苗藥吉祥草含藥血清對氣道平滑肌細(xì)胞增殖及IL-1β/COX-2信號通路的作用機(jī)制

劉煒 李江 李同瑤 謝友良

(1貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550002；2貴州中醫(yī)藥大學(xué))

炎癥因子、氧化應(yīng)激和多條信號通路等因素均會引發(fā)慢性阻塞性肺關(guān)病(COPD)〔1～3〕氣道的黏液高分泌，其中白細(xì)胞介素(IL)-1β/環(huán)氧合酶(COX)-2信號通路是參加氣道黏液高分泌信號通路之一，但目前對此通路的研究還較少〔4〕。IL-1β和COX-2介導(dǎo)多種炎癥反應(yīng)，讓腺體的分泌物大量增加，進(jìn)而導(dǎo)致氣道黏液長時間處于高分泌狀態(tài)〔5〕。IL-1β是最早參與炎癥反應(yīng)的炎癥因子，當(dāng)其被多種因素激活時會增加IL-1β活性，導(dǎo)致過多的分泌炎癥因子，促進(jìn)COX-2的表達(dá)，COX-2高表達(dá)會增加前列腺素類產(chǎn)物的合成，增加血管通透性和支氣管黏膜的水腫程度，大量腺體的分泌，過多的滲出物會阻塞氣道增加氣流阻塞，從而導(dǎo)致氣道黏液髙分泌〔6，7〕。吉祥草又叫觀音草，是多年生草本植物中的一種，在中國和日本廣泛生長，喜好山坡、山谷和密林下，一年四季均可采收，藥記載顯示苗藥吉祥草一般可新鮮使用或曬干使用〔8〕。藥物研究發(fā)現(xiàn)吉祥草對止咳、平喘、祛風(fēng)、鎮(zhèn)痛等有一定的功效，在苗族當(dāng)?shù)爻１挥糜谥委熆人?、支氣管炎等?〕。研究發(fā)現(xiàn)吉祥草對COPD氣道黏液高分泌可進(jìn)行很好的治療，對患者痰液的分泌量能明顯減少〔10〕，但其對氣道平滑肌細(xì)胞(ASMCs)的影響尚不明確，本文對ASMCs給予苗藥吉祥草血清干預(yù)，觀察其對細(xì)胞的增殖及IL-1β/COX-2信號通路的影響。

1 材料和方法

1.1實驗動物 20只SD大鼠，清潔級，體質(zhì)量220～250 g，合格證號：SCXK(貴)2015-0005，購自上海福萊生物科技有限公司；成年6～8周齡BALB/c小鼠(雌性)，購自遵義醫(yī)學(xué)院，合格證號：SCXK(黔)2018-0002。在安靜、適當(dāng)室溫、避光的環(huán)境下自由攝食飲水。動物實驗經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)進(jìn)行，實驗動物符合倫理委員會規(guī)定，倫理委員會編號：hyykll2017038。

1.2試劑與儀器 貴州中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院住院中藥房生產(chǎn)的苗藥吉祥草(臨床常用劑量30 g，用水煎服成300 ml)；美國Proteintech公司生產(chǎn)的IL-1β抗體和COX-2抗體；杭州碧云天生物技術(shù)研究所生產(chǎn)的BCA蛋白濃度測定試劑盒；Elabscience公司生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒；日本Olympus公司生產(chǎn)的IX71型相差顯微鏡；湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司生產(chǎn)的L400離心機(jī)；日本Nikon公司生產(chǎn)的DXM1200C型數(shù)碼相機(jī)。

