基于VEGF-VEGFR通路探究Avastin對(duì)DR模型大鼠干預(yù)效果

莊憲麗 張瑩 楊家干 楊延振

(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬滕州市中心人民醫(yī)院眼科，山東 滕州 277500)

糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，是否會(huì)發(fā)生糖尿病視網(wǎng)膜病變?nèi)Q于患者血壓、血糖、血脂的控制情況及患病時(shí)間的長(zhǎng)短〔1,2〕?；加刑悄虿∫暰W(wǎng)膜病變的患者會(huì)出現(xiàn)失明、視物模糊及視力下降等臨床表現(xiàn)，糖尿病視網(wǎng)膜病變常見的眼部表現(xiàn)為視網(wǎng)膜微動(dòng)脈形成及點(diǎn)狀出血，如果出現(xiàn)玻璃體積血、黃斑水腫就會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的視力下降〔3〕?；颊呖梢酝ㄟ^控制血壓、血糖等減輕糖尿病視網(wǎng)膜病變進(jìn)程，通過聯(lián)合玻璃體腔藥物注射的方法來減輕黃斑水腫，改善視力。貝伐單抗(Avastin)可通過抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及受體(VEGF-VEGFR)的表達(dá)，進(jìn)而改善視力〔4〕。目前關(guān)于Avastin用于糖尿病視網(wǎng)膜病變模型大鼠缺乏相關(guān)資料數(shù)據(jù)。本研究基于VEGF-VEGFR通路探究Avastin對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變模型大鼠的干預(yù)效果。

1 材料與方法

1.1研究動(dòng)物 選取75只SPF級(jí)大鼠，由冠科生物技術(shù)(中山)有限公司提供〔動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(粵)2020-0240〕，鼠齡3～6個(gè)月，平均(4.27±1.43)個(gè)月，體重227～268 g，平均體質(zhì)量(235.12±19.48)g，將大鼠放置室溫23～25℃，濕度40%～70%，自然光照、通風(fēng)的無病原菌干凈籠子中飼養(yǎng)，飲用的水和食物均經(jīng)消毒。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。主要試劑：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購于上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司；VEGF抗體購于江西江藍(lán)純生物試劑有限公司；VEGFR-2抗體購于廈門侖昌碩生物科技有限公司；β-actin抗體購于上海梵態(tài)生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1建模 在75只大鼠中隨機(jī)選取15只為正常組不做任何處理，其余大鼠隨機(jī)分為模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組各15只，參照陳向東等〔5〕研究實(shí)驗(yàn)中糖尿病視網(wǎng)膜病變建立方法建立糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠模型，除正常組外，其余各組大鼠均按照30 mg/kg腹腔內(nèi)注射枸櫞酸鈉緩沖液誘發(fā)大鼠糖尿病視網(wǎng)膜病變，每周1次，持續(xù)2 w，累計(jì)劑量達(dá)到60 mg/kg，正常組給予同法注射等體積生理鹽水。建模成功標(biāo)準(zhǔn)：大鼠視力下降，出現(xiàn)視物模糊癥狀。

1.2.2給藥 低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠分別給予Avastin(齊魯制藥有限公司；國藥準(zhǔn)字H20020535；6.25 mg/ml)灌胃6 w，劑量分別為0.09、1.00、1.25 mg，正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃。

1.2.3病理組織學(xué)觀察 在大鼠灌胃后、禁食不禁水12 h，麻醉處死，迅速摘除眼球后立即固定在染色液中，將所制備的大鼠眼球組織樣本在甲醛溶液中固定24 h后，行常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，制備厚度為3 μm的組織切片，取眼球組織石蠟包埋切片,經(jīng)蘇木素-伊紅(HE)染色,中性樹膠封片后,顯微鏡下觀察并拍照分析。

1.2.4脂聯(lián)素(ADPN)、瘦素(LP)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1水平評(píng)價(jià) 抽取各組大鼠的空腹靜脈血2 ml，離心半徑5 cm平均32 s轉(zhuǎn)速 3 000 r/min進(jìn)行離心處理3 min，分離上層血清，在-4℃的環(huán)境下保存?zhèn)溆?，采用ELISA檢測(cè)ADPN、LP、SOD、MDA、ICAM-1水平，實(shí)驗(yàn)步驟：設(shè)置10個(gè)標(biāo)準(zhǔn)孔并準(zhǔn)備相應(yīng)水平標(biāo)準(zhǔn)品，設(shè)置1個(gè)空白孔及若干待測(cè)樣品在10 μl 待測(cè)樣品中加入40 μl樣本稀釋液,封板膜封板,置于37℃水浴箱溫育30 min，清洗反應(yīng)板5次,每次間隔30 s，拍干，在除空白孔以外的各孔中加入酶標(biāo)液50 μl，封膜溫育30 min，清洗反應(yīng)板5次，每次間隔30 s，拍干，在各孔中加入顯色A液、B液各50 μl，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光環(huán)境下顯色15 min，在反應(yīng)孔內(nèi)加入終止液50 μl/孔以終止反應(yīng)，450 nm波長(zhǎng)測(cè)量每孔吸光度，檢測(cè)出ADPN、LP、SOD、MDA、ICAM-1的水平。

