丹皮酚腙類化合物的合成及其殺蟲活性研究

王瑞光，魏如雪，李 巖，田月娥，車志平

（河南科技大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，河南洛陽 471003）

在國家大力倡導(dǎo)發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)的今天，積極研發(fā)高效、低毒、作用方式獨(dú)特、具有自主知識產(chǎn)權(quán)的綠色農(nóng)藥是我國農(nóng)業(yè)有害生物有效防控以及抗藥性治理的迫切需求[1]。近年來我國在綠色農(nóng)藥創(chuàng)制領(lǐng)域取得了長足的發(fā)展，但在原創(chuàng)性農(nóng)藥活性化合物研發(fā)方面仍存在諸多短板[2]，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)和作用方式新穎、機(jī)理獨(dú)特、易于合成與修飾的農(nóng)藥活性化合物是當(dāng)前我國農(nóng)藥科學(xué)基礎(chǔ)研究的核心內(nèi)容之一。而以天然活性物質(zhì)為先導(dǎo)進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化是發(fā)現(xiàn)新型農(nóng)藥分子的一條重要途徑，在綠色農(nóng)藥研發(fā)方面發(fā)揮著重要的作用[3]。

丹皮酚（Paeonol）是從毛莨科植物牡丹（Paeonia suffruticosa）的根皮和蘿藦科植物徐長卿（Cynanchum paniculatum）的全株中提取、分離得到的一種酚酮類化合物，具有廣泛的藥理作用和農(nóng)藥生物活性[4-5]。丹皮酚農(nóng)藥生物活性廣譜，如對水果與蔬菜具有保鮮作用；對植物病原卵菌、真菌、細(xì)菌、病毒具有抑制作用；對害蟲具有胃毒、熏蒸及觸殺作用，對其產(chǎn)卵有忌避作用；對植物寄生線蟲具有較好的防效，且速效性好[4]。近年來，Che等[6-8]合成了系列丹皮酚類衍生物I～V，結(jié)構(gòu)式見圖1，進(jìn)一步測定了其殺粘蟲（Mythimna separata）活性，并發(fā)現(xiàn)了數(shù)個對鱗翅目（Lepidoptera）害蟲具有顯著毒殺活性的丹皮酚類化合物。

圖1 丹皮酚（Paeonol）及其衍生物（I～V）的化學(xué)結(jié)構(gòu)

已有研究證明丹皮酚類化合物具有多種獨(dú)特的生物效應(yīng)以及在科學(xué)研究、臨床醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用價值[4-5]，為丹皮酚可能開發(fā)成新型農(nóng)藥奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。生物效應(yīng)主要體現(xiàn)在：①丹皮酚可作用于乙酰膽堿酯酶（AChE），顯著影響突觸部位神經(jīng)沖動的正常傳遞[9]。②丹皮酚穿過血腦屏障（BBB）運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制表明，其能主動通過H+/OC逆向轉(zhuǎn)運(yùn)器穿過BBB進(jìn)入大腦[10-11]。③丹皮酚能使小麥紋枯病菌（Rhizoctonia cerealis）菌體可溶性蛋白和還原糖含量顯著降低，幾丁糖含量顯著升高，嚴(yán)重影響菌體的正常生長[12]。④在不受酶的控制下，丹皮酚的活性羰基能與線蟲角質(zhì)層中的蛋白質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)（Maillard reaction），生成糖基化末端產(chǎn)物（AGEs），促使角質(zhì)層裂解，導(dǎo)致線蟲死亡[13-15]。⑤AGEs能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生活性氧（ROS），從而抑制線蟲V-ATPase活性；細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）會因AGEs的增加而失去組織彈性，主要表現(xiàn)在膠原蛋白和彈性纖維的流失；糖化后的細(xì)胞內(nèi)蛋白會失去原有的機(jī)能[13，16]。

