貝萊斯芽胞桿菌菌株P(guān)2-1對草莓褐色葉斑病菌的抑制活性及其促生作用

袁洪波　王卓妮　袁夢佳　覃艮紅　史冰柯　周厚成　侯琿　王麗　涂洪濤

關(guān)鍵詞：草莓褐色葉斑病；貝萊斯芽胞桿菌；拮抗活性；促生作用

中圖分類號：S668.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）01-0126-07

草莓（Fragaria×ananassa Duch.）是一種多年生草本作物，具有較高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟(jì)價值。草莓適應(yīng)能力強(qiáng)，在世界各地均有種植。近年來，隨著現(xiàn)代都市農(nóng)業(yè)的發(fā)展，中國草莓種植面積呈逐年上升趨勢，但植物病害的頻繁發(fā)生也嚴(yán)重制約著草莓產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。草莓褐色葉斑病是新發(fā)現(xiàn)的一種真菌病害，目前在中國、巴西、比利時、美國、伊朗和韓國等地均有報道。該病是由Pilidium con-cavum和P.lythri引起的病害，主要危害草莓葉片和果實(shí)，嚴(yán)重影響草莓的產(chǎn)量和品質(zhì)。發(fā)病初期，葉片的中央出現(xiàn)圓形褐色病斑，隨著病害的加重，病斑逐漸擴(kuò)大形成褐色的同心輪紋癥狀。當(dāng)前，草莓褐色葉斑病的防治研究還較少，常用化學(xué)藥劑對其防效尚不清楚。另外，隨著人們對食品安全問題的重視，以及長期使用化學(xué)農(nóng)藥造成環(huán)境污染等問題的出現(xiàn)，生物防治手段受到越來越多的關(guān)注。

利用拮抗菌防治植物病害是生物防治的重要手段之一。芽胞桿菌具有拮抗效果好、繁殖速度快、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，在植物病害防治方面表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis）是芽胞桿菌中的一個種，在自然界中普遍存在。已有研究表明，貝萊斯芽胞桿菌中的部分菌株具有廣譜拮抗活性，同時還能對作物產(chǎn)生促生的作用，在生產(chǎn)中表現(xiàn)出很好的應(yīng)用潛力。貝萊斯芽胞桿菌菌株P(guān)2-1是從蘋果枝干中分離獲得，對蘋果輪紋病菌（Botryosphaeria dothidea）、蘋果腐爛病菌（Valsa mali）、蘋果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）和梨腐爛病菌（V.pyri）均表現(xiàn)強(qiáng)烈的拮抗活性，并且該內(nèi)生細(xì)菌的使用不影響蘋果的果實(shí)品質(zhì)。

筆者在本研究中分析了貝萊斯芽胞桿菌菌株P(guān)2-1對草莓褐色葉斑病的防治效果，以及對草莓促生作用，為該拮抗菌在草莓病害生物防治中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料

草莓褐色葉斑病菌（P.concavum）菌株CM2-4、貝萊斯芽胞桿菌菌株P(guān)2-1均保存于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所。

1.2方法

1.2.1拮抗活性鑒定 采用平板對峙實(shí)驗(yàn)，測定內(nèi)生細(xì)菌貝萊斯芽胞桿菌菌株P(guān)2-1對草莓褐色葉斑病菌生長抑制效果。在平板中央接種直徑為0.5 cm的草莓褐色葉斑病菌餅，在距中央位置2 cm四周各接種3μL貝萊斯芽胞桿菌菌株P(guān)2-1（OD₆₀₀=0.8）。每次接種3個平皿，3次重復(fù)。對照組不接種內(nèi)生細(xì)菌。于25℃下黑暗培養(yǎng)10 d后，采用十字交叉法測量草莓褐色葉斑病菌菌落直徑，計算抑制率。抑制率（%）=（對照菌落直徑一處理菌落直徑）／（對照菌落直徑）×100。同時，利用超景深三維立體顯微鏡觀察草莓褐色葉斑病菌絲形態(tài)特征，并測量菌絲直徑。

