人乳頭瘤病毒疫苗的概況及重組三價(jià)人乳頭瘤病毒疫苗的研發(fā)

劉玉瑩

北京康樂(lè)衛(wèi)士生物技術(shù)股份有限公司

陳曉

北京康樂(lè)衛(wèi)士生物技術(shù)股份有限公司

伍樹(shù)明

北京康樂(lè)衛(wèi)士生物技術(shù)股份有限公司

銀飛

北京康樂(lè)衛(wèi)士生物技術(shù)股份有限公司

劉永江*

北京康樂(lè)衛(wèi)士生物技術(shù)股份有限公司

人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是女性生殖道及皮膚黏膜常見(jiàn)病原體，其感染比較常見(jiàn)，80%以上女性一生中至少感染過(guò)1 次HPV[1]。一項(xiàng)由世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）主導(dǎo)的研究表明，世界范圍內(nèi)22 個(gè)國(guó)家的1000 例組織學(xué)確認(rèn)的浸潤(rùn)性宮頸癌病例的HPV檢測(cè)結(jié)果顯示，99.7%的宮頸癌呈現(xiàn)HPV-DNA 陽(yáng)性，表明HPV是誘發(fā)宮頸癌的主要因素[2-4]。HPV 感染宿主上皮細(xì)胞后，會(huì)使宿主基因組發(fā)生不穩(wěn)定和不可逆的改變。研究證明，高危型HPV的E6 和E7 分別通過(guò)降解抑癌基因p53和pRb來(lái)誘發(fā)宮頸癌[5-6]。病原生物學(xué)、流行病學(xué)等證據(jù)充分表明，宮頸癌是由高危型HPV的持續(xù)感染引起的[7]。目前已經(jīng)確認(rèn)，HPV 可以引起宮頸癌、陰莖癌、外陰癌、陰道癌、肛門(mén)癌和口咽癌（食管癌）等惡性腫瘤[8-16]。

1 HPV 分型

根據(jù)國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）的報(bào)告，HPV 屬于乳頭瘤病毒科（Papillomaviridae）。乳頭瘤病毒科已知有至少53 個(gè)屬，HPV主要分布在Alphapapillomavirus（共14 個(gè)種，其中13 個(gè)種含HPV）、Betapapillomavirus（共6個(gè)種，其中5個(gè)種含HPV）、Gammapapillomavirus（共27 個(gè)種，均含HPV）、Mupapillomavirus（共3 個(gè)種，均含HPV）和Nupapillomavirus（共1 個(gè)種，含HPV）這5 個(gè)屬中[7]。目前已知的HPV 有200 多個(gè)型別，分屬上述5 個(gè)屬中的40 多個(gè)種。不同型別HPV 的L1基因序列差異大于10%，而同一型別HPV 的序列差異小于2%[17]。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)專(zhuān)題工作組依據(jù)HPV致癌性的不同將其分為三類(lèi)，即高危型、低危型和可疑高危型[18-19]。我國(guó)HPV 檢測(cè)的型別范圍依據(jù)2015年11月26日原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的《人乳頭瘤病毒（HPV）核酸檢測(cè)及基因分型、試劑技術(shù)審查指導(dǎo)原則》明確為：①高危型HPV：包括HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68，共13 種基因型，具有確定的致癌性。高危型HPV 主要屬于HPV 系譜分類(lèi)的α屬內(nèi)的不同種（包括Alphapapillomavirus5、Alphapapillomavirus6、Alphapapillomavirus7、Alphapapillomavirus9），其中HPV16和HPV58屬于Alphapapillomavirus9，HPV18屬于Alphapapillomavirus7。高危型HPV 的感染與宮頸癌及癌前病變的發(fā)生密切相關(guān)，此外還與肛門(mén)癌、陰道癌、口咽癌及癌前病變的發(fā)生密切相關(guān)。②低危型HPV：包括HPV6和HPV11，屬于HPVα屬的Alphapapillomavirus10，無(wú)致癌性。HPV6 和HPV11 的感染與90%以上的尖銳濕疣和低級(jí)別鱗狀上皮增生病變的發(fā)生密切相關(guān)。③可疑高危型HPV：HPV26、53、66、73 和82，共5 種基因型。