1.2.5循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞(CEC)、血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)檢測(cè) 采用流式細(xì)胞法檢測(cè)CEC、EPC；抽取清晨空腹靜脈血20 μl，進(jìn)行抗凝處理后分為兩管，其中一管加20 μl CEC單克隆抗體，另一管加入20 μl EPC單克隆抗體，在室溫環(huán)境下孵育30 min后將融血?jiǎng)┘尤胫粮鞴苤?，待完全溶血后行離心處理，3 000 r/min離心5 min，將上清液棄除后，使用洗滌液洗滌，之后將150 μl固定劑加入至各管中，使用0.6 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)混合均勻制備為懸液，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105～1×106/ml，完成之后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)(美國BectonDickinso公司)CEC、EPC水平，并計(jì)算CEC、EPC比值。

1.2.6VEGF-VEGFR信號(hào)通路蛋白表達(dá)量評(píng)價(jià) 采用Western印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)步驟：將視網(wǎng)膜組織接種于6孔板中，24 h貼壁后各組進(jìn)行處理，并使用BCA法測(cè)定濃度，制備電泳樣品，上樣量50 μg進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，加入脫脂奶粉封閉1 h，一抗(1∶1 000)4℃ 孵育過夜，洗膜5 min/次，共3次，二抗(1∶4 000)室溫孵育1 h，洗膜5 min/次，共3次，取重疊值。采用軟件分析蛋白條帶灰度值，內(nèi)參蛋白為GAPDH。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組病理組織學(xué)觀察 如圖1所示，正常組大鼠內(nèi)外叢狀層呈網(wǎng)狀排列，未有毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血情況；模型組大鼠出現(xiàn)水腫，且結(jié)構(gòu)疏松，內(nèi)外顆粒層細(xì)胞排列紊亂無序，出現(xiàn)充血及擴(kuò)張的毛細(xì)血管；藥物干預(yù)后，低劑量組、中劑量組大鼠內(nèi)外叢狀層腫脹減輕，排列相對(duì)規(guī)整；高劑量組大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)基本完整，未見明顯水腫，內(nèi)外顆粒層細(xì)胞排列相對(duì)規(guī)整，各層未見明顯擴(kuò)張及充血的毛細(xì)血管，內(nèi)叢狀層及外叢狀層腫脹情況減輕，未見新生血管。

2.2各組ADPN、LP、ICAM-1比較 如表1所示，高劑量組、中劑量組、低劑量組、模型組ADPN水平均低于正常組，LP、ICAM-1水平均高于正常組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；高劑量組、中劑量組、低劑量組ADPN水平高于模型組，LP、ICAM-1水平低于模型組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；高劑量組、中劑量組ADPN水平高于低劑量組，LP、ICAM-1水平低于低劑量組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；高劑量組ADPN水平高于中劑量組，LP、ICAM-1水平低于中劑量組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

2.3各組CEC、EPC比較 如表1所示，高劑量組、中劑量組、低劑量組、模型組CEC水平均高于正常組，EPC水平均低于正常組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；高劑量組、中劑量組、低劑量組CEC水平低于模型組，EPC水平高于模型組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；高劑量組、中劑量組CEC水平低于低劑量組，EPC水平高于低劑量組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；高劑量組CEC水平低于中劑量組，EPC水平高于中劑量組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

圖1 各組眼球組織病理組織學(xué)觀察(HE染色，×400)

表1 各組ADPN、LP、ICAM-1、CEC、EPC比較

2.4各組VEGF-VEGFR通路蛋白表達(dá)量比較 高劑量組、中劑量組、低劑量組、模型組VEGF、VEGFR-2、β-actin水平均高于正常組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；高劑量組、中劑量組、低劑量組VEGF、VEGFR-2、β-actin水平低于模型組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；高劑量組、中劑量組VEGF、VEGFR-2、β-actin水平低于低劑量組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；高劑量組VEGF、VEGFR-2、β-actin水平低于中劑量組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見圖2、表2。

2.5各組SOD、MDA比較 如表2所示，高劑量組、中劑量組、低劑量組、模型組SOD水平均低于正常組，MDA水平均低高于正常組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；高劑量組、中劑量組、低劑量組SOD水平高于模型組，MDA水平低于模型組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；高劑量組、中劑量組SOD水平高于低劑量組，MDA水平低于低劑量組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；高劑量組SOD水平高于中劑量組，MDA水平低于中劑量組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

