基于全基因組信息的常山胡柚遺傳鑒定

毛桑隱　汪麗霞　宋劍鋒　劉勝軍　王淪　徐強(qiáng)

關(guān)鍵詞：常山胡柚；酸橙；基因組分析；分子標(biāo)記；果實(shí)品質(zhì)

中圖分類號(hào)：S666.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980（2023）01-0025-10

常山胡柚（Citrus aurantium'Changshan Hu you）也叫常山柚橙、金柚、衢枳殼，是我國(guó)地方特色柑橘資源，主產(chǎn)區(qū)為浙江省衢州市常山縣。據(jù)資料記載，常山胡柚已有上百年的栽培歷史，最早在常山縣青石鎮(zhèn)底鋪村和澄潭村栽培。目前，青石鎮(zhèn)澄潭村胡家自然村還保存一棵樹齡超過百年的實(shí)生胡柚樹，如今栽培的常山胡柚大多源自這棵常山胡柚“祖宗樹”。常山胡柚現(xiàn)已成為常山縣特色農(nóng)業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)，是當(dāng)?shù)毓r(nóng)的重要收入來源。

有關(guān)常山胡柚的遺傳背景，前人有不少研究。蔣柏宏通過分析胡柚的植物學(xué)性狀，推測(cè)常山胡柚可能是柚和其他柑橘屬的天然雜交種。蔡劍華等通過過氧化物同工酶酶譜法分析，發(fā)現(xiàn)常山胡柚有7條過氧化物同工酶酶譜帶，而柚的5條酶譜帶與常山胡柚其中5條完全一致，多余的2條正好與甜橙相吻合，表明常山胡柚可能是柚和甜橙雜交而來。陳力耕等利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)常山胡柚、椏柑、甜橙、衢橘和柚進(jìn)行分子鑒定，推測(cè)常山胡柚可能是先由柚與椏柑或衢橘自然雜交，再與甜橙自然雜交而得到的天然雜種。陳士超等采用RAPD和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)常山胡柚和常山當(dāng)?shù)馗涕儋Y源進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明常山胡柚可能是由柚、甜橙和其他柑橘屬資源通過多重雜交而來。Xu等通過對(duì)常山胡柚的可能親本材料進(jìn)行ITS序列分析，發(fā)現(xiàn)常山胡柚有2個(gè)不同序列的ITS1，其中ITSIA序列與柚完全一致，ITSIB序列與酸橙完全一致，推測(cè)常山胡柚是由柚與酸橙雜交而來。上述通過不同手段對(duì)常山胡柚的遺傳背景進(jìn)行了研究報(bào)道，然而對(duì)其遺傳上的鑒定卻報(bào)道較少。

隨著現(xiàn)代測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，通過全基因組信息可以全面而準(zhǔn)確地鑒定材料之間的變異。Xu等完成對(duì)二倍體甜橙的測(cè)序組裝，揭示了二倍體甜橙是柚與橘雜交2次產(chǎn)生的雜種后代。Wu等完成對(duì)克里曼丁橘的測(cè)序，揭示了柑橘的馴化史和柑橘起源。前人完成了高質(zhì)量柚、野橘、甜橙以及野生柑橘資源的基因組測(cè)序，為進(jìn)行資源鑒定提供了豐富的基因組信息。

研究基于全基因組重測(cè)序信息，結(jié)合分子標(biāo)記與橘、酸橙、葡萄柚、柚形態(tài)特征和品質(zhì)性狀對(duì)常山胡柚進(jìn)行遺傳鑒定，結(jié)果顯示常山胡柚全基因組具有酸橙遺傳背景，形態(tài)學(xué)特征與酸橙相似，果實(shí)品質(zhì)較酸橙有明顯改良，推測(cè)是一種品質(zhì)改良的酸橙?？蔀檫M(jìn)一步對(duì)常山胡柚的遺傳背景分析和種質(zhì)資源的保護(hù)利用提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

常山胡柚于2020年7月采樣自浙江省衢州市常山縣青石鎮(zhèn)澄潭村。其他供試材料包括典型的柑橘資源與浙江地區(qū)的地方性橘、柚和酸橙等柑橘資源，具體詳見表1。