1.2.2菌株P(guān)2-1分泌酶活性分析 蛋白酶活性檢測：在脫脂牛奶培養(yǎng)基中心位置接種3μL（OD₆₀₀=0.8）的P2-1菌株細(xì)胞懸液，25℃培養(yǎng)48 h后觀察消解圈。

纖維素酶活性檢測：在CMC培養(yǎng)基中心位置接種3μL（OD₆₀₀=0.8）的P2-1菌株細(xì)胞懸液，25℃培養(yǎng)48 h后，加入5 mL剛果紅染料染色30 min。倒掉染料，再加入5 mL 1 mol·L^-1NaCl溶液脫色15 min，觀察消解圈。

β-1，3-葡聚糖酶活性檢測：在苯胺藍(lán)培養(yǎng)基中心位置接種3μL（OD₆₀₀=0.8）的P2-1菌株細(xì)胞懸浮液，25℃培養(yǎng)48 h后觀察消解圈。

1.2.3菌株P(guān)2-1對草莓的促生作用 草莓（香野）移栽7d后，將5 mL P2-1細(xì)胞懸浮液（10⁸個·mL^-1）灌根處理草莓，處理30d后調(diào)查植株株高、根長、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量，水處理作為對照。每個處理20棵苗，3次重復(fù)。

1.2.4菌株P(guān)2-1在草莓葉片上定殖動態(tài)研究 參照Yuan等的方法，具體步驟如下：用菌株P(guān)2-1細(xì)胞懸浮液（10⁸個·mL^-1）噴施處理草莓葉片，分別于處理后0（處理后3 h）、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10 d取葉片組織（0.1 g），置于2 mL離心管中，再加入1 mL無菌水，利用研磨儀將其研磨均勻。取上清液梯度稀釋后涂布于NA平板上，28℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計數(shù)，最后將菌落數(shù)量乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，換算成0.1 g葉片中含有的菌落數(shù)量。3次重復(fù)。

1.2.5菌株P(guān)2-1對草莓褐色葉斑病的防治作用 利用離體草莓葉片鑒定菌株P(guān)2-1對草莓褐色葉斑病的防治作用，具體方法如下：選取健康、長勢一致草莓葉片，經(jīng)無菌水清洗干凈后，用75%（φ）乙醇擦拭消毒，再用無菌水清洗，晾干。用菌株P(guān)2-1細(xì)胞懸浮液（108個·mL^-1）噴施處理葉片，接種草莓褐色葉斑病菌餅（直徑為0.5 cm），無菌水處理作為陰性對照（CK），戊唑醇（86μg·mL^-1）（安徽省銀山藥業(yè)有限公司）處理作為陽性對照。處理后用蘸無菌水的脫脂棉纏繞葉柄保濕，置于25℃下光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于Sd和7d后測量病斑直徑，并拍照。每次接種10個斑，3次重復(fù)。發(fā)病率（%）=（總接種點(diǎn)數(shù)-無病癥的接種點(diǎn)數(shù)）／總接種點(diǎn)數(shù)×100。

2結(jié)果與分析

2.1貝萊斯芽胞桿菌菌株P(guān)2-1對草莓褐色葉斑病菌的抑制活性

平板對峙實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，貝萊斯芽胞桿菌菌株P(guān)2-1對草莓褐色葉斑病菌具有強(qiáng)烈的抑菌活性（圖1）。當(dāng)對照組的草莓褐色葉斑病菌落直徑達(dá)到5.11 cm時，對峙實(shí)驗(yàn)中的草莓褐色葉斑病菌僅有1.72 cm。統(tǒng)計結(jié)果顯示，P2-1對草莓褐色葉斑病菌的抑制率達(dá)到66.38%，抑菌帶約為0.76 cm。

