隨之改變[4]。微管是其組成基礎(chǔ)，微管相關(guān)蛋白2(microtube associated protein 2，MAP2)能夠調(diào)控神經(jīng)元微管結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。研究[5]表明，GSK-3β的失活會(huì)導(dǎo)致MAP2磷酸化減少，并增加微管的結(jié)合和穩(wěn)定性。然而GSK-3β對(duì)下游微管蛋白MAP2的調(diào)節(jié)是否參與了H/R損傷機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。該研究利用TDZD-8研究斑馬魚(yú)H/R模型中GSK-3β的作用及其對(duì)MAP2蛋白的影響，以探究H/R損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 斑馬魚(yú)由中國(guó)科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)?？刂茰囟葹?8.5 ℃，光照/黑暗為12 h ∶12 h交替循環(huán)。許可證號(hào)：USTCACUC1103013。

1.1.2主要試劑 氯化三苯基四氮唑(2、3、5-triphenyte-trazoliumchloride，TTC)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；TUNEL凋亡試劑盒、提取RNA試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、高特異性染料法定量PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京Vazyme公司；引物和蛋白提取試劑盒購(gòu)自上海Sangon Biotech公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海Beyotime公司；GAPDH、GSK-3β、MAP2 Western blot抗體購(gòu)自武漢preoteintech公司；Hif-1α抗體購(gòu)自美國(guó)Novus Biologicals公司；p-GSK-3β、MAP2免疫熒光染色抗體購(gòu)自美國(guó)SANTA CRUZ公司。

1.1.3主要儀器 溶氧儀(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)，倒置熒光顯微鏡(Carl Zeiss公司)，PCR儀(伯樂(lè)BIO-RAD生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)，細(xì)胞破碎儀(上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)，多功能酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific公司)，凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)，冰凍切片機(jī)(賽默飛世爾上海儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1斑馬魚(yú)急性缺氧模型 通過(guò)注入高純氮?dú)?純度為99.99%)去除養(yǎng)魚(yú)水中的溶解氧，用溶氧儀測(cè)量水中溶氧量水平至0.3 g/L以下[6]，迅速將斑馬魚(yú)放入水中，持續(xù)監(jiān)測(cè)養(yǎng)魚(yú)水中溶氧水平，創(chuàng)造一個(gè)封閉的缺氧環(huán)境進(jìn)行急性缺氧。魚(yú)的缺氧狀態(tài)分為第一階段(在水面游動(dòng))、第二階段(不能采取正常姿勢(shì))、第三階段(鰓蓋短暫不規(guī)律的搏動(dòng))和第四階段(身體扭曲死亡)[1]。當(dāng)缺氧斑馬魚(yú)達(dá)到第三階段1 min時(shí)，迅速將斑馬魚(yú)從缺氧環(huán)境中取出，置于常氧環(huán)境中復(fù)氧6 h后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)操作。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組 隨機(jī)取健康同等體型成魚(yú)每組各6條，分為對(duì)照(Control)組、缺氧/復(fù)氧(H/R)組、缺氧/復(fù)氧+GSK-3β抑制劑(H/R+TDZD-8)組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。其中Control組不做任何處理，H/R組在急性缺氧后轉(zhuǎn)移至正常養(yǎng)魚(yú)水中進(jìn)行6 h的復(fù)氧，H/R+TDZD-8組斑馬魚(yú)則預(yù)先放入含有濃度為1 μmol/L TDZD-8的養(yǎng)魚(yú)水中4 h，再用養(yǎng)魚(yú)水或PBS清洗5 min后,進(jìn)行缺氧/復(fù)氧造模，而后在復(fù)氧時(shí)間終點(diǎn)進(jìn)行取材。

1.2.3TTC染色檢測(cè)腦梗死面積 將斑馬魚(yú)用MS-222進(jìn)行麻醉，在顯微鏡下用眼科鑷取出腦組織，進(jìn)行新鮮腦組織切片，將其切為1 mm厚度的薄片，避光置于2%的TTC溶液之中室溫染色40 min，染色后將腦片取出置于4%的多聚甲醛溶液中終止染色并固定，用顯微鏡進(jìn)行拍照。

