Prdx1過(guò)表達(dá)通過(guò)Nrf2/HO-1信號(hào)通路抑制氧化應(yīng)激減輕自發(fā)性高血壓大鼠心肌肥厚和纖維化

紀(jì)新博，顧申紅，麥華德，符碧薇

自發(fā)性高血壓(spontaneously hypertensive，SHR)是常見的心血管疾病之一，可對(duì)機(jī)體重要器官產(chǎn)生損害，是全球人口死亡的重要風(fēng)險(xiǎn)因素。心臟作為長(zhǎng)期高血壓主要損傷的靶器官之一，主要損傷表現(xiàn)為左心室結(jié)構(gòu)改變和重構(gòu)，最終引起心力衰竭的發(fā)生[1]。研究[2]報(bào)道，心肌肥厚和纖維化是心臟重構(gòu)的重要病理變化，減輕心肌肥厚和纖維化對(duì)于治療SHR所致心臟病以及降低SHR誘導(dǎo)心力衰竭患者死亡率具有積極的意義。過(guò)氧化物氧化還原酶蛋白(peroxiredoxin，Prdx)是一個(gè)由六種硫醇依賴性過(guò)氧化物酶組成的家族，在對(duì)抗活性氧簇、抗氧化過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。既往研究[4-6]表明，Prdx是生理和病理性心血管事件的重要調(diào)節(jié)劑。Prdx1作為Prdx家族的一員，可通過(guò)清除活性氧調(diào)節(jié)氧化劑敏感性并發(fā)揮抗氧化作用[7]。然而，Prdx1是否在SHR所致心血管疾病中起作用尚不清楚。該研究旨在探索Prdx1在SHR所致心肌肥厚和心肌纖維化中的作用，并分析其相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及腺病毒 SPF級(jí)雄性SHR大鼠45只，SPF級(jí)雄性Wistar Kyoto(WKY)健康大鼠15只，9周齡，體質(zhì)量190～200 g。室溫18～24 ℃，相對(duì)濕度50%～70%，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水、進(jìn)食。所有大鼠均購(gòu)自海南藥物研究所有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證：SCXK(瓊)2020-0007。Prdx1過(guò)表達(dá)腺病毒(AAV9-Prdx1)及AAV9陰性對(duì)照(AAV9-NC)購(gòu)自上?；蚧び邢薰?。

1.1.2主要試劑及儀器 蘇木精-伊紅染色(HE)試劑盒、Masson三色染色試劑盒均購(gòu)自優(yōu)博奧生物科技有限公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；qRT-PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購(gòu)自碧云天生物研究所；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海通蔚實(shí)業(yè)有限公司；兔抗Prdx1、核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)、血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)、醌氧化還原酶1[NAD(P)H：quinone acceptor oxidoreductase 1，NQO1]抗體，鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG購(gòu)自美國(guó)Jackson Immuno Resrarch公司；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)購(gòu)自美國(guó)GEN-VIEW公司。BP-2010A型動(dòng)物智能無(wú)創(chuàng)血壓儀購(gòu)自日本 Softron 株式會(huì)社；Vev770型小動(dòng)物超聲檢測(cè)儀購(gòu)自 Visualsonics公司；ELx808酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Biotek公司；ECLIPSE CI光學(xué)顯微鏡、DS-U3成像系統(tǒng)購(gòu)自日本尼康公司；qRT-PCR儀購(gòu)自美國(guó)Roche公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組及給藥 45只SHR大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，連續(xù)7 d測(cè)量血壓，待大鼠血壓穩(wěn)定后，隨機(jī)分為模型組(SHR組)、AAV9-NC組、AAV9-Prdx1組，每組15只。另取15只WKY大鼠設(shè)為對(duì)照組(Control組)。其中AAV9-NC組大鼠尾靜脈注射AAV9-NC 1×1011viral particles/(L·d)；AAV9-Prdx1組大鼠尾靜脈注射AAV9-Prdx1 1×1011viral particles/(L·d)；SHR組和Control組大鼠均尾靜脈注射同等劑量的生理鹽水。連續(xù)給藥8周。

