PRC1在胰腺癌中的細(xì)胞生物學(xué)功能及臨床意義

馬丹丹，張 翌，林振宇，董慶泰，蕭正康，李中虎，張智勇，金煒東

胰腺癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率逐年上升，其五年生存率小于8%，80% ～ 85%的患者存在不可切除或轉(zhuǎn)移性疾病[1]。胰腺癌具有起病隱匿、進(jìn)展迅速、侵襲能力強(qiáng)、總體預(yù)后差等特點(diǎn)，因此胰腺癌的診療給醫(yī)務(wù)工作者帶來巨大挑戰(zhàn)。尋找能夠早期篩查腫瘤的標(biāo)志物迫在眉睫[2]。既往研究[3-5]表明胞質(zhì)分裂調(diào)控蛋白1(protein regulating cytokinesis 1，PRC1)參與肝癌、胃癌、肺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，均表現(xiàn)出癌基因特性，并與不良預(yù)后密切相關(guān)。但目前關(guān)于PRC1在胰腺癌中功能、臨床意義及機(jī)制研究的報(bào)道甚少，其在胰腺癌中的作用不明確。該研究旨在探索PRC1在胰腺癌中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系、細(xì)胞生物學(xué)功能及可能的機(jī)制，以期為胰腺癌患者早期診斷及預(yù)后判斷提供新思路。

1 材料與方法

1.1 樣本來源收集中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院普通外科2021年1—12月收治住院接受手術(shù)治療的12例胰腺癌患者的組織標(biāo)本及。此研究獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬均簽署知情同意書。倫理審批文書批號(hào)：[2019]002-1。

1.2 試劑和儀器PRC1、GAPDH單克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗均購于美國(guó)Abcam公司(貨號(hào)：ab238427、ab245357、ab263962)。細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：C1062M)購自碧云天生物科技有限公司，Matrigel基質(zhì)膠(貨號(hào)：356234)購自美國(guó)BD公司，Transwell小室(貨號(hào)：3421)購自美國(guó)Corning公司。流式細(xì)胞儀(型號(hào)：Cyto Flex)購自貝克曼庫爾特生命科學(xué)公司，顯微鏡(型號(hào)：BX53)購自日本Olympus公司，顯影儀(型號(hào)：5100R)購自上海天能生物技術(shù)公司。人胰腺癌SW1990細(xì)胞株保存于本院中心實(shí)驗(yàn)室。

1.3 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析PRC1在胰腺癌組織及正常胰腺組織中的基因表達(dá)差異在GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)數(shù)據(jù)庫中設(shè)定條件為：“gene： PRC1”、“expression diy：boxplot”、“cancer type：PAAD”，可獲得PRC1在胰腺癌組織與正常胰腺組織中的表達(dá)差異。

1.4 免疫組織化學(xué)染色取出的組織常規(guī)甲醛固定包埋。玻片烤片、玻片脫蠟、抗原修復(fù)、內(nèi)源性酶滅活。放于抗原修復(fù)盒中在室溫條件下1 h封閉，按照1 ∶100比例滴加適量PRC1抗體孵育液到玻片上進(jìn)行一抗孵育，4 ℃過夜，洗凈一抗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1 ∶1 000)孵育1 h。DAB顯色、依次將切片放入70%乙醇溶液、80%乙醇溶液、90%乙醇溶液、95%乙醇溶液、無水乙醇I、無水乙醇II、二甲苯I、二甲苯II中脫水透明，中性樹脂封片、每個(gè)組織樣本中選擇5 個(gè)視野拍照。

1.5 Western blot檢測(cè)提取蛋白，測(cè)量蛋白濃度，配置分離膠和濃縮膠、蛋白上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、室溫下封閉2 h，按照1 ∶1 000比例滴加PRC1抗體和GAPDH抗體孵育液進(jìn)行一抗孵育，次日，加入1 ∶5 000 辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗進(jìn)行孵育。按照操作說明書配置顯影液等量混合，在顯影儀器中顯影、保存數(shù)據(jù)后統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染SW1990細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞接種于6孔板，待貼壁后，使用陽離子脂質(zhì)載體Lipofectamine 3000將pcDNA3.1-PRC1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW1990細(xì)胞作為過表達(dá)PRC1組(以PRC1表示)，將空載體pcDNA3.1-vector質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW1990細(xì)胞作為其對(duì)照組(以Control表示)。靶向PRC1的小干擾RNA(SiRNA-PRC1)則根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中PRC1基因序列設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)合成，設(shè)為沉默PRC1組(以SiRNA-PRC1表示)，同時(shí)合成隨機(jī)陰性對(duì)照組序列SiRNA-Control(以SiRNA-control表示)。