1.2.4TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 麻醉后取成魚(yú)腦組織于4%多聚甲醛固定過(guò)夜，使用20%～30%的蔗糖溶液脫水48 h后進(jìn)行冰凍切片，厚度為10 μm。取各組切片用PBS洗滌2次，每次5 min。加入含0.5% Triton X-100的PBS，室溫孵育5 min，PBS洗滌2次，每次5 min。參照TUNEL試劑盒使用說(shuō)明，每個(gè)樣本上滴加50 μl TUNEL檢測(cè)液，濕盒內(nèi)37 ℃避光孵育60 min，PBS洗滌3次。待玻片干后，在每個(gè)樣品中加入含抗熒光淬滅DAPI各50 μl，封片后熒光顯微鏡觀察。各組切片取中腦視頂蓋，在熒光顯微鏡下放大200倍觀察，統(tǒng)計(jì)視野內(nèi)綠色熒光點(diǎn)和藍(lán)色熒光點(diǎn)的數(shù)目，計(jì)算細(xì)胞凋亡率 = (綠色熒光細(xì)胞/藍(lán)色熒光細(xì)胞)×100%。

1.2.5qRT-PCR 各組斑馬魚(yú)到達(dá)時(shí)間點(diǎn)后用MS-222麻醉，按照RNA提取試劑盒步驟提取腦組織RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將cDNA按照SYBR qPCR SuperMix試劑盒步驟進(jìn)行熒光定量PCR，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，采用相對(duì)定量法進(jìn)行分析，計(jì)算出2-ΔΔCT進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。β-actin 上游引物為： 5′-CCCTGTTCCAGCCATCCTT-3′，下游引物為： 5′-TTGAAAGTGGTCTCGTGGATACC-3′；Hif-1αa 上游引物為：5′-CCAGTGGAACCAGACATCAG-3′，下游引物為：5′-AGGAGGGTAAGGGTTGGAAT-3′；Hif-1αb 上游引物為： 5′-ATGAGAGGGAGTTGCTAGATTC-3′，下游引物為：5′-AGGAGGGTAAGGGTTGGAAT-3′。

1.2.6Western blot 取腦組織放入研磨管中，預(yù)冷PBS沖洗，加入蛋白提取試劑盒內(nèi)配制好的裂解液，在全自動(dòng)樣品快速研磨儀中60 Hz研磨60 s。將勻漿液置于冰上放置40 min，4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min，取上清液即為全蛋白，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。使用BCA蛋白定量試劑盒在酶標(biāo)儀內(nèi)測(cè)定562 nm處各組蛋白光密度(optical density, OD)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線(xiàn)，進(jìn)行蛋白定量。上樣緩沖液 ∶全蛋白提取液按體積比1 ∶4混勻，100 ℃煮10 min。室溫冷卻后置于-20 ℃保存。取20 μg蛋白樣品，8%SDS-PAGE凝膠電泳，濃縮膠為70 V、30 min，分離膠為100 V、90 min。轉(zhuǎn)移至PVDF膜，200 mA恒流300 min。置于快速封閉液中室溫下封閉15 min。一抗4 ℃搖床孵育過(guò)夜,分別為GAPDH(1 ∶80 000)、Hif-1α(1 ∶1 000)、GSK-3β(1 ∶4 000)、p-GSK-3β(Ser9)(1 ∶1 000)、MAP2(1 ∶1 000)。TBST清洗10 min，共3次，將條帶置于室溫下孵育相對(duì)應(yīng)的二抗，山羊抗兔IgG(1 ∶10 000)或山羊抗鼠IgG(1 ∶10 000)室溫孵育60 min。凝膠成像系統(tǒng)顯影，Image J軟件計(jì)算蛋白條帶灰度值。

1.2.7免疫熒光染色 取冰凍腦組織切片PBS清洗3次，每次5 min。0.3%Triton X-100的PBS溶液通透60 min。5%BSA溶液封閉30 min。免疫熒光染色一抗MAP2(1 ∶500)4 ℃孵育過(guò)夜。綠色熒光二抗(1 ∶500)室溫避光孵育1 h。樣本上滴加適量DAPI與抗熒光淬滅封片液封片。各組切片取中腦視頂蓋區(qū)域,熒光顯微鏡下放大200倍觀察后拍照， 使用Image J軟件測(cè)定熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 斑馬魚(yú)急性缺氧模型的構(gòu)建及鑒定與Control組相比，缺氧2 h/復(fù)氧3 h、6 h、24 h后缺氧誘導(dǎo)因子Hif-1αa和Hif-1αb的mRNA均升高，其中復(fù)氧6 h后mRNA升高最為顯著(F=10.78，P<0.01)，本研究選擇復(fù)氧6 h組進(jìn)行Hif-1α蛋白的檢測(cè)，結(jié)果顯示Hif-1α蛋白表達(dá)量增加(t=4.780，P<0.01)，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)復(fù)氧時(shí)間均選擇6 h作為復(fù)氧終點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