1.3含藥血清的制備 將20只SD大鼠分為空白組和藥物組，每組10只?？瞻捉M每次給予1 ml生理鹽水灌胃，3次d；藥物組給予苗藥吉祥草灌胃，給藥劑量按照動物實驗與人體標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量計算公式計算，連續(xù)用藥7 d；給藥后均禁食8 h，第8天末次給藥1 h后腹腔注射10%水合氯醛麻醉各組大鼠，取腹主動脈血于離心管中，3 000 r/min離心15 min，0.22 μm微孔濾膜過濾，分裝于離心管中，56℃水浴30 min滅活補(bǔ)體，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4ASMCs的分離、培養(yǎng)和鑒定 ASMCs的培養(yǎng)采用組織塊貼壁法。處死BALB/c小鼠，將小鼠的氣管和支氣管分離，用Hank平衡鹽溶液浸泡氣管和支氣管。將氣管的外膜分離干凈，刮除內(nèi)皮，將其剪成1 mm3小塊后置于牛血清中，將青霉素和鏈霉素均加入到培養(yǎng)基中。當(dāng)組織塊周圍的細(xì)胞生長融合至80%時，對ASMCs進(jìn)行鑒定。傳代ASMCs后，取4～6代細(xì)胞用于實驗。

1.5細(xì)胞培養(yǎng)和分組 取第四代對數(shù)生長的ASMCs，胰酶消化細(xì)胞后接種于培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)板置于常規(guī)培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度為70%～80%時，更換新的培養(yǎng)基再培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為空白組：正常細(xì)胞在150 μl 10%大鼠空白血清培養(yǎng)基+13.5 ml無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)；高劑量組：正常細(xì)胞在含150 μl 10%大鼠苗藥吉祥草含藥血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)；中劑量組：正常細(xì)胞在含75 μl 5%大鼠苗藥吉祥草含藥血清+75 μl 5%大鼠空白血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)；低劑量組：正常細(xì)胞在含75 μl 2.5%大鼠苗藥吉祥草含藥血清+75 μl 7.5%大鼠空白血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.6CCK-8檢測ASMCs增殖 將AMSCs細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，滴加細(xì)胞懸液后加入每組相應(yīng)的藥物。將孔板置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：5% CO2、37℃，將細(xì)胞分別孵育24 h、48 h和72 h。在96孔板的空版內(nèi)加入CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞4 h。測定每孔在450 nm處的OD值。

1.7流式細(xì)胞儀檢測ASMCs凋亡 稀釋結(jié)合緩沖液為1×結(jié)合緩沖液，配制膜聯(lián)蛋白(Annexin)V/碘化丙啶(PI)染色工作液。將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基棄掉，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌培養(yǎng)板中細(xì)胞，棄掉PBS中胰酶消化細(xì)胞并孵育，顯微鏡下觀察細(xì)胞，當(dāng)出現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間不相互鏈接時，將胰酶棄掉，PBS吹打細(xì)胞制成懸液，置于流式管中，離心后棄上清液，用Annexin V/PI 染色工作液重懸細(xì)胞，吹打細(xì)胞后孵育，15 min后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞。

1.8ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β和COX-2含量 操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.9Western印跡檢測細(xì)胞中IL-1β和COX-2蛋白表達(dá) 取3組細(xì)胞加入細(xì)胞蛋白裂解液0.5 ml均漿，在4℃環(huán)境下離心15 min，取上清液測量蛋白濃度；將蛋白煮沸5 min至變性，經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，在5%脫脂奶粉PBST溶液室溫下封閉1 h，加入IL-1β、COX-2和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體；抗體在4℃的環(huán)境中孵育過夜，洗膜后加入二抗，在37℃的環(huán)境中孵育1 h，暗室發(fā)光。

1.10統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1ASMCs的鑒定 從BALB/c小鼠中分離并培養(yǎng)的AMSCs細(xì)胞具有典型的“峰谷”生長狀態(tài)。染色后發(fā)現(xiàn)AMSCs大部分呈陽性，可見所分離出的細(xì)胞即為ASMCs。見圖1。

2.2各組ASMCs增殖比較 和空白組相比，低劑量組、中劑量組和高劑量組細(xì)胞在48和72 h時ASMCs細(xì)胞增殖明顯降低，且呈逐漸遞減趨勢，低劑量組細(xì)胞增殖率及中劑量組細(xì)胞增殖率明顯低于高劑量組細(xì)胞增殖率(均P<0.05)。見表1。

2.3各組ASMCs凋亡比較 和空白組相比，低劑量組、中劑量組和高劑量組ASMCs凋亡率顯著增加，呈逐漸遞增趨勢，其中高劑量組ASMCs凋亡率顯著高于低劑量組及中劑量組(P<0.05)。見表1、圖2。