2 HPV 的分子流行病學(xué)

宮頸癌是由高危型HPV 的持續(xù)感染引起的。不同的HPV型別在世界各地的流行病學(xué)分布不同。根據(jù)人乳頭瘤病毒資訊中心（HPV Information Centre）發(fā)布的最新調(diào)查報(bào)告，在全球范圍內(nèi)，宮頸癌患者中宮頸細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，前10 位的HPV感染型別為：HPV16（55.2%）、HPV18（14.2%）、HPV45（5.0%）、HPV33（4.2%）、HPV58（3.9%）、HPV31（3.5%）、HPV52（3.5%）、HPV35（1.7%）、HPV39（1.5%）、HPV59（1.4%）[20]。在中國(guó)，宮頸癌患者中宮頸細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，前10 位的HPV感染型別為：HPV16（59.5%）、HPV18（9.6%）、HPV58（8.2%）、HPV52（6.5%）、HPV33（3.5%）、HPV31（2.8%）、HPV59（2.6%）、HPV45（1.9%）、HPV39（1.5%）、HPV56（1.1%）[20]。

2023年，人乳頭瘤病毒資訊中心最新的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，在全球范圍內(nèi)宮頸細(xì)胞學(xué)檢查正常的女性中，HPV 感染率為29.8%。按洲統(tǒng)計(jì)，大洋洲最高，為66.7%；其次是非洲、美洲和歐洲，分別為39.2%、34.5%和27.2%，最低的是亞洲，為20.8%[20]。此外，有報(bào)告指出HPV 感染主要通過(guò)性行為傳播，其感染率高低主要取決于人群的年齡和性行為習(xí)慣。年輕的性活躍女性子宮頸部位HPV 感染率最高，感染高峰年齡在20 歲左右。我國(guó)女性存在第二個(gè)HPV 感染高峰，在40～45 歲[21]。在中國(guó)，宮頸細(xì)胞學(xué)檢查正常的女性中，最常見(jiàn)的5 個(gè)型別是HPV52（2.8%）、HPV16（2.7%）、HPV58（1.7%）、HPV33（1.1%）和HPV18（1.1%）[20]。

3 HPV 疫苗國(guó)內(nèi)上市情況

接種HPV 疫苗是阻斷HPV傳播的最經(jīng)濟(jì)、有效的手段[22-23]。早期動(dòng)物乳頭瘤病毒模型（棉尾兔乳頭瘤病毒）研究表明，以感染性病毒顆?；蛘呷コ《綝NA成分的病毒樣顆粒（virus-like particle，VLP）免疫動(dòng)物后，可以預(yù)防乳頭瘤病毒的感染，為研制HPV 疫苗的可行性提供了證據(jù)[24-26]。在20 世紀(jì)90年代初期，制備了HPV 的VLP，證明了重組HPV 疫苗的技術(shù)可行性[27]。同時(shí)期，眾多研究隊(duì)伍致力于HPV 疫苗的研制，其基本技術(shù)路線(xiàn)的原理均為通過(guò)DNA 重組技術(shù)體外表達(dá)HPV 主要衣殼蛋白L1，利用其自組裝形成VLP 的特性用作免疫原[28]。HPV L1 形成的VLP可以使機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，從而阻止病毒感染，實(shí)現(xiàn)對(duì)宮頸癌等HPV 相關(guān)疾病的有效預(yù)防。目前認(rèn)為，所有HPV 疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)性中和抗體均為L(zhǎng)1 蛋白的構(gòu)象特異性抗體[29]。