1.7 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖胰酶消化各組細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。接種于96孔板，每孔加入100 μl含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，分別于培養(yǎng)24、48 h后加入CCK-8試劑 100 μl/孔，37 ℃培養(yǎng)箱孵育3 h后，在酶標(biāo)儀上(設(shè)定波長(zhǎng)450 nm)讀取吸光度值。

1.8 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲胰酶消化各組細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×108個(gè)/L。將無血清的DMEM培養(yǎng)基加入帶基質(zhì)膠的Transwell小室上層，加入100 μl/孔細(xì)胞懸液。將600 μl含有FBS的培養(yǎng)基加入下室。培養(yǎng)箱中孵育48 h后，在室溫下每孔加入4%多聚甲醛1 ml，固定10 min，甲醇對(duì)細(xì)胞通透處理20 min，0.1%結(jié)晶紫染液染色20 min，棉簽擦去上室未遷移細(xì)胞，將Transwell小室膜切下，注意上下面，用不帶二甲苯的封片劑封片。在顯微鏡下200倍拍照觀察，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.9 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡用胰酶消化各組細(xì)胞，制成細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整密度為6.0×105個(gè)/ml。培養(yǎng)48 h后，PBS清洗2次，室溫避光條件下，加入400 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，然后加入10 μl的 AnnexinV-FITC避光孵育15 min，再加入5 μl的碘化丙啶(PI)避光染色5 min。1 h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.10 PRC1表達(dá)量數(shù)據(jù)獲取與分組在TCGA數(shù)據(jù)庫中，同時(shí)具有PRC1表達(dá)量數(shù)據(jù)及對(duì)應(yīng)臨床病理資料的患者共174例。以胰腺癌患者PRC1 mRNA表達(dá)量的中位數(shù)為分割點(diǎn)將患者分為PRC1高表達(dá)組與PRC1低表達(dá)組。

1.11 STRING數(shù)據(jù)庫分析PRC1相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)在STRING數(shù)據(jù)庫主界面中搜索蛋白名稱“PRC1”，選擇物種“Homo sapiens”，獲得PRC1在人類細(xì)胞中的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。STRING數(shù)據(jù)庫的目的是收集和整合表達(dá)蛋白之間相互作用的所有功能，將已知和預(yù)測(cè)的大量生物體的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)合并起來。綜合得分(Combined score)越接近1越能表明蛋白分子間存在相互作用，分?jǐn)?shù)越接近0 則表明蛋白分子間存在相互作用的可能性越低。

1.12 基因集富集分析本研究利用基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)研究PRC1 mRNA表達(dá)水平與京都基因和基因組百科全書通路基因集的相關(guān)性。設(shè)定運(yùn)行條件為：“Number of permutations”中選擇“1 000”，“Phenotype labels”中選擇“h_versus_l”, “Permutation type”中選擇“phenotype”。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理細(xì)胞實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析使用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間均數(shù)的比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。胰腺癌患者臨床病理特征與預(yù)后的關(guān)系采用Cox回歸分析，利用Kaplan-Meier法繪制胰腺癌患者生存曲線。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)庫中PRC1 mRNA基因表達(dá)變化GEPIA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，胰腺癌組織中的PRC1 mRNA表達(dá)量高于其在正常胰腺組織的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，在胰腺癌旁組織中，細(xì)胞排列整齊、形態(tài)規(guī)則，PRC1染色以淺黃色為主。在胰腺癌組織中，癌細(xì)胞排列紊亂、核大深染、形態(tài)不規(guī)則，PRC1染色以棕褐色為主，且定位于細(xì)胞質(zhì)。見圖2。

圖1 數(shù)據(jù)庫中PRC1 mRNA基因表達(dá)變化

圖2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 ×400

2.3 PRC1蛋白表達(dá)變化Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，PRC1在胰腺癌組織中的蛋白表達(dá)顯著高于胰腺癌旁組織[(1.950 ± 0.151)vs(0.358 ± 0.079)，t=32.369，P<0.01]。見圖3。

2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的驗(yàn)證針對(duì)PRC1的pcDNA3.1-PRC1質(zhì)粒和SiRNA轉(zhuǎn)染人胰腺癌細(xì)胞系SW1990 48 h后，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，PRC1組蛋白表達(dá)水平顯著高于Control組。SiRNA-PRC1組細(xì)胞中PRC1蛋白水平顯著低于SiRNA-control組。見圖4。因此，本研究設(shè)計(jì)的pcDNA3.1-PRC1能過表達(dá)PRC1，SiRNA-PRC1能沉默PRC1基因的表達(dá)，可用于進(jìn)一步研究PRC1在胰腺癌細(xì)胞系SW1990中的細(xì)胞生物學(xué)功能。