圖2 各組VEGF-VEGFR通路蛋白Western印跡

表2 各組SOD、MDA水平及VEGF-VEGFR通路蛋白表達(dá)量比較

3 討 論

糖尿病視網(wǎng)膜病變屬于眼科疾病及內(nèi)分泌疾病的一種，是糖尿病常見并發(fā)癥，是神經(jīng)病變及糖尿病微血管病變?cè)谝暰W(wǎng)膜中的表現(xiàn)，是致盲的主要原因之一〔6〕。糖尿病病程越長(zhǎng)誘發(fā)此病的概率就越大，此病的病理改變?yōu)橹芗?xì)胞對(duì)視，導(dǎo)致微動(dòng)脈瘤形成及血視網(wǎng)膜屏障破壞，從而造成的毛細(xì)血管及小動(dòng)脈閉塞〔7〕。糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)缙诘母深A(yù)措施為視網(wǎng)膜激光光凝，一般合并視網(wǎng)膜脫落及玻璃體積血的患者需要進(jìn)行玻璃體視網(wǎng)膜手術(shù)進(jìn)行治療，平時(shí)一定要注意血壓及血糖的控制，從而減緩糖尿病視網(wǎng)膜病變的進(jìn)程〔8,9〕。糖尿病視網(wǎng)膜病變患者若未得到及時(shí)治療或治療不佳時(shí)，會(huì)導(dǎo)致病情惡化，從而導(dǎo)致視力受損。

Avastin屬于抗VEGF藥物，可以對(duì)新生血管起到很好的抑制作用，可有利于降低血管滲透、黃斑水腫等，此外，有劉巖等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)，使用Avastin后患者癥狀明顯出現(xiàn)好轉(zhuǎn)且視力明顯上升，進(jìn)一步的證實(shí)了注射Avastin的有效性及安全性，與本文研究結(jié)果一致。采取Avastin治療可以在一定的程度上降低眼底疾病的眼壓，加快視力恢復(fù)，有效降低黃斑水腫等并發(fā)癥的發(fā)生率〔11〕。本研究結(jié)果顯示，高劑量Avastin可更好的減少并發(fā)癥的出現(xiàn)，促進(jìn)視力恢復(fù)，改善糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠視力水平。

研究顯示〔12〕，ADPN、LP、ICAM-1與糖尿病視網(wǎng)膜病變存在密切關(guān)聯(lián)，且在糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生、發(fā)展過程中可伴隨疾病的進(jìn)展過程改變視力變化。其中ADPN屬于脂肪組織，可以存儲(chǔ)脂肪，又有著分泌作用，是胰島素作用的重要靶器官之一，可以參與脂類及糖類的代謝，是胰島素免疫、敏感性、炎癥等過程的重要調(diào)節(jié)因子之一，同時(shí)也是一種特異性血漿蛋白，由脂肪組織分泌，參與糖類代謝具有降血糖的作用。LP可以作為肥胖基因在脂肪的細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)物中參與能量消耗及代謝，同時(shí)還可以參與新生血管的生成〔13～15〕。ICAM-1可導(dǎo)致細(xì)胞毒性物質(zhì)及大量細(xì)胞因子的急劇釋放，由此可說明ICAM-1可以導(dǎo)致微血管損傷的加劇，內(nèi)皮修復(fù)功能受到抑制，從而造成大量的新生血管的形成，加重糖尿病視網(wǎng)膜病變〔16～18〕。CEC、EPC、SOD、MDA可作為診斷糖尿病視網(wǎng)膜病變的客觀有效指標(biāo)，可參與糖尿病視網(wǎng)膜病變等病理過程的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸〔19〕，提示LP、ADPN及LP、ADPN對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變新生血管具有重要的促進(jìn)作用，CEC、EPC、SOD、MDA可作為診斷糖尿病視網(wǎng)膜病變的客觀有效指標(biāo)，以上指標(biāo)的變化有利于判斷糖尿病視網(wǎng)膜病變的嚴(yán)重程度。

VEGF-VEGFR通路是經(jīng)典信號(hào)通路之一，其中VEGF、VEGFR-2、β-actin是VEGF-VEGFR通路中的蛋白因子，此信號(hào)通路被證實(shí)在多種疾病中存在表達(dá)失調(diào)現(xiàn)象，且是一條重要的調(diào)節(jié)通路〔20〕。除此之外還可以作為內(nèi)皮細(xì)胞的特異性絲裂原，同時(shí)也是已知最強(qiáng)的血管通透劑，可以提高血管的通透性，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移與增殖〔21〕。故在本研究中，高劑量Avastin可能通過抑制VEGF-VEGFR信號(hào)通路，下調(diào)VEGF、VEGFR-2、β-actin表達(dá)，緩解糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)展，有較好的治療價(jià)值。

綜上，Avastin可通過調(diào)控VEGF-VEGFR信號(hào)通路中相關(guān)重要信號(hào)傳導(dǎo)分子的基因表達(dá)，改善糖尿病視網(wǎng)膜病變模型大鼠視力水平。