進(jìn)一步觀察菌絲形態(tài)特征，發(fā)現(xiàn)野生型草莓褐色葉斑病菌光滑通透，粗細(xì)均勻，而經(jīng)P2-1拮抗處理的菌絲出現(xiàn)斷裂、消解、纖細(xì)、透明等畸形現(xiàn)象（圖2-A～B）。菌絲直徑測量結(jié)果顯示，對照菌絲直徑約為7.71μm，而拮抗處理后菌絲直徑僅為4.12μm（圖2-C）。這些結(jié)果表明，貝萊斯芽胞桿菌菌株P(guān)2-1能顯著影響草莓褐色葉斑病菌菌絲形態(tài)特征。

2.2菌株P(guān)2-1分泌酶活性

菌株P(guān)2-1在脫脂牛奶培養(yǎng)基和CMC培養(yǎng)基中能形成明顯的透明圈，但在苯胺藍(lán)培養(yǎng)基中不能形成明顯的透明圈（圖3），表明菌株P(guān)2-1代謝產(chǎn)物中含有蛋白酶和纖維素酶活性，但不具有β-1，3-葡聚糖酶活性。

2.3菌株P(guān)2-1在草莓葉片上的定殖動態(tài)分析

統(tǒng)計結(jié)果顯示，噴施處理草莓葉片后，菌株P(guān)2-1菌落數(shù)量迅速上升，7d后達(dá)到最大值，菌落數(shù)量為1.15×10¹⁰CFU。隨后，菌落數(shù)量呈下降趨勢，處理10 d后，菌落數(shù)量趨于穩(wěn)定，維持在4.07×10⁸CFU左右（圖4）。

2.4菌株P(guān)2-1對草莓褐色葉斑病的防治作用

為了明確菌株P(guān)2-1對草莓褐色葉斑病的防治效果，利用離體草莓葉片進(jìn)行鑒定。鑒定結(jié)果顯示，與CK處理相比，菌株P(guān)2-1細(xì)胞懸浮液處理能顯著抑制草莓褐色葉斑病的發(fā)病程度（圖5一A）。進(jìn)一步統(tǒng)計結(jié)果顯示，與CK處理相比，菌株P(guān)2-1處理后草莓褐色葉斑病的發(fā)病率和病斑直徑均顯著降低（圖5-B～C）。接種Sd后，菌株P(guān)2-1處理的草莓葉片發(fā)病率約為33.33%，平均病斑直徑為1.63 cm，顯著低于CK處理（圖5-B～C）。與接種Sd相比，接種7d后各種處理的病斑直徑均增加，但菌株P(guān)2-1處理和陽性對照戊唑醇（Te-buconazole）處理仍均顯著低于CK（圖5-C）。以上結(jié)果表明，菌株P(guān)2-1對草莓褐色葉斑病具有較好的防治潛力。

2.5菌株P(guān)2-1對草莓的促生作用

菌株P(guān)2-1細(xì)胞懸浮液能顯著促進(jìn)草莓的生長。統(tǒng)計結(jié)果顯示，與對照草莓相比，經(jīng)菌株P(guān)2-1細(xì)胞懸浮液處理后草莓的株高、根長、濕質(zhì)量和干質(zhì)量均顯著提高（表1），分別提高24.83%、40.74%、28.88%和37.40%。