圖1 斑馬魚(yú)急性缺氧模型建立

2.2 TDZD-8對(duì)H/R斑馬魚(yú)腦組織梗死面積的影響TTC染色結(jié)果顯示，與Control組相比，H/R組的白色梗死區(qū)域增多(F=28.77，P<0.01)；與H/R組相比，H/R+TDZD-8組梗死區(qū)域減少(F=26.91，P<0.01)。見(jiàn)圖2。

2.3 TDZD-8對(duì)H/R斑馬魚(yú)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響TUNEL染色檢測(cè)結(jié)果顯示，斑馬魚(yú)中腦視頂蓋小球周灰質(zhì)帶(periglomerular gray zone，PGZ)區(qū)域有多層緊密的神經(jīng)細(xì)胞核排列，選擇此區(qū)域進(jìn)行TUNEL染色觀察。與Control組相比，H/R組細(xì)胞凋亡率升高(F=25.14，P<0.01)；與H/R組相比，H/R+TDZD-8組細(xì)胞凋亡率下降(F=22.79，P<0.01)。見(jiàn)圖3。

圖2 斑馬魚(yú)腦梗死面積

2.4 TDZD-8對(duì)H/R斑馬魚(yú)腦組織中p-GSK-3β/GSK-3β、MAP2蛋白表達(dá)量的影響Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，各組GSK-3β蛋白水平無(wú)顯著差異；與Control組相比，H/R組p-GSK-3β(Ser 9)/GSK-3β比值降低(F=9.103，P<0.01)，MAP2蛋白水平降低(F=3.709，P<0.05)；與H/R組相比，H/R+TDZD-8組的p-GSK-3β(Ser 9) / GSK-3β比值升高(F=6.562，P<0.01)，MAP2表達(dá)量增加(F=4.934，P<0.01)，表明TDZD-8預(yù)處理能夠改善斑馬魚(yú)腦缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致的p-GSK-3β(Ser 9)以及MAP2蛋白的表達(dá)減少。見(jiàn)圖4。

2.5 TDZD-8對(duì)H/R斑馬魚(yú)腦組織MAP2的分布與表達(dá)的影響免疫熒光染色結(jié)果顯示，斑馬魚(yú)中腦視頂蓋邊緣層(stratum marginale，SM)及中央層(stratum centrale，SC)神經(jīng)細(xì)胞分布較少，其內(nèi)有許多神經(jīng)纖維穿過(guò)，故在此區(qū)域觀察MAP2的熒光表達(dá)與分布。與Control組和H/R+TDZD-8組相比，H/R組MAP2熒光分布和表達(dá)減少(F=10.70，P<0.01；F=6.788，P<0.01)。見(jiàn)圖5。

圖3 斑馬魚(yú)神經(jīng)元凋亡

3 討論

腦缺氧/缺血可引發(fā)組織梗死，因?yàn)槿毖鹾湍芰縿儕Z會(huì)在數(shù)分鐘內(nèi)造成神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)損傷，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡和壞死[7]。斑馬魚(yú)和人類(lèi)之間高度的遺傳同源性，及其光學(xué)透明度高的特性，使得斑馬魚(yú)在研究缺血/再灌注或缺氧/復(fù)氧損傷的腦血管病理機(jī)制上具備優(yōu)越性，這將有助于更好地了解人類(lèi)腦血管疾病的病因機(jī)制，以取得新的治療進(jìn)展[8]。Sawahata et al[9]的研究顯示，采用缺氧再氧處理構(gòu)建的斑馬魚(yú)腦缺氧模型已被證實(shí)具有誘導(dǎo)腦缺血再灌注的作用，其機(jī)制是由于持續(xù)的缺氧加重了心臟負(fù)荷，導(dǎo)致血液循環(huán)惡化，造成中腦中央動(dòng)脈供血不足而引起血流中斷，而復(fù)氧引起的血管收縮則能夠改善腦血管血流中斷的情況。缺氧誘導(dǎo)因子1是細(xì)胞對(duì)缺氧應(yīng)激反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子，Hif-1α通過(guò)基因復(fù)制產(chǎn)生兩組同源物分別為Hif-1αa和Hif-1αb，因此本研究選擇Hif-1αa和Hif-1αb檢測(cè)mRNA的表達(dá)，然后使用Western blot檢測(cè)Hif-1α進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究中，H/R斑馬魚(yú)腦組織TTC染色中的白色梗死面積的增加證明H/R造模成功中斷了腦血流灌注，TUNEL染色中H/R組斑馬魚(yú)腦組織中的凋亡細(xì)胞增多也表明H/R誘導(dǎo)了斑馬魚(yú)神經(jīng)元凋亡，說(shuō)明斑馬魚(yú)腦缺氧/復(fù)氧損傷模型構(gòu)建成功。