2006年，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)正式批準(zhǔn)默沙東公司生產(chǎn)的Gardasil HPV 預(yù)防性疫苗上市。它是由釀酒酵母表達(dá)并純化的HPV6/11/16/18 L1 VLP 四價(jià)宮頸癌預(yù)防性疫苗。該疫苗被批準(zhǔn)用于預(yù)防9～45 歲女性HPV6、11、16、18感染所引起的宮頸癌、陰道癌、外陰癌和肛門(mén)癌及癌前病變和生殖器疣[30]。這是FDA 批準(zhǔn)的世界上第一個(gè)腫瘤疫苗。隨后，英國(guó)葛蘭素史克公司生產(chǎn)的商品名為Cervarix 的HPV 預(yù)防性疫苗也成功上市。它是來(lái)源于昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的HPV16/18 L1 VLP 二價(jià)宮頸癌預(yù)防性疫苗，使用AS04 佐劑（氫氧化鋁復(fù)合單磷酸脂質(zhì)A），每0.5ml 的二價(jià)疫苗中HPV16/18 的L1 蛋白含量為20μg。這些成分吸附于含500μg 氫氧化鋁和50μg 3-O-去?；?4'-單磷酰脂質(zhì)A 的AS04 佐劑系統(tǒng)中。該疫苗被批準(zhǔn)用于9～45 歲女性，預(yù)防HPV16、18 病毒感染引起的宮頸癌、宮頸原位腺癌及癌前病變[31]。2014年，美國(guó)FDA 批準(zhǔn)默沙東公司生產(chǎn)的重組九價(jià)HPV 疫苗Gardasil9（HPV6/11/16/18/31、33/45/52/58 九價(jià)疫苗）上市，從而成為全球第三種已上市HPV 疫苗。在我國(guó)，廈門(mén)大學(xué)聯(lián)合廈門(mén)萬(wàn)泰滄海生物技術(shù)有限公司研發(fā)生產(chǎn)的二價(jià)HPV 疫苗馨可寧（Cecolin）在2019年被批準(zhǔn)上市。2022年，玉溪澤潤(rùn)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的二價(jià)HPV 疫苗沃澤惠也成功上市。3 款進(jìn)口疫苗價(jià)格昂貴且供應(yīng)有限，滿(mǎn)足不了全球疫苗接種的需求。馨可寧每劑售價(jià)約為 Cervarix 的一半，療效卻與 Cervarix 相似。馨可寧和沃澤惠對(duì)于9～14 歲女性可采用2 劑次接種。這2 款國(guó)產(chǎn)疫苗的上市，很好地解決了進(jìn)口疫苗價(jià)格昂貴且供應(yīng)有限的問(wèn)題，但這仍無(wú)法滿(mǎn)足全球日益增長(zhǎng)的疫苗接種需求。表1展示了我國(guó)已上市的5 款疫苗概況。

表1 我國(guó)已上市的5 款疫苗概況

4 重組三價(jià)HPV疫苗的研發(fā)及其創(chuàng)新性

目前全球HPV 疫苗接種率仍不理想，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于世界衛(wèi)生組織2030年“健康人群”的目標(biāo)。因此需要加快疫苗的研發(fā)步伐，以滿(mǎn)足全球疫苗接種的需求。本公司積極響應(yīng)世界衛(wèi)生大會(huì)通過(guò)的《加速消除作為公共衛(wèi)生問(wèn)題的宮頸癌全球戰(zhàn)略》及提出的“90%的女童在15 歲前全程接種HPV 疫苗”目標(biāo)，致力于重組HPV 疫苗的研發(fā)。根據(jù)HPV 流行病學(xué)數(shù)據(jù)，中國(guó)前3 位的HPV致癌型別為：HPV16（59.5%）、H P V 1 8（9.6%）、H P V 5 8（8.2%）[20]。本公司選擇大腸埃希菌原核表達(dá)系統(tǒng)，以16、18、58 型HPV 病毒作為靶向病毒株，開(kāi)發(fā)了重組三價(jià)人乳頭瘤病毒（16/18/58 型）疫苗（大腸桿菌）（以下簡(jiǎn)稱(chēng)重組三價(jià)HPV 疫苗），用于預(yù)防HPV16、18、58 感染和由此導(dǎo)致的宮頸癌等相關(guān)疾病，預(yù)防范圍達(dá)77.3%，比已上市二價(jià)HPV 疫苗預(yù)防范圍增加了8.2%。本產(chǎn)品和已上市的疫苗技術(shù)路線(xiàn)基本相同，由單個(gè)HPV的主要衣殼蛋白L1，自動(dòng)裝配成VLP，其結(jié)構(gòu)和天然HPV 顆粒幾乎沒(méi)有差別，具有良好的免疫效果。用基因工程表達(dá)的L1 蛋白直接裝配出來(lái)的VLP 大小、形態(tài)各異，穩(wěn)定性較差，還需要對(duì)其進(jìn)行純化：先解聚得到五聚體，再重新組裝成VLP。