1.2形態(tài)學(xué)觀測(cè)

比較橘、酸橙、常山胡柚、葡萄柚和柚葉片與果實(shí)形態(tài)學(xué)上的差異。選擇發(fā)育正常樹體的中上部枝條，取完整的成熟葉片進(jìn)行拍照比較，利用游標(biāo)卡尺測(cè)量葉片長(zhǎng)度和寬度，并計(jì)算葉形指數(shù)，記錄翼葉，通過IBM SPSS Statistics 20軟件用于顯著性差異分析。同樣在果實(shí)成熟期選擇完整果實(shí)進(jìn)行拍照，比較不同柑橘類果實(shí)正面與果實(shí)切面。

1.3果實(shí)品質(zhì)測(cè)定

選取橘、酸橙、常山胡柚、葡萄柚和柚的成熟果實(shí)進(jìn)行品質(zhì)測(cè)定，通過游標(biāo)卡尺測(cè)量果實(shí)橫徑、縱徑，并計(jì)算果形指數(shù)；采用電子天平測(cè)定果實(shí)單果質(zhì)量、果皮質(zhì)量、果渣質(zhì)量、種子質(zhì)量等指標(biāo)，并計(jì)算可食率；采用手持糖酸儀測(cè)定可溶性固形物和可滴定酸，計(jì)算果實(shí)固酸比；2，6-二氯酚靛酚試劑測(cè)定抗壞血酸含量。最后通過IBM SPSS Statistics 20軟件用于顯著性差異分析。

1.4全基因組重測(cè)序分析

取常山胡柚新鮮葉片于研缽中使用液氮對(duì)其進(jìn)行充分研磨，將研磨好的凍樣送測(cè)序公司（北京諾禾致源科技股份有限公司）進(jìn)行全基因組重測(cè)序，測(cè)序深度25.7層，共獲得17.5G數(shù)據(jù)量。以甜橙作為參考基因組，通過BWA軟件將重測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到甜橙參考基因組，使用gatk4.0進(jìn)行SNP-calling，最終獲得常山胡柚與橘、酸橙、葡萄柚和柚的SNP數(shù)據(jù)。利用本實(shí)驗(yàn)室前期已獲得的可區(qū)分柑橘幾大基本種的診斷型SNP位點(diǎn)，對(duì)常山胡柚與橘、酸橙、葡萄柚和柚基因組以200kb為窗口、100kb為步長(zhǎng)進(jìn)行滑動(dòng)，將全基因組劃分為3390個(gè)區(qū)域，并對(duì)每一個(gè)窗口內(nèi)的SNP信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析用以判斷每個(gè)窗口的遺傳來源，獲得各自全基因組的遺傳成分圖，并基于群體重測(cè)序鑒定到的高質(zhì)量SNP及甜橙基因組鑒定到的4dTV位點(diǎn)，最終使用131387個(gè)4dTV位點(diǎn)構(gòu)建聚類樹。

1.5 DNA提取及InDel分子標(biāo)記開發(fā)

通過CTAB法對(duì)柑橘葉片進(jìn)行DNA提取。利用SNP-calling后的InDel數(shù)據(jù)尋找橘、柚、常山胡柚、酸橙和葡萄柚基因組差異信息，開發(fā)特異性In-Del分子標(biāo)記，經(jīng)過多對(duì)引物篩選確定了4對(duì)InDel引物可用于驗(yàn)證橘、柚、常山胡柚、酸橙和葡萄柚之間的遺傳差異（由武漢擎科生物公司合成），其InDel變異位點(diǎn)位于2號(hào)染色體和7號(hào)染色體上不同位點(diǎn)，引物序列詳見表2。PCR擴(kuò)增使用高保真酶（Phan-to Max Super-Fidelity DNA Polymerase）進(jìn)行，反應(yīng)體系為20μL，各組分為2×phanta Max Buffer 10μL，Phanta Max 0.4μL，dNTP Mix 0.4μL，F(xiàn)orward prim-er 0.5μL，Reverse primer 0.5μL，DNA原液1μL（150 ng左右），ddH20 7.2μL。在Tl00 Thermal Cy-cler型號(hào)PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃3 min，變性95℃15 s，退火54℃15 s，延伸72℃40 s，35個(gè)循環(huán)，終延伸72℃5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，電泳檢測(cè)條件為恒定電壓120 V、電流400 mA、額定功率100 W，電泳20 min，之后在Universal Hood II儀器中檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