圖3 PRC1蛋白表達(dá)變化

圖4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的驗(yàn)證

2.5 PRC1對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control組相比， PRC1組的細(xì)胞存活率顯著增高(t=-9.464、-13.883，P<0.01)。與SiRNA-control組相比，SiRNA-PRC1組的細(xì)胞存活率顯著降低(t=21.659、16.300，P<0.01)。表明過表達(dá)PRC1促進(jìn)胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖，而沉默PRC1則抑制胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖。見圖5。

圖5 PRC1對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響

2.6 PRC1對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示， 過表達(dá)PRC1組細(xì)胞凋亡率顯著低于Control組(t=9.671，P=0.001)。SiRNA-PRC1組細(xì)胞凋亡率顯著高于SiRNA-control組(t=-9.515，P=0.001)。結(jié)果表明過表達(dá)PRC1抑制SW1990細(xì)胞凋亡，而沉默PRC1 可誘導(dǎo)SW1990細(xì)胞凋亡。見圖6。

2.7 PRC1對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：過表達(dá)PRC1組和Control組侵襲細(xì)胞數(shù)量分別為(47.667 ± 2.517)個(gè)、(30.667 ± 2.082)個(gè)。與Control組相比，過表達(dá)PRC1組侵襲的細(xì)胞數(shù)量明顯增多(t=-9.016，P=0.001)。SiRNA-PRC1組和SiRNA-Control組侵襲細(xì)胞數(shù)量分別為(23.000 ± 2.000)個(gè)、(33.667 ± 3.215)個(gè)。與SiRNA-Control組相比，SiRNA-PRC1組侵襲的細(xì)胞數(shù)量明顯減少(t=4.880，P=0.008)。表明過表達(dá)PRC1可促進(jìn)SW1990細(xì)胞侵襲能力，沉默PRC1可抑制SW1990細(xì)胞侵襲能力。見圖7。

圖6 PRC1對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響

圖7 PRC1對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響 ×200

表1 Cox回歸分析胰腺癌患者臨床病理特征與預(yù)后的關(guān)系

2.8 胰腺癌患者臨床病理特征與預(yù)后的關(guān)系PRC1基因表達(dá)水平與胰腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性采用COX回歸分析。單因素COX分析結(jié)果顯示，PRC1 mRNA表達(dá)水平和M分期對(duì)胰腺癌患者的預(yù)后存在顯著影響(P<0.05)。將有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的臨床病理參數(shù)進(jìn)一步納入多因素Cox分析，結(jié)果顯示PRC1 mRNA表達(dá)水平和M分期是胰腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表1。

2.9 PRC1表達(dá)水平對(duì)胰腺癌患者生存率的影響根據(jù)PRC1 mRNA表達(dá)水平的中位數(shù)，將胰腺癌患者分為PRC1高表達(dá)組與PRC1低表達(dá)組。利用Kaplan-Meier法繪制患者生存曲線。結(jié)果表明PRC1高表達(dá)組胰腺癌患者的生存時(shí)間顯著低于PRC1低表達(dá)組患者(χ2=4.970，P=0.026，中位生存時(shí)間為517 dvs661 d)，見圖8。

圖8 PRC1表達(dá)水平對(duì)胰腺癌患者生存率間的影響

2.10 PRC1的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)利用STRING數(shù)據(jù)庫分析人源PRC1可能存在的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果表明：與PRC1相互作用Score排名前10位的蛋白分別為PLK1(score=0.999)、KIF4A(score=0.997)、KIF20A (score=0.996)、KIF11(score=0.994)、KIF14(score=0.989)、CDK1(score=0.989)、TPX2(score=0.988)、RACGAP1(score=0.988)、CENPE(score=0.987)、NCAPG(score=0.986)，見圖9。

圖9 PRC1的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.11 PRC1的KEGG信號(hào)通路分析GSEA研究結(jié)果顯示：PRC1 mRNA高表達(dá)樣本富集到P53信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路等相關(guān)基因集(P<0.05)。見表2。