1.2.2超聲心動(dòng)圖檢測(cè)大鼠心功能指標(biāo) 各組大鼠麻醉后，采用Vevo 2100超高分辨率小動(dòng)物彩色超聲多普勒成像細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)大鼠心功能變化，記錄大鼠左心室射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction，EF)和左心室縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)。

1.2.3大鼠血壓測(cè)定 每2周采用智能無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)測(cè)定各組大鼠清醒狀態(tài)下的尾動(dòng)脈血壓。將大鼠置于37 ℃恒溫室內(nèi)適應(yīng)1 h，隨后將大鼠固定于血壓計(jì)配套的保溫套中，待大鼠安靜下來(lái)，血壓監(jiān)測(cè)界面的脈搏波穩(wěn)定時(shí)開始測(cè)定血壓，連續(xù)檢測(cè)3次，計(jì)算大鼠平均血壓。

1.2.4大鼠心肌肥厚指標(biāo)檢測(cè)及樣本采集 末次給藥后，準(zhǔn)確稱量大鼠體質(zhì)量，大鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/kg)麻醉大鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心10 min后收集上清液，置于-80 ℃冰箱保存。采血結(jié)束后，迅速取出大鼠心臟，用生理鹽水沖洗后，用濾紙吸去多余水分，稱量大鼠心臟質(zhì)量，計(jì)算心臟質(zhì)量指數(shù)(heart mass index，HMI)和左心室質(zhì)量指數(shù)(left ventricular mass index，LVMI)，HMI(mg/g)=心臟質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量，LVMI(mg/g)=左心室體重/大鼠體質(zhì)量。隨后將一部分心肌組織放入4%多聚甲醛溶液中固定，一部分心肌組織置于-80 ℃冰箱保存待測(cè)。

1.2.5大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)觀察 取固定于4%多聚甲醛中的心肌組織，經(jīng)石蠟包埋制成5 μm厚度的石蠟切片，切片常規(guī)脫蠟水化后，分別進(jìn)行HE染色和Masson染色，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化和大鼠心肌纖維化，其中膠原纖維呈藍(lán)色，心肌組織呈紅色。

1.2.6大鼠血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 取各組大鼠血清，嚴(yán)格根據(jù)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)SOD、GSH-Px、MDA水平。

1.2.7qRT-PCR法檢測(cè)大鼠心肌組織中Prdx1 mRNA表達(dá)水平 取大鼠心肌組織，使用TRIzol試劑從心肌組織中提取總RNA，以紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度和濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書合成cDNA，使用SYBR Green Master Mix試劑盒進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)。Prdx1上游引物序列：5′-TTTGTGTGTCCCACGGAGAT-3′，下游引物序列：5′-TAATGGTGCGCTTGGGATCTG-3′；GAPDH上游引物序列：5′-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3′，下游引物序列：5′-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3′。反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。以GAPDH基因作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算Prdx1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.8Western blot法檢測(cè)大鼠心肌組織中Prdx1蛋白和Nrf2/HO-1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá) 取大鼠心肌組織，加入RIPA裂解緩沖液提取總蛋白，通過(guò)BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白煮沸變性后，取定量蛋白在SDS-PAGE凝膠上分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，室溫下用5%脫脂奶粉封閉膜2 h。洗膜后，將膜與Prdx1(1 ∶800)、Nrf2(1 ∶500)、HO-1(1 ∶500)、NQO1(1 ∶500)、GAPDH(1 ∶1 000)一抗在4 ℃條件下孵育過(guò)夜，洗膜，加入二抗(1 ∶2 000)，室溫下孵育1 h。采用ECL發(fā)光顯色液顯影，凝膠成像分析儀分析蛋白條帶，以GAPDH作為內(nèi)源性參照，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌組織中Prdx1表達(dá)變化與Control組比較，SHR組和AAV9-NC組大鼠心肌組織中Prdx1 mRNA和蛋白表達(dá)量均降低(F=39.571、46.230，P<0.05)；與SHR組比較，AAV9-Prdx1組大鼠心肌組織中Prdx1 mRNA和蛋白表達(dá)量均升高(F=21.975、25.783，P<0.05)。見圖1。