2結(jié)果與分析

2.1葉、果形態(tài)學(xué)分析

通過對(duì)本地早橘、秭歸酸橙、常山胡柚、星路比葡萄柚和四季柚的葉片和果實(shí)進(jìn)行觀察（圖1），不同柑橘資源的葉形差異較大，常山胡柚的葉片形態(tài)與酸橙相近，接近卵圓形或卵形，且翼葉較小，而柚翼葉較大。常山胡柚屬于中小果型，大小與酸橙相似，果皮金黃色，果肉呈淡黃色，果皮厚度與酸橙相近。另從葉形指數(shù)可以看出常山胡柚與秭歸酸橙差異不顯著，而與本地早橘、星路比葡萄柚和四季柚差異顯著（表3）。

2.2不同柑橘資源常規(guī)品質(zhì)分析

選取本地早橘、秭歸酸橙、星路比葡萄柚和琯溪蜜柚等典型柑橘品種與常山胡柚進(jìn)行果實(shí)品質(zhì)分析。由表4可知，不同柑橘種類的內(nèi)外品質(zhì)存在差異，常山胡柚在單果質(zhì)量、果皮厚度、種子質(zhì)量和果皮質(zhì)量等外觀品質(zhì)指標(biāo)上與酸橙無顯著差異，與橘、葡萄柚和柚存在顯著差異。而常山胡柚在可滴定酸和固酸比等內(nèi)在品質(zhì)指標(biāo)上與酸橙存在顯著差異，其可滴定酸平均含量為0.98%，固酸比平均可達(dá)12.30，相較酸橙而言內(nèi)在品質(zhì)有明顯改良。

2.3胡柚全基因組分析

通過分析全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)，利用本實(shí)驗(yàn)室前期開發(fā)的柑橘基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，鑒定橘、常山胡柚、酸橙、葡萄柚和柚的遺傳組成，結(jié)果顯示常山胡柚全基因組超過87.91%的遺傳組分為柚橘雜合，柚純合的遺傳組分占9.77%（圖2）。通過與其他供試柑橘材料的全基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)常山胡柚與酸橙的基因組結(jié)構(gòu)最為相似（圖3），其中與江津酸橙的基因組結(jié)構(gòu)相似度最高，達(dá)到了88.34%。通過常山胡柚與其他柑橘材料進(jìn)行聚類，顯示常山胡柚與酸橙聚類在一起（圖4），綜上表明常山胡柚是一種酸橙。

2.4分子標(biāo)記驗(yàn)證

通過前期分子標(biāo)記的開發(fā)，在全基因組不同變異位點(diǎn)上篩選到4對(duì)InDel引物可用于鑒定橘、柚、常山胡柚、酸橙與葡萄柚之間的遺傳差異。結(jié)果如圖5所示，橘為1條長(zhǎng)帶，柚和葡萄柚為1條短帶，酸橙為柚和橘的2條帶，常山胡柚?jǐn)U增的條帶大小與酸橙條帶相符，為柚和橘的2條帶，與柚和葡萄柚不符，故推測(cè)常山胡柚的親緣關(guān)系與酸橙相近。

3討論

筆者在本研究中基于全基因組重測(cè)序技術(shù)，結(jié)合形態(tài)學(xué)與果實(shí)品質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)常山胡柚全基因組信息表現(xiàn)為酸橙的特征，葉形態(tài)和果實(shí)大小與酸橙相似，分子標(biāo)記也印證與酸橙親緣關(guān)系較近，表明常山胡柚是一種酸橙，且常山胡柚果實(shí)品質(zhì)優(yōu)于普通酸橙，其可滴定酸含量顯著低于酸橙，是一種品質(zhì)得到改良的酸橙，推測(cè)其在栽培過程中逐漸馴化為一種低酸類型的酸橙。

