人源GRK2的真核表達、純化及活性檢測

蔣勵萍，陳露穎，蒯佳婕，王鳳玲，李 浩，關(guān)艷玲，馬 旸，韓陳陳，魏 偉

G蛋白偶聯(lián)受體激酶 2(G protein-coupled receptor kinase 2, GRK2)屬于絲/蘇氨酸激酶，參與調(diào)節(jié)G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptors, GPCRs)的磷酸化、脫敏和內(nèi)化[1]。GRK2活性和表達的改變在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)等炎癥免疫相關(guān)疾病中起著重要作用[2]。課題組前期研究[3-5]表明，GRK2與前列腺素E2受體4 (prostaglandin E2 receptor 4, EP4)結(jié)合，介導(dǎo)受體過度脫敏，導(dǎo)致RA中成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes, FLS)的異常增殖和巨噬細胞極化。因此，GRK2可能通過調(diào)控與其結(jié)合的蛋白活性或表達，從而發(fā)揮多種生理和病理作用。

為了研究GRK2調(diào)控EP4的分子機制，本研究利用前期獲得的GRK2野生型質(zhì)粒，連接到高效真核表達載體pcDNA3.1-EGFP上，構(gòu)建重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK 293T 細胞中進行蛋白表達，通過 Ni-NTA 純化及超濾獲得 His-GRK2 重組蛋白。采用SDS-PAGE、Western blot、免疫共沉淀及His pull down等方法，鑒定GRK2重組蛋白的表達和生物活性，旨在為進一步研究GRK2蛋白對EP4的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞、菌株、載體 人胚腎HEK 293T細胞購自中國科學(xué)院上海細胞庫；pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒、pIRES-EGFP-GRK2、pIRES-EGFP-EP4 質(zhì)粒由本課題組前期構(gòu)建和保存；大腸埃希菌DH5ɑ 購自上海唯地生物技術(shù)有限公司。

1.1.2主要試劑 胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、DMEM 培養(yǎng)基及PBS購自以色列BI公司；Prime STAR酶、限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ、限制性內(nèi)切酶 BamH Ⅰ、T4 DNA連接酶、DNA Marker DL10000購自日本TaKaRa公司；切膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提取試劑盒購自TIANGEN天根生化科技(北京)有限公司；兔源GRK2、鼠源EP4購自美國Santa Cruz公司；山羊抗兔和山羊抗鼠二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；6FF瓊脂糖凝膠微珠購自美國GE公司；JetPRIME transfection reagent轉(zhuǎn)染試劑購自法國PolyPlus公司；考馬斯亮藍染色液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PVDF膜和蛋白超濾管(截留30～50 ku蛋白)購自美國Millipore公司。

1.1.3主要儀器 T100TMPCR 儀購自美國 Bio-Rad公司；核酸電泳儀和 DYY-6C 型電泳系統(tǒng)購自北京六一公司；Scientz-IID 超聲波細胞粉碎機購自南京賽飛生物科技有限公司；Tanon 1600全自動數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司；ImageQuant LAS 4000熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自美國GE公司。

1.2 方法

1.2.1引物設(shè)計、合成及PCR擴增 從 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/ 網(wǎng)站獲取人源 GRK2 基因序列(NM 001 619.5)，設(shè)計并添加Hind Ⅲ 和BamH Ⅰ 酶切位點和C端6×His標(biāo)簽(CATCATCACCATCACCAT)的引物擴增全長約為2 067 bp的GRK2基因，上游引物：5′-CCCAAGCTTATCCACCTGACCATGAATG-3′ (下劃線部分是Hind Ⅲ 酶切位點)，下游引物：5′-CGCGGATCCATGGTGATGGTGATGATGGAGGCCG-3′ (下劃線部分是BamH Ⅰ 酶切位點，加粗是6×His標(biāo)簽)，所有引物由通用生物(安徽)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系 (50 μl)：cDNA 1 μl、上游引物 1 μl、下游引物 1 μl、Prime Star DNA 聚合酶 0.5 μl、dNTP 4 μl、5×Prime Star buffer 10 μl、H2O 32 .5 μl。反應(yīng)程序如下：30個循環(huán)(98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 2 min) 進行擴增。將PCR產(chǎn)物進行1.0% 瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)約2 067 bp 的條帶時利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收產(chǎn)物。