表2 PRC1的KEGG信號(hào)通路分析

3 討論

本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)系統(tǒng)分析PRC1在胰腺癌中的表達(dá)差異及其對(duì)胰腺癌預(yù)后的診斷價(jià)值。結(jié)果顯示PRC1基因水平在胰腺癌中高表達(dá)，且PRC1高表達(dá)與胰腺癌的不良預(yù)后密切相關(guān)。同時(shí)Western blot檢測(cè)結(jié)果提示PRC1蛋白水平在胰腺癌中亦高表達(dá)，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示PRC1定位于細(xì)胞質(zhì)。研究[5]表明PRC1在肺癌細(xì)胞系中過表達(dá)，PRC1的高表達(dá)與肺癌患者的預(yù)后不良有關(guān)，有望成為肺癌治療的潛在靶點(diǎn)。Chen et al[6]報(bào)道PRC1在肝癌中發(fā)揮致癌作用，PRC1高表達(dá)與早期肝癌復(fù)發(fā)和患者預(yù)后不良相關(guān)。Wang et al[7]進(jìn)一步觀察到PRC1可使肝癌患者產(chǎn)生化療耐藥并預(yù)測(cè)術(shù)后不良預(yù)后。研究[8]結(jié)果提示PRC1的過表達(dá)預(yù)示著乳腺癌患者預(yù)后的無病生存率較低。Bu et al[9]研究結(jié)果證實(shí)在卵巢癌中PRC1蛋白及mRNA表達(dá)均上調(diào)，PRC1過表達(dá)導(dǎo)致耐藥、腫瘤復(fù)發(fā)和預(yù)后不良。本研究結(jié)果與國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)[5-9]報(bào)道一致，均有力地證實(shí)PRC1可能在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，扮演重要角色。因此進(jìn)一步探討PRC1在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能及機(jī)制具有一定的臨床意義。

本研究體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PRC1促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移，并抑制其凋亡。梁志剛[10]報(bào)道過表達(dá)PRC1可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和遷移，并促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)入分裂期，沉默PRC1則抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和遷移。Chen et al[6]研究結(jié)果表明PRC1基因敲除顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。本研究結(jié)果與國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)[6,10]報(bào)道基本一致，均證實(shí)PRC1在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮促癌作用，為進(jìn)一步的機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)。

研究[11]結(jié)果表明Polo樣激酶1(Polo-like kinase 1，PLK1)是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，與PRC1共同作用調(diào)控有絲分裂細(xì)胞周期，在腫瘤細(xì)胞的形成中發(fā)揮作用，并在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)。本研究利用STING數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)PRC1通過與PLK1、KIF4A相互作用發(fā)揮功能，與文獻(xiàn)[11]報(bào)道一致。除此以外，還預(yù)測(cè)到與PRC1相互作用的蛋白有KIF20A、KIF11、KIF14、CDK1、TPX2、RACGAP1、CENPE、NCAPG。可為PRC1的功能研究提供新思路。

研究[12]表明抑癌基因P53是一種轉(zhuǎn)錄因子，由DNA損傷、癌基因激活和營(yíng)養(yǎng)缺乏等多種應(yīng)激信號(hào)誘導(dǎo)產(chǎn)生。具有調(diào)控細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡、維持基因組穩(wěn)定性等多種功能，在預(yù)防腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用，在功能上是“基因組的主要守護(hù)者”。Ye et al[3]報(bào)道殼聚糖包被阿霉素納米粒給藥系統(tǒng)通過P53/PRC1途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞周期停滯于G2/M期，從而抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)。Zhang et al[4]研究結(jié)果證實(shí)PRC1直接受P53的負(fù)調(diào)控，在胃癌細(xì)胞中P53表達(dá)缺失時(shí)，PRC1則高表達(dá)。高表達(dá)的PRC1在胃癌中發(fā)揮致癌作用。研究[13]表明胰腺癌相關(guān)的基因突變多集中于Wnt信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路等。Tang et al[14]研究結(jié)果表明在肝細(xì)胞癌中，microRNA-194通過PRC1介導(dǎo)的Wnt/β-catenin 信號(hào)通路抑制肝癌細(xì)胞侵襲和遷移。Cai et al[15]研究結(jié)果表明microRNA-194通過抑制PRC1介導(dǎo)的Wnt/β-catenin 信號(hào)通路來預(yù)防食道癌的發(fā)生。本研究GSEA預(yù)測(cè)PRC1在胰腺癌中發(fā)揮功能的可能信號(hào)通路有P53信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路等，與文獻(xiàn)[3-4,12-15]報(bào)道基本一致。除此以外，還預(yù)測(cè)到Notch信號(hào)通路、細(xì)胞周期、DNA復(fù)制、RNA降解、細(xì)胞凋亡、錯(cuò)配修復(fù)等，可為PRC1在胰腺癌中的進(jìn)一步機(jī)制研究提供更多線索和思路。

綜上所述，PRC1在胰腺癌中高表達(dá)是胰腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，并促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖及侵襲，具有癌基因的特性，有望成為胰腺癌早期診斷和預(yù)后判斷的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。