近年來，隨著測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，全基因組序列為進(jìn)一步探索物種進(jìn)化和資源鑒定提供了更為全面的信息。筆者通過分析全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)常山胡柚超過87.91%的遺傳組分為柚橘雜合成分，且常山胡柚的全基因組序列與酸橙的相似度較高，最高可達(dá)88.34%，聚類分析顯示常山胡柚與酸橙聚類在一起，表明常山胡柚是一種酸橙，符合常山胡柚ITSIB序列與酸橙完全一致的報(bào)道。而對(duì)于酸橙的親本，目前普遍認(rèn)為酸橙是柚與寬皮橘的F₁代后代，且柚很可能是母本。該觀點(diǎn)從同工酶、細(xì)胞學(xué)以及分子標(biāo)記等多個(gè)方面得到證實(shí)。相關(guān)研究也驗(yàn)證了酸橙起源的模式，何發(fā)通過SSR分子標(biāo)記驗(yàn)證酸橙起源模式為柚×橘，Wu等從多份柑橘屬資源的全基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析證實(shí)了酸橙的親本為柚和寬皮橘。常山胡柚作為一種酸橙，推測(cè)其親本為柚和橘，與前人報(bào)道常山胡柚的起源過程中柚和寬皮柑橘可能是主要的起源親本相吻合。

分子標(biāo)記技術(shù)自20世紀(jì)80年代開始廣泛應(yīng)用，也常常應(yīng)用于果樹種質(zhì)資源鑒定與遺傳分類。InDel標(biāo)記作為一種新型分子標(biāo)記，適用于分析近緣物種間的基因組上同一位點(diǎn)序列插入和缺失的差異，且InDel標(biāo)記開發(fā)成本較低、準(zhǔn)確性高、多態(tài)性強(qiáng)和檢測(cè)簡(jiǎn)便，因此受到廣泛認(rèn)可和應(yīng)用。本研究對(duì)橘、柚、常山胡柚、酸橙和葡萄柚基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，開發(fā)特異性InDel分子標(biāo)記進(jìn)一步印證常山胡柚的親緣關(guān)系與酸橙相近，而非柚與葡萄柚。此外，在今后的研究中，也有望通過InDel標(biāo)記應(yīng)用于常山胡柚的精準(zhǔn)育種中，為育種實(shí)踐提供理論依據(jù)。

枳殼作為常用的大宗藥材，如湘枳殼、川枳殼、江枳殼等都是傳統(tǒng)中藥材，其次生代謝物常用于藥理研究，大部分地區(qū)標(biāo)準(zhǔn)均收載酸橙及其栽培變種作為枳殼的基原植物，如新疆、云南、香港等。常山胡柚未成熟果實(shí)可直接入藥，自2016年以“衢枳殼”載入《浙江省中藥炮制規(guī)范》后命名為衢枳殼，正式成為一味中藥材，表明常山胡柚為酸橙或酸橙的栽培種，與本研究鑒定常山胡柚是一種酸橙的結(jié)論相符，另本研究也可為常山胡柚用于中藥材開發(fā)與應(yīng)用提供遺傳依據(jù)。

4結(jié)論

通過對(duì)常山胡柚進(jìn)行形態(tài)學(xué)、果實(shí)品質(zhì)、基因組重測(cè)序分析與InDel分子標(biāo)記驗(yàn)證，初步明確常山胡柚為酸橙遺傳背景，推測(cè)是經(jīng)長(zhǎng)期栽培馴化后形成的一種果實(shí)品質(zhì)改良的酸橙。這對(duì)柑橘資源的分類鑒定提供參考，為進(jìn)一步探究常山胡柚的遺傳起源進(jìn)化提供依據(jù)，同時(shí)開發(fā)的InDel標(biāo)記也有望應(yīng)用于柑橘育種材料鑒定，為育種實(shí)踐提供理論依據(jù)。