以天然產(chǎn)物為先導(dǎo)創(chuàng)制具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新農(nóng)藥是農(nóng)藥創(chuàng)新的有效途徑之一，丹皮酚以其特有的結(jié)構(gòu)與生物活性而備受關(guān)注。丹皮酚具有廉價易得（既可以從植物中提取，也可以全合成[17]）、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、結(jié)構(gòu)易于修飾等優(yōu)點(diǎn)，具備作為新型農(nóng)藥先導(dǎo)化合物的潛力。鑒于此，本文制備了21個3/5(3,5)-(二)硝基/氯丹皮酚酰腙類化合物和18個3/5(3,5)-(二)硝基丹皮酚腙類化合物，在室內(nèi)測定其對草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）的毒殺活性，以期能發(fā)現(xiàn)具有潛在應(yīng)用價值的化合物。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

試驗(yàn)主要儀器有Bruker-AV 400 MHz型核磁共振儀，瑞士Bruker公司；X-4數(shù)字顯示顯微熔點(diǎn)測定儀，北京泰克儀器有限公司；質(zhì)譜用LTQ Orbitrap Elite測定。

試驗(yàn)所用試劑均為分析純，丹皮酚、酰肼、鹽酸肼、濃鹽酸、濃硝酸、濃硫酸和雙氧水均購自阿拉丁試劑網(wǎng)（https：//www.aladdin-e.com）；薄層層析和柱層層析硅膠購自青島海洋化工有限公司。

1.2 供試?yán)ハx

三齡前期草地貪夜蛾，由河南科技大學(xué)植物保護(hù)系害蟲防治實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 化合物的合成

1.3.1 中間體5-硝基丹皮酚（A）和3-硝基丹皮酚（B）的制備

在100 mL燒瓶中加入丹皮酚（1，25 mmol）和H2SO4（20 mL），攪拌至完全溶解；將反應(yīng)液置于低溫恒溫反應(yīng)浴中冷卻至-30℃，后緩慢滴加HNO4（25 mmol），3～5 min滴畢；反應(yīng)持續(xù)9 h，后將反應(yīng)液在攪拌下倒入冰水（200 mL）中，析出大量顆粒狀固體，抽濾，水洗至中性，抽干，經(jīng)硅膠柱層析分離，分別得到重要中間體5-硝基丹皮酚（A）和3-硝基丹皮酚（B），如圖2所示。

圖2 化合物A～C 的合成路線

A：產(chǎn)率29%，淺黃色固體，m.p. 125～126℃。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：13.03（s，1H）、8.50（s，1H）、6.55（s，1H）、4.01（s，3H）、2.64（s，3H）。ESI-MS，m/z（%）210（[M-H]+，100）。

B：產(chǎn)率13%，淺黃色固體，m.p. 132～133℃。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：13.06（s，1H）、7.83（d，J=8.8 Hz 1H）、6.58（d，J=9.2 Hz，1H）、3.97（s，3H）、2.61（s，3H）。ESI-MS，m/z（%）210（[M-H]＋，100)。

1.3.2 中間體3，5-二硝基丹皮酚（C）的制備

在100 mL燒瓶中加入丹皮酚（1，25 mmol）和H2SO4（20 mL），攪拌至完全溶解。將反應(yīng)液置于低溫恒溫反應(yīng)浴中冷卻至-30℃，后緩慢滴加HNO4（75 mmol），3～5 min滴畢；持續(xù)反應(yīng)12 h，后將反應(yīng)液在攪拌下倒入冰水（200 mL）中，析出大量顆粒狀固體，抽濾，水洗至中性，抽干，用乙酸乙酯重結(jié)晶得重要中間體3，5-二硝基丹皮酚（C）。

C：產(chǎn)率74%，淺黃色固體，m.p. 129～130℃。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：13.43（s，1H）、8.62（s，1H）、4.09（s，3H）、2.74（s，3H）。ESI-MS，m/z（%）255（[M-H]+，100）。

1.3.3 中間體5-氯丹皮酚（D）的制備

室溫下，將丹皮酚（1，1 mmol）加入40 mL HCl（6.0 mol/L）溶液中；在15 min內(nèi)，溶液從室溫緩慢升溫至45℃，然后加入30%H2O2（0.2 mL），將反應(yīng)液在60℃下攪拌15 min。然后在冰浴中攪拌反應(yīng)液直至充分產(chǎn)生沉淀，過濾沉淀，用石油醚洗滌并干燥，獲得關(guān)鍵中間體化合物D，如圖3所示。