HPV VLP 疫苗工藝一般包括菌種庫(kù)建立、菌種發(fā)酵、菌體收獲、裂解、澄清純化、層析純化、VLP 組裝、換液、除菌過(guò)濾等步驟。目前，VLP 疫苗純化存在的問(wèn)題主要有兩個(gè)方面：一方面是可溶蛋白少（產(chǎn)量低）、易形成無(wú)規(guī)則的聚集體；另一方面是宿主內(nèi)毒素和DNA 殘留高。因此，我們對(duì)L1基因序列進(jìn)行了優(yōu)化：①?gòu)慕Y(jié)構(gòu)入手，提高表達(dá)量，降低無(wú)規(guī)則聚集和蛋白降解。②從工藝優(yōu)化入手，以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)防止宿主內(nèi)毒素和DNA 被VLP 包裹。研究發(fā)現(xiàn)：HPV L1 N 端參與五聚體間相互作用，但N 端截短不超過(guò)9 個(gè)（含9 個(gè)）氨基酸時(shí)，不影響HPV L1 五聚體形成VLP（T=7）；C 端不超過(guò)30 個(gè)氨基酸的截短亦不影響形成由72個(gè)五聚體組成的VLP（T=7）[32-33]。由于全長(zhǎng)HPV L1 蛋白不能或很難在大腸埃希菌中表達(dá)，采用N端截短的方式，可以提高大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)HPV L1 可溶性蛋白的表達(dá)量。采用C 端截短的方式，可以減少L1 蛋白降解，形成更多的、折疊正確的L1 五聚體蛋白，減少多聚體的形成，使得L1 蛋白在表達(dá)和純化過(guò)程中主要以可溶性五聚體形式存在，進(jìn)一步降低了純化難度，有利于提高純化收率和產(chǎn)量，均一的L1 五聚體也保證了組裝后VLP 的均一度，從而獲得高純度、均一性好的VLP，顯著改善了產(chǎn)品質(zhì)量，有效解決了VLP 純化過(guò)程中純度和收率低的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了VLP 的高效率組裝，為HPV VLP 的研究提供了新的研發(fā)思路。

5 重組三價(jià)HPV 疫苗免疫原性研究

HPV 疫苗能夠誘導(dǎo)特異性中和抗體，保護(hù)機(jī)體免受病毒侵害。因此，疫苗成功的關(guān)鍵是誘導(dǎo)有效的體液免疫，產(chǎn)生具有保護(hù)作用的中和抗體，對(duì)中和抗體的水平和持久性的研究是評(píng)估疫苗保護(hù)效果的重要依據(jù)[34]。

5.1 重組三價(jià)HPV疫苗在小鼠體內(nèi)的免疫原性研究

針對(duì)本公司自制的重組三價(jià)HPV 疫苗開(kāi)展免疫原性研究，以默沙東公司生產(chǎn)的Gardasil疫苗為陽(yáng)性對(duì)照，分別免疫小鼠，檢測(cè)血清中的中和抗體滴度水平，檢測(cè)結(jié)果如圖1 所示。

圖1 重組三價(jià)HPV 疫苗和陽(yáng)性對(duì)照疫苗在小鼠體內(nèi)的中和抗體滴度水平變化曲線(xiàn)

圖1 中,黑色實(shí)線(xiàn)為重組三價(jià)HPV 疫苗免疫后的中和抗體滴度的動(dòng)態(tài)變化，紅色實(shí)線(xiàn)為相同劑量陽(yáng)性對(duì)照疫苗Gardasil免疫后的中和抗體滴度水平變化曲線(xiàn)。圖1 中，中和抗體滴度以L(fǎng)og10表示，誤差棒表示95%置信區(qū)間。