1.2.2pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2重組真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建及雙酶切鑒定 將His-GRK2 的PCR產(chǎn)物回收片段與pcDNA3.1-EGFP 質(zhì)粒，37 ℃，Hind Ⅲ 和BamH Ⅰ 雙酶切2 h，產(chǎn)物分別經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。用T4 DNA連接酶在4 ℃條件下連接 His-GRK2 基因片段回收產(chǎn)物與pcDNA3.1-EGFP 回收產(chǎn)物 12 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化液涂板，37 ℃培養(yǎng)12～16 h，挑取菌落搖菌培養(yǎng)，利用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。

1.2.3pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2重組真核表達質(zhì)粒的測序驗證 挑選重組質(zhì)粒，經(jīng) Hind Ⅲ 和BamH Ⅰ 雙酶切鑒定為陽性克隆后送至南京擎科生物科技有限公司進行測序，以載體的通用引物進行測序鑒定。測序結(jié)果利用https://blast.ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)址進行測序比對。

1.2.4細胞培養(yǎng)與pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2重組真核表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 細胞準(zhǔn)備：人HEK 293T細胞以每孔1×106個細胞接種于6孔板中，以10% DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37 ℃、5 % CO2箱中孵育24 h，至細胞達到80%～90%融合進行轉(zhuǎn)染。

轉(zhuǎn)染方法(6孔板)：① 制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物：取無菌1.5 ml EP管，加入200 μl的jetPRIME buffer，再加入2 μg DNA，快速渦旋10 s，混勻后，加入4 μl的jetPRIME reagent轉(zhuǎn)染試劑，快速渦旋10 s，混勻后室溫靜置10 min。② 轉(zhuǎn)染：將6孔板中培養(yǎng)基棄去，加入2 ml 10%DMEM，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入孔中，將其置于37 ℃、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，觀察轉(zhuǎn)染效果。

1.2.5倒置熒光顯微鏡觀察pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2轉(zhuǎn)染效率 HEK 293T細胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2質(zhì)粒后(帶有EGFP標(biāo)簽)，培養(yǎng)48 h，在倒置熒光顯微鏡下觀察GRK2的轉(zhuǎn)染效率并拍照。

1.2.6Western blot鑒定GRK2蛋白在細胞中的表達 HEK 293T細胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2質(zhì)粒48 h后，加細胞裂解液冰上裂解30 min，提取蛋白，BCA蛋白定量后，加入5×蛋白上樣緩沖液，沸水煮沸10 min，Western blot檢測蛋白表達情況。

1.2.7His-GRK2重組蛋白的純化和鑒定 將GRK2真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK 293T細胞，培養(yǎng)48 h后，收集細胞，加入蛋白裂解液，通過細胞破碎儀破碎細胞，4 ℃條件下，13 400 r/min離心15 min，收集蛋白上清液，將蛋白上清液與6FF瓊脂糖凝膠微珠，4 ℃搖床孵育2 h，離心收集微珠，4 ℃條件下，蛋白洗液(含20 mmol/L 咪唑)洗滌3次，30 min/次，離心收集微珠，4 ℃條件下，蛋白洗脫液(含300 mmol/L 咪唑)洗滌3次，30 min/次，分別收集3次洗脫蛋白(第1次洗脫蛋白、第2次洗脫蛋白、第3次洗脫蛋白)，將3次洗脫蛋白加入5 ml超濾管(截留蛋白30～50 ku)離心，收集蛋白，加入蛋白置換液(低鹽蛋白緩沖液)于5 ml超濾管，進行離心，置換蛋白緩沖液，得到脫鹽后的蛋白，通過考馬斯亮藍染色和Western blot檢測3次洗脫蛋白和脫鹽后蛋白的表達。