圖3 化合物D 的合成路線

D：產(chǎn)率72%，淺黃色固體，m.p. 112～113℃。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：12.65（s，1H）、7.69（s，1H）、6.47（s，1H）、3.92（s，3H）、2.55（s，3H）。ESI-MS，m/z（%）201（[M＋H]＋，100）。

1.3.4 目標(biāo)化合物1～21的制備

3/5(3,5)-(二)硝基/氯丹皮酚酰腙類化合物（1～21）的合成及其結(jié)構(gòu)表征見文獻(xiàn)[14]，結(jié)構(gòu)式見圖4。

圖4 丹皮酚酰腙類化合物1～21 的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.3.5 目標(biāo)化合物22～39的制備

3/5(3,5)-(二)硝基丹皮酚腙類化合物（22～39）的合成及其結(jié)構(gòu)表征見文獻(xiàn)[15]，結(jié)構(gòu)式見圖5。

圖5 丹皮酚腙類化合物22～39 的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.4 殺蟲活性測定

待測樣品：川楝素（Toosendanin），購自阿拉丁試劑網(wǎng)（https：//www.aladdin-e.com/zh_cn/），純度大于等于98%。

測定方法：①試蟲為三齡前期草地貪夜蛾，采用小葉碟添加法喂毒[18]，以川楝素為陽性對照，丙酮為空白對照，所測樣品質(zhì)量濃度為1 mg/mL；②每一樣品設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)挑選10頭健壯、大小均一的三齡前期草地貪夜蛾，飼養(yǎng)于直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿底部鋪一層濾紙以保濕；③將新鮮玉米葉片剪成1 cm×1 cm的小葉碟，在預(yù)先配好的樣品藥液和對照藥液中浸3 s，自然晾干后喂養(yǎng)試蟲，待試蟲吃完小葉碟后，及時添加小葉碟，飼養(yǎng)48 h后喂正常的葉片直至羽化；④飼養(yǎng)條件：溫度為（25±2）℃，相對濕度為65%～80%，光照時間12 h，黑暗時間12 h；⑤定期記錄試蟲的取食量、活口數(shù)和表現(xiàn)癥狀等。試蟲不同時期的校正死亡率計(jì)算公式為

2 結(jié)果與討論

2.1 合成部分

如圖2和3所示，①丹皮酚（1）與濃硝酸（HNO3）在濃硫酸（H2SO4）作用下反應(yīng)合成重要的中間體A、B和C；②丹皮酚（1）與濃鹽酸（HCl）在30%雙氧水（H2O2）的作用下反應(yīng)合成重要中間體D；③在醋酸（AcOH）催化下，中間體A～D分別與各種酰肼和鹽酸肼反應(yīng)合成3/5(3,5)-(二)硝基/氯丹皮酚酰腙類化合物（1～21）和3/5(3,5)-(二)硝基丹皮酚腙類化合物（22～39），所有化合物結(jié)構(gòu)均通過1H NMR、MS和m.p.表征正確。

2.2 殺蟲活性

在1 mg/mL質(zhì)量濃度下，采用小葉碟添加法測定化合物1～21和22～39殺草地貪夜蛾活性，商品化植物源殺蟲劑川楝素為陽性對照。

由表1和表2可見，在丹皮酚C-3、C-5位引入硝基或氯原子，并在其羰基位引入席夫堿（即酰腙和腙），其對應(yīng)衍生物殺蟲活性顯著提高，大多數(shù)衍生物活性均高于母體丹皮酚，相當(dāng)一部分衍生物活性甚至高于川楝素。從結(jié)果看，在1 mg/mL質(zhì)量濃度下，所有供試化合物中5個化合物（12、13、30、32和34）表現(xiàn)出最好的殺蟲活性，最終校正死亡率分別為75.0%、71.4%、71.7%、71.4%和70.4%，其中致死率超過60%的有14個（包括上述5個化合物），相當(dāng)或高于川楝素的達(dá)到26個（包括上述14個化合物）。整體而言，丹皮酚腙類化合物殺蟲活性優(yōu)于丹皮酚酰腙類化合物。從時間角度觀察，與化學(xué)農(nóng)藥如有機(jī)磷、氨基甲酸酯類和擬除蟲菊酯類顯著不同，該類化合物的殺蟲活性均隨著時間的推移呈逐漸上升趨勢，完全符合植物源農(nóng)藥緩效的優(yōu)點(diǎn)。