PI3K/Akt途徑是H/R損傷后的神經(jīng)細(xì)胞存活主要通路之一[10]。GSK-3β是Akt的下游靶點(diǎn)，通過(guò)磷酸化Akt的激活而受到抑制[11]。本研究結(jié)果顯示，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中GSK-3β的Ser9位點(diǎn)磷酸化因H/R損傷而減少，導(dǎo)致缺氧引起的神經(jīng)元死亡，這與先前的研究[12]結(jié)果一致。MAP2是調(diào)節(jié)微管動(dòng)態(tài)組裝特性的一類(lèi)細(xì)胞骨架蛋白，其在缺血和代謝受到損害后發(fā)生降解[13]，但這種降解的時(shí)間過(guò)程和初始觸發(fā)因素尚不完全清楚。本研究結(jié)果顯示，H/R導(dǎo)致p-GSK-3β / GSK-3β比值下降，MAP2蛋白與免疫熒光表達(dá)均降低。免疫熒光結(jié)果顯示，MAP2主要分布于斑馬魚(yú)中腦視頂蓋外緣層及中央層，其內(nèi)主要為神經(jīng)纖維，用于維持微管穩(wěn)定。MAP2蛋白表達(dá)量在H/R后出現(xiàn)下降。為進(jìn)一步闡明MAP2的降解與GSK-3β的關(guān)系，本研究使用了高選擇性GSK-3β抑制劑TDZD-8進(jìn)行預(yù)處理。結(jié)果證明，TDZD-8在不影響其他激酶的情況下，可選擇性地激活GSK-3β的Ser9位點(diǎn)磷酸化從而抑制GSK-3β的活性[14]，并能保護(hù)大腦免受缺血/再灌注損傷[15]。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TDZD-8預(yù)處理能夠減輕斑馬魚(yú)H/R損傷造成的腦梗死和神經(jīng)細(xì)胞凋亡，提高斑馬魚(yú)腦組織中的p-GSK-3β/GSK-3β的比值以及MAP2蛋白和熒光的表達(dá)。上述研究結(jié)果提示斑馬魚(yú)H/R導(dǎo)致的腦損傷可能是由于缺氧/復(fù)氧抑制了GSK-3β在Ser9位點(diǎn)的磷酸化而使其活化，促進(jìn)了MAP2蛋白的降解造成神經(jīng)元微管穩(wěn)態(tài)失衡，最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。

綜上所述，GSK-3β參與了斑馬魚(yú)H/R損傷的神經(jīng)機(jī)制，并且與MAP2存在相關(guān)性， TDZD-8通過(guò)抑制GSK-3β活性減少M(fèi)AP2的降解，從而減少腦梗死面積及神經(jīng)元凋亡，最終有效改善腦缺氧/復(fù)氧損傷。但該研究的局限性在于并沒(méi)有進(jìn)一步證明GSK-3β對(duì)MAP2磷酸化的調(diào)節(jié)作用，以及干擾MAP2表達(dá)后對(duì)GSK-3β及H/R損傷的影響，需進(jìn)一步深入研究其具體機(jī)制，為保護(hù)腦缺氧/復(fù)氧造成的神經(jīng)損傷提供一種新思路。

圖4 p-GSK-3β / GSK-3β和MAP2蛋白相對(duì)表達(dá)

圖5 免疫熒光檢測(cè)各組MAP2的分布與表達(dá)