1.2.8His pull down 檢測GRK2蛋白的活性 本研究前期已成功構(gòu)建 pIRES-EGFP-EP4 質(zhì)粒，將與GRK2真核重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK 293T細胞，收集轉(zhuǎn)染后的細胞，加入蛋白裂解液，通過細胞破碎儀破碎細胞后，4 ℃條件下，13 400 r/min離心15 min，將帶有His標(biāo)簽的GRK2與6FF瓊脂糖凝膠微珠，4 ℃搖床孵育2 h，離心收集微珠，4 ℃條件下，蛋白洗液(含20 mmol/L 咪唑)洗滌3次，30 min/次，離心收集微珠。將過表達pIRES-EGFP-EP4的蛋白與處理的微珠4 ℃搖床孵育12～16 h。離心收集微珠，加入20～30 μl的蛋白上樣緩沖液，沸水煮10 min，Western blot檢測GRK2與EP4的共表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用GraphPad Prism 8 軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示。采用t檢驗比較兩組間差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2重組質(zhì)粒的構(gòu)建利用設(shè)計的引物以pIRES-EGFP-GRK2基因為模板，利用合成引物進行PCR擴增 His-GRK2目的基因全長，進行1%瓊脂糖電泳。凝膠成像系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)，線性His-GRK2目的片段位置在2 067 bp左右(圖1A)。將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖電泳，切膠回收產(chǎn)物。將PCR回收產(chǎn)物與pcDNA3.1-EGFP空載體通過Hind Ⅲ和BamH Ⅰ進行雙酶切，酶切產(chǎn)物通過T4 DNA連接酶進行連接，構(gòu)建pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2質(zhì)粒，雙酶切鑒定結(jié)果表明，在 2 067 bp左右出現(xiàn)線性His-GRK2目的片段，在6 154 bp左右出現(xiàn)線性pcDNA3.1-EGFP目的片段，提示pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2質(zhì)粒成功構(gòu)建(圖1B)。同時隨機挑選1個酶切鑒定陽性的質(zhì)粒進行測序，并對測序結(jié)果進行拼接，利用https://blast.ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)址進行測序比對，發(fā)現(xiàn) GRK2 standard Seq 與測序結(jié)果一致，pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2重組質(zhì)粒未發(fā)生突變，測序序列對比未出現(xiàn)異常，說明 pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2 重組質(zhì)粒成功構(gòu)建(圖1C)。

圖1 人源GRK2基因PCR擴增、酶切鑒定和測序

2.2 pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2蛋白成功表達HEK 293 T細胞以2×106個/孔細胞密度接種于6孔板中，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP-ctr和pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2重組質(zhì)粒，培養(yǎng) 48 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果，可見綠色熒光蛋白(EGFP標(biāo)簽)的表達，pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果達到60%以上(圖2A)。收集轉(zhuǎn)染后的細胞，細胞裂解液冰上裂解30 min，Western blot用于檢測GRK2重組蛋白的表達，結(jié)果表明pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2在HEK 293 T細胞中過表達(t=6.433,P=0.003)(圖2B)。

圖2 Western blot檢測GRK2蛋白表達

2.3 表達和純化獲得His-GRK2重組蛋白HEK 293T細胞轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2 質(zhì)粒后，裂解蛋白，加入 6FF 瓊脂糖凝膠微珠孵育后。加入1 ml蛋白洗脫液(高鹽)，洗脫蛋白進行超濾，得到 500 μl 蛋白溶液。考馬斯亮藍染色檢測GRK2蛋白純化效果見圖 3A，Western blot 檢測 GRK2 蛋白表達結(jié)果見圖3B。結(jié)果表明，考馬斯亮藍染色和Western blot檢測均可以在80 ku左右檢測GRK2陽性蛋白表達。

圖3 考馬斯亮藍染色和Western blot分析GRK2蛋白的表達和純化

2.4 GRK2結(jié)合EP4HEK 293T細胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2質(zhì)粒，同時轉(zhuǎn)染pIRES-EGFP-ctr和pIRES-EGFP-EP4質(zhì)粒，裂解蛋白后，與結(jié)合His蛋白的鎳珠共同孵育，處理后的蛋白樣品沸水煮10 min，Western blot檢測EP4蛋白的表達。結(jié)果表明，過表達EP4可以促進GRK2與EP4的結(jié)合(t=13.5,P=0.000 2)(圖 4)。