表1 丹皮酚酰腙類化合物1～21 殺草地貪夜蛾活性測定結(jié)果%

表2 丹皮酚腙類化合物22～39 殺草地貪夜蛾活性測定結(jié)果%

初步構(gòu)效關(guān)系（structure-activity relationship，SAR）分析表明，就酰腙系列化合物1～21而言：①當(dāng)X=NO2，Y=H時，其對應(yīng)化合物殺蟲活性優(yōu)于X=H，Y=NO2和X=NO2，Y=NO2，對應(yīng)化合物最終校正死亡率1（42.9%）大于16（28.6%）大于18（39.3%），5（53.6%）大于17（35.7%）大于19（50.0%）；相比較而言，殺蟲活性均優(yōu)于X=Cl，Y=H，即5（53.6%）大于19（50.0%）大于17（35.7%）大于20（25.0%）。②當(dāng)R1為苯環(huán)時，其苯環(huán)上的取代基在對位時殺蟲活性優(yōu)于鄰位，如8（64.3%）大于7（39.3%），12（75.0%）大于11（35.7%）。③當(dāng)R1為雜環(huán)時，R1=2-thienyl的殺蟲活性優(yōu)于R1=3-Pyridyl和R1=4-Pyridyl，其對應(yīng)化合物和最終校正死亡率分別為13（71.4%）、14（50.0%）和15（39.3%）。④當(dāng)R1為適宜長度碳鏈時，其對應(yīng)的化合物有助于提高殺蟲活性，如2（53.6%）大于1（42.9%）大于3（39.3%），特別是R1為氰亞甲基時，其對應(yīng)化合物4的最終校正死亡率為67.9%。

就腙系列化合物22～39而言：①當(dāng)X=NO2，Y=NO2和X=NO2，Y=H時，其對應(yīng)化合物殺蟲活性優(yōu)于X=H，Y=NO2，對應(yīng)化合物最終校正死亡率36（59.3%）大于22（50.0%）大于38（40.7%），34（70.4%）大于37（63.0%）大于39（48.1%）；②當(dāng)R2=F或NO2時，其對應(yīng)化合物殺蟲活性表現(xiàn)為間位優(yōu)于鄰位和對位，即26（67.9%）大于25（64.3%）大于27（53.6%），34（70.4%）大于33（66.7%）大于35（59.3%）。③R2=Cl和R2=Br進(jìn)一步證明了間位殺蟲活性優(yōu)于鄰位，即30（71.7%）大于29（53.6%）和32（71.4%）大于31（63.0%）。④當(dāng)R2=Me時，其對應(yīng)化合物殺蟲活性表現(xiàn)為間位優(yōu)于對位，即23（61.5%）大于24（50.0%）。

3 結(jié)論

為了發(fā)現(xiàn)具有潛在修飾價值的殺蟲先導(dǎo)化合物，進(jìn)一步開發(fā)基于丹皮酚的綠色殺蟲劑，本文在1 mg/mL質(zhì)量濃度下，采用小葉碟添加法測定了21個3/5(3,5)-(二)硝基/氯丹皮酚酰腙類化合物和18個3/5(3,5)-(二)硝基丹皮酚腙類化合物對三齡前期草地貪夜蛾的毒殺活性。結(jié)果表明，所測共計(jì)39個目標(biāo)化合物中5個化合物（12、13、30、32和34）表現(xiàn)出最好的殺蟲活性，其最終校正死亡率分別為75.0%、71.4%、71.7%、71.4%和70.4%，顯著高于陽性對照川楝素（50.0%）。特別是化合物12，其最終校正死亡率達(dá)到75.0%，表現(xiàn)出顯著的殺蟲活性；60%以上的目標(biāo)化合物殺蟲活性相當(dāng)或高于川楝素。該研究為今后選擇合成高殺蟲活性的3/5(3,5)-(二)硝基/氯丹皮酚酰腙類衍生物和3/5(3,5)-(二)硝基丹皮酚腙類衍生物及其在農(nóng)藥創(chuàng)制方面的研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。