2.2 Prdx1過(guò)表達(dá)對(duì)SHR大鼠平均血壓的影響給藥2周后，與Control組比較，SHR組和AAV9-NC組大鼠平均血壓升高(P<0.05)；AAV9-Prdx1組大鼠平均血壓與SHR組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。給藥4～8周后，與Control組比較，SHR組和AAV9-NC組大鼠平均血壓升高(P<0.05)；與SHR組比較，AAV9-Prdx1組大鼠平均血壓呈穩(wěn)定降低趨勢(shì)(P<0.05)。見表1。

2.3 Prdx1過(guò)表達(dá)對(duì)SHR大鼠心功能指標(biāo)及心肌肥厚指標(biāo)的影響與Control組比較，SHR組和AAV9-NC組大鼠心功能指標(biāo)EF和FS均降低，心肌肥厚指標(biāo)HMI和LVMI均升高(P<0.05)；與SHR組比較，AAV9-Prdx1組大鼠心功能指標(biāo)EF和FS均升高，心肌肥厚指標(biāo)HMI和LVMI均降低(P<0.05)。見表2。

2.4 Prdx1過(guò)表達(dá)對(duì)SHR大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)的影響Control組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞形態(tài)清晰。SHR組和AAV9-NC組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，排列紊亂，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。AAV9-Prdx1組大鼠心肌細(xì)胞病理?yè)p傷較SHR組明顯改善，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。見圖2。

2.5 Prdx1過(guò)表達(dá)對(duì)SHR大鼠心肌纖維化的影響Control組大鼠心肌纖維排列規(guī)則且密集，心肌間質(zhì)中存在少量膠原纖維；SHR組和AAV9-NC組大鼠心肌纖維化加重；AAV9-Prdx1組大鼠心肌纖維化較SHR組減少。見圖3。

2.6 Prdx1過(guò)表達(dá)對(duì)SHR大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響與Control組比較，SHR組和AAV9-NC組大鼠血清中SOD和GSH-Px活性降低，MDA含量升高(P<0.05)；與SHR組比較，AAV9-Prdx1組大鼠血清中SOD和GSH活性升高，MDA含量降低(P<0.05)。見表3。

圖1 各組大鼠心肌組織中Prdx1表達(dá)變化

表1 Prdx1過(guò)表達(dá)對(duì)SHR大鼠平均血壓的影響

表2 Prdx1過(guò)表達(dá)對(duì)SHR大鼠心功能指標(biāo)及心肌肥厚指標(biāo)的影響

圖2 Prdx1過(guò)表達(dá)對(duì)SHR大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)的影響 HE×200

圖3 Prdx1過(guò)表達(dá)對(duì)SHR大鼠心肌纖維化的影響 Masson×400

表3 Prdx1過(guò)表達(dá)對(duì)SHR大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

2.7 Prdx1過(guò)表達(dá)對(duì)SHR大鼠心肌組織中Nrf2/HO-1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與Control組比較，SHR組和AAV9-NC組大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)量均降低(F=15.731、17.862、14.921，P<0.05)；與SHR組比較，AAV9-Prdx1組大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)量均升高(F=13.985、11.749、10.770，P<0.05)。見圖4。

3 討論

Prdx1廣泛存在于原核生物和真核生物中，其作為一個(gè)過(guò)氧化物酶分子，可通過(guò)調(diào)節(jié)活性氧相關(guān)的多種信號(hào)通路在許多疾病如衰老、急性組織損傷、神經(jīng)退行性疾病和癌癥中發(fā)揮保護(hù)作用[8]。Lv et al[9]報(bào)道，Prdx1基因敲除可通過(guò)激活 P38/JNK 信號(hào)通路增加活性氧水平加重氧化應(yīng)激和肺損傷，提示Prdx1的抗氧化作用可以減輕脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷。Yang et al[10]報(bào)道，Prdx1通過(guò)靶向炎癥和凋亡相關(guān) mRNA 的穩(wěn)定性來(lái)減輕腦出血引起的腦損傷。Prdx1可能是減輕腦出血所致腦損傷的潛在治療靶點(diǎn)。Mei et al[11]研究發(fā)現(xiàn)，Prdx1過(guò)度表達(dá)抑制腎小管間質(zhì)纖維化中的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。Jiang et al[12]報(bào)道，Prdx1過(guò)表達(dá)通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和心肌細(xì)胞凋亡減輕阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性。本研究檢測(cè)Prdx1在SHR大鼠心肌肥厚和心肌纖維化中的作用，結(jié)果顯示Prdx1過(guò)表達(dá)穩(wěn)定降低SHR大鼠血壓，升高SHR大鼠心功能指標(biāo)EF、FS水平，降低心肌肥厚指標(biāo)HMI、LVMI水平，減輕大鼠心肌組織病理?yè)p傷和纖維化程度，對(duì)SHR大鼠心肌肥厚和纖維化具有保護(hù)作用，并改善了大鼠心功能不全。提示Prdx1在SHR心臟病發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