圖4 His pull down 檢測GRK2與EP4的結(jié)合能力

3 討論

GRK2由689個氨基酸(amino acid, aa)組成，具有3個重要的結(jié)構(gòu)域：氨基端(1-185 aa)、激酶活性區(qū)(186-513 aa)和羧基端(514-689 aa)[6]。GRK2的氨基端具有一個G 蛋白信號同源域調(diào)節(jié)(regulator of G protein signaling homology, RH)區(qū)，通過結(jié)合Gβγ等蛋白發(fā)揮轉(zhuǎn)膜功能[7]。GRK2激酶活性的改變是GRK2發(fā)揮多種生理和病理功能的重要條件，有研究[8]表明220位的賴氨酸(Lys, K)是決定GRK2激酶活性的關(guān)鍵氨基酸位點，Lys220突變?yōu)榫彼?Arg, R)可使GRK2激酶活性喪失。GRK2的羧基端具有RH區(qū)和 Pleckstrin同源(Pleckstrin homology, PH)區(qū)，有利于其亞細胞定位和激動劑依賴的轉(zhuǎn)膜，可以與游離Gβγ亞單位、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)等蛋白結(jié)合[9-10]。目前已有許多研究表明GRK2表達和活性的改變與疾病的發(fā)生相關(guān)，如GRK2表達和活性增加在高血壓、心衰以及RA的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，而GRK2的表達和活性的降低與肝癌、多發(fā)性硬化癥等疾病的發(fā)生密切相關(guān)[11]。這些研究結(jié)果提示，GRK2的活性維持在一個平衡狀態(tài)是研究GRK2活性調(diào)節(jié)劑的主要方向?，F(xiàn)已有多種GRK2活性調(diào)節(jié)劑被嘗試用于治療心力衰竭、RA等疾病，其中帕羅西汀、Gallein、GSK180736A等已經(jīng)進入動物試驗階段[12-13]。

本實驗在GRK2的羧基末端引入了6×His (CATCATCACCATCACCAT)的短肽是蛋白純化常用的標(biāo)簽。目前常用于蛋白純化的標(biāo)簽蛋白包括His、Myc、Flag、GST等標(biāo)簽，但Myc重組蛋白的低pH洗脫條件往往會降低蛋白質(zhì)的活力，所以較少用于純化蛋白，F(xiàn)lag重組蛋白的純化成本較高，GST標(biāo)簽純化成本低但增溶能力一般。His 標(biāo)簽相較于Myc、Flag、GST等標(biāo)簽具有以下優(yōu)勢：① 標(biāo)簽蛋白非常小，不會影響目的蛋白質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)；② 不會影響目的蛋白自身的活性；③ 便于采用固化金屬離子親和層析；④ 操作方便，純化蛋白成本低。本實驗選擇pcDNA3.1-EGFP真核表達載體構(gòu)建His-GRK2真核表達重組質(zhì)粒，這與原核表達體系相比，雖然不能一次性獲得大量的蛋白，但具有以下優(yōu)勢：外源性真核表達特異性強，具有翻譯后加工修飾功能，使其結(jié)構(gòu)、糖基化方式更接近天然蛋白，具有高活性。

獲得有活性的GRK2蛋白是進一步研究其功能和作用機制的前提。本研究通過設(shè)計引物，利用PCR擴增技術(shù)得到帶有His標(biāo)簽的GRK2基因，并采用分子克隆手段將GRK2基因連接到pcDNA3.1-EGFP真核表達載體上，成功構(gòu)建pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2真核表達質(zhì)粒，通過酶切鑒定和測序結(jié)果證明pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2構(gòu)建成功。再利用瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)將其轉(zhuǎn)染入HEK 293T中，通過Western blot及考馬斯亮藍染色驗證GRK2在真核細胞293T中正確表達。通過His pull down 的方法鑒定出GRK2與EP4的相互作用，具有生物學(xué)活性，為后續(xù)研究GRK2的作用機制奠定了基礎(chǔ)。