3討論

草莓褐色葉斑病是近幾年在草莓上出現(xiàn)的一種新的真菌病害，在世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生，嚴(yán)重威脅草莓產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。然而，當(dāng)前有關(guān)草莓褐色葉斑病生物防治的研究還很少，可利用草莓褐色葉斑病生防菌也很有限。貝萊斯芽胞桿菌是一種重要的生防菌資源，對多種植物病原細(xì)菌和真菌都具有較強(qiáng)的抑制活性，并且具有促進(jìn)植物生長的特性，在生產(chǎn)中表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景。仇月等㈣報道了貝萊斯芽胞桿菌菌株SDTB038對草莓枯萎病具有較好的防治效果。姚錦愛等報道了貝萊斯芽胞桿菌株ZZBV-3對草莓根腐病具有較好的防治效果。馮江鵬等發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽胞桿菌菌株JK3對草莓膠孢炭疽菌具有較好的抑制活性。目前，尚無貝萊斯芽胞桿菌防治草莓褐色葉斑病的相關(guān)報道。筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽胞桿菌菌株P(guān)2-1對草莓褐色葉斑病菌具有強(qiáng)烈的拮抗活性，是一種潛在的草莓褐色葉斑病拮抗菌資源，該研究結(jié)果拓寬了拮抗菌株P(guān)2-1潛在的應(yīng)用范圍。

生防菌可通過分泌抗菌化合物發(fā)揮拮抗活性。貝萊斯芽胞桿菌菌株AR1能夠通過次級代謝產(chǎn)物5-N-tyrosinylornithine直接抑制病原真菌的生長。貝萊斯芽胞桿菌菌株HC6能分泌3種具有拮抗活性的脂肽化合物，包括伊枯草菌素A、表面活性素和豐原素。筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)貝萊斯芽胞桿菌菌株P(guān)2-1處理后，草莓褐色葉斑病菌出現(xiàn)斷裂、消解、纖細(xì)、透明等畸形現(xiàn)象。進(jìn)一步結(jié)果顯示，菌株P(guān)2-1可能通過其代謝產(chǎn)物的蛋白酶和纖維素酶活性，降解草莓褐色葉斑病菌細(xì)胞壁，使菌絲表現(xiàn)出畸形現(xiàn)象，從而拮抗菌絲的生長。黃藝爍等同樣發(fā)現(xiàn)，多粘類芽胞桿菌菌株（Paenibacillus polymyxa）ZF197也是通過代謝產(chǎn)物中的蛋白酶和纖維素酶破壞立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）細(xì)胞壁，導(dǎo)致菌絲產(chǎn)生畸形。

生防菌定殖能力與其防治效果及穩(wěn)定性緊密相關(guān)。菌株P(guān)2-1是從蘋果枝干中分離獲得，但它在草莓葉片上同樣表現(xiàn)出很好的定殖能力，處理10 d后菌落數(shù)量仍可維持較高的定殖密度，展示了良好的應(yīng)用潛力。進(jìn)一步的草莓褐色葉斑病防效實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株P(guān)2-1能有效降低草莓褐色葉斑病的發(fā)病率和發(fā)病程度，其防治效果與化學(xué)農(nóng)藥戊唑醇相當(dāng)，表現(xiàn)出潛在的應(yīng)用潛力，為后續(xù)發(fā)開生防菌劑奠定了基礎(chǔ)。

貝萊斯芽胞桿菌不僅具有廣譜的拮抗活性，還具有植株促生作用。Liu等發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽胞桿菌菌株D4通過分泌鐵載體以及溶磷作用促進(jìn)番茄的生長。貝萊斯芽胞桿菌菌株NKG-2同樣能明顯促進(jìn)番茄的生長。本研究得出類似的結(jié)果，即菌株P(guān)2-1能顯著促進(jìn)草莓植株的生長，但其具體促生機(jī)制還有待深入的研究?？傮w而言，貝萊斯芽胞桿菌菌株P(guān)2-1是一株草莓病害生防及促生菌。

4結(jié)論

貝萊斯芽胞桿菌菌株P(guān)2-1對草莓褐色葉斑病菌具有強(qiáng)烈的抑制活性，并對草莓褐色葉斑病菌表現(xiàn)出較好的防治效果，是一種潛在的草莓褐色葉斑病生防菌資源。同時，菌株P(guān)2-1能促進(jìn)草莓植株生長。

致謝：感謝中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所張慧蓉老師和于巧麗老師在公共儀器和試劑使用方面提供的幫助。