圖4 Prdx1過(guò)表達(dá)對(duì)SHR大鼠心肌組織中Nrf2/HO-1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

SHR的發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，在SHR患者體內(nèi)，氧化和抗氧化水平失衡，大量自由基產(chǎn)生引起血管內(nèi)皮損傷和血管功能障礙，加重高血壓病情，促使SHR引起機(jī)體器質(zhì)性損傷。研究[13]報(bào)道，抑制氧化應(yīng)激能夠恢復(fù)血管功能、減輕SHR誘導(dǎo)的心肌肥厚和心功能不全，從而阻止SHR引起的心臟重構(gòu)。SOD、GSH-Px、MDA是衡量氧化應(yīng)激反應(yīng)的主要相關(guān)指標(biāo)，SOD、GSH-Px是機(jī)體重要的過(guò)氧化物分解酶，可以有效消除氧自由基，保持細(xì)胞氧化還原的動(dòng)態(tài)平衡，進(jìn)而保持血管正常的舒縮活性，減輕血管內(nèi)皮功能和靶器官氧化損傷。MDA作為氧自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，其含量升高可加劇細(xì)胞膜損傷，同時(shí)提示機(jī)體抗氧化能力的降低[14]。本研究檢測(cè)上述氧化應(yīng)激指標(biāo)，結(jié)果顯示SHR大鼠血清中SOD和GSH-Px活性均降低，而MDA含量升高。經(jīng)過(guò)外源性Prdx1干預(yù)后，SHR大鼠血清中SOD和GSH-Px活性升高，MDA含量降低。提示Prdx1可能通過(guò)改善SHR大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)降低血壓，進(jìn)而減輕SHR引起的心肌損傷。

Nrf2是氧化應(yīng)激反應(yīng)中抗氧化防御系統(tǒng)調(diào)節(jié)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，靜息狀態(tài)下，Nrf2與Keap1結(jié)合處于無(wú)活性狀態(tài)。氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí)，無(wú)活性的Nrf2與Keap1解離進(jìn)入活化狀態(tài)，由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，通過(guò)調(diào)節(jié)一系列抗氧化酶如HO-1、NQO1等相關(guān)基因表達(dá)保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激損害。Nrf2/HO-1信號(hào)通路在保護(hù)機(jī)體免受內(nèi)源性或外源性應(yīng)激方面起著重要作用。已有研究[15]表明，抑制Nrf2/HO-1信號(hào)通路活性，能夠加重SHR大鼠心臟重構(gòu)。而增強(qiáng)Nrf2信號(hào)通路活性可有效抑制心肌梗死后心臟重塑[16]。Prdx1被證明能夠通過(guò)激活Nrf2，上調(diào)HO-1表達(dá)，減輕壓力超負(fù)荷引起的心肌肥厚和心力衰竭[17]。本研究顯示，Prdx1過(guò)表達(dá)能夠上調(diào)SHR大鼠心肌組織中Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表達(dá)。提示Prdx1可能通過(guò)激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路抑制氧化應(yīng)激，上調(diào)心肌組織抗氧化能力，進(jìn)而減輕SHR大鼠心肌肥厚和心肌纖維化。

綜上所述，Prdx1過(guò)表達(dá)通過(guò)激活Nrf2/HO-1抗氧化信號(hào)通路，抑制SHR心肌組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而抑制SHR導(dǎo)致的心肌肥厚和纖維化，保護(hù)心功能。