從圖1 可以看出，HPV16 VLP 產(chǎn)生的中和抗體滴度水平與陽(yáng)性對(duì)照疫苗基本一致；HPV18 VLP 產(chǎn)生的中和抗體滴度水平略高于陽(yáng)性對(duì)照疫苗；HPV58 VLP 產(chǎn)生的中和抗體在較高滴度水平。

5.2 重組三價(jià)HPV 疫苗在大鼠體內(nèi)的免疫原性研究

針對(duì)本公司自制的重組三價(jià)HPV 疫苗開(kāi)展免疫原性研究，以默沙東公司生產(chǎn)的Gardasil 疫苗為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定了重組三價(jià)HPV 疫苗在大鼠中的免疫原性，并觀察了其免疫持久性（21 周），檢測(cè)結(jié)果如圖2 所示。

圖2 Wistar 大鼠免疫后HPV 特異性體液免疫應(yīng)答

圖2 中，黑色實(shí)線(xiàn)表示重組三價(jià)HPV 疫苗免疫大鼠后測(cè)定的結(jié)合/中和抗體滴度平均值；紅色實(shí)線(xiàn)表示為陽(yáng)性對(duì)照疫苗Gardasil 免疫大鼠后測(cè)定的結(jié)合/中和抗體滴度平均值。圖2 中，結(jié)合/中和抗體滴度以L(fǎng)og10表示，誤差棒表示95%置信區(qū)間。

從圖2A、圖2C 可以看出，HPV16、18 VLP產(chǎn)生的結(jié)合抗體滴度水平與陽(yáng)性對(duì)照疫苗基本一致；從圖2E 可以看出，HPV58 VLP 產(chǎn)生的結(jié)合抗體滴度水平較高。從圖2B、圖2D、圖2F 可以看出，HPV16 VLP 產(chǎn)生的中和抗體滴度水平與陽(yáng)性對(duì)照疫苗基本一致，HPV18 VLP 產(chǎn)生的中和抗體滴度水平略高于陽(yáng)性對(duì)照疫苗，同時(shí)HPV58 VLP 產(chǎn)生了較高的中和抗體滴度。

圖1 和圖2 的結(jié)果表明，重組三價(jià)HPV 疫苗可使小鼠和大鼠產(chǎn)生高滴度、持久性強(qiáng)的特異性中和抗體，且免疫效果與已上市疫苗相當(dāng)。未來(lái)，該疫苗有望成為進(jìn)口疫苗的有力競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手。

6 總結(jié)與展望

HPV 感染引起的疾病一直是人類(lèi)關(guān)注的焦點(diǎn)。世界衛(wèi)生組織于2020年11月17日 發(fā)布《加速消除宮頸癌全球戰(zhàn)略》（Launch of the Global Strategy to Accelerate the Elimination of Cervical Cancer），全球194 個(gè)國(guó)家承諾共同消除宮頸癌，以期到2030年，HPV 疫苗接種覆蓋率達(dá)90%、篩查覆蓋率達(dá)70%以及宮頸癌前病變和宮頸癌治療可及性達(dá)90%。HPV 疫苗在預(yù)防宮頸癌方面發(fā)揮著非常重要的作用。在過(guò)去20年中，HPV 疫苗研究快速發(fā)展，二價(jià)、四價(jià)和九價(jià)疫苗均已獲得上市許可，有效預(yù)防了全球HPV 感染。康樂(lè)衛(wèi)士采用原核表達(dá)系統(tǒng)研發(fā)了多款HPV 疫苗，包括重組三價(jià)HPV疫苗，重組九價(jià)HPV 疫苗，以及覆蓋全部高危型別的重組十五價(jià)HPV 疫苗。這些HPV 疫苗通過(guò)基因工程設(shè)計(jì)、生產(chǎn)工藝優(yōu)化等方式提高了產(chǎn)量，從而大大降低生產(chǎn)成本，未來(lái)將在預(yù)防HPV感染方面發(fā)揮重要作用。相信在全體科研人員的努力下，人類(lèi)將不再受HPV 感染的困擾。