表1 各組細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β和COX-2含量比較

圖2 流式細(xì)胞儀檢測ASMCs凋亡

2.4各組細(xì)胞上清液中IL-1β和COX-2含量及細(xì)胞中IL-1β和COX-2蛋白表達(dá) 和空白組相比，低、中、高劑量組細(xì)胞上清液中IL-1β和COX-2含量及ASMCs中IL-1β和COX-2蛋白表達(dá)明顯降低，且呈逐漸遞減趨勢，高劑量組細(xì)胞上清液中IL-1β和COX-2含量及ASMCs中IL-1β和COX-2蛋白表明顯低于低劑量組及中劑量組(P<0.05)。見表1、表2、圖3。

表2 各組細(xì)胞中IL-1β和COX-2蛋白表達(dá)比較

圖3 各組ASMCs中IL-1β和COX-2蛋白表達(dá)

3 討 論

中醫(yī)認(rèn)為COPD屬于“咳嗽”等范圍，主要發(fā)病原因是肺、腎虛所致，主要病理特征為咳痰渾濁、有淤血等〔11〕；西醫(yī)認(rèn)為COPD主要是由持續(xù)性的氣流受限所致，多種因素均可導(dǎo)致COPD的發(fā)生，其中IL-1β/COX-2信號通路在近些年研究較廣。促炎因子IL-1β是早期炎癥反應(yīng)中重要的炎癥介質(zhì)之一，可向氣道聚集炎癥細(xì)胞，且在炎癥細(xì)胞活化中占主導(dǎo)作用，在體內(nèi)可和多種炎癥因子相互作用，加重COPD炎癥反應(yīng)，進(jìn)而加重肺組織和氣道結(jié)構(gòu)的病理損傷〔12〕。IL-1β的分泌由炎癥刺激所產(chǎn)生，進(jìn)而增加COX-2的活性，支氣管黏膜發(fā)生嚴(yán)重水腫，讓腺體的分泌大量增多，進(jìn)而發(fā)生氣道堵塞〔13〕。當(dāng)AMSCs表型轉(zhuǎn)化出現(xiàn)異常時，氣道的炎癥反應(yīng)和高反應(yīng)性也隨之增加，對氣道的重塑造成嚴(yán)重的影響。AMSCs的增殖、上皮細(xì)胞纖維化及血管生成等均是氣道重塑主要的組織學(xué)特征，其中細(xì)胞的增殖尤為重要。當(dāng)機(jī)體受到慢性炎癥刺激時會增殖AMSCs的數(shù)量，細(xì)胞外基質(zhì)中膠原組織沉積、肌膜增厚，進(jìn)而導(dǎo)致氣道結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆的改變〔14〕。目前我省對苗藥的研究較少，特別是苗藥的炮制研究和技術(shù)滯后對苗藥的發(fā)展造成了嚴(yán)重的影響〔15，16〕。

本研究發(fā)現(xiàn)，苗藥吉祥草血清對ASMCs的增殖有明顯的抑制作用。目前吉祥草在藥理作用方面的研究較少，現(xiàn)有研究報道主要集中在抗腫瘤作用上，其已被證實具有抗腫瘤、止咳、化痰、抗炎等作用。楊建瓊等〔17〕人建立體外抗腫瘤實驗?zāi)Ｐ?，以人肺癌A549細(xì)胞為對象，研究吉祥草提取物，發(fā)現(xiàn)吉祥草萃取物能抑制A549細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，顯示吉祥草具有抗腫瘤活性。

IL-1β是一種重要的炎癥介質(zhì)，有多種細(xì)胞因子分泌，例如上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等〔18〕。在機(jī)體遭受到感染、損害、生理應(yīng)激等時，多種細(xì)胞均會大量分泌IL-1β，其廣泛的生物活性會對多種炎癥和趨化因子進(jìn)行誘導(dǎo)。研究發(fā)現(xiàn)在COPD氣道炎癥中IL-1β時重要的細(xì)胞因子，肺部慢性炎癥的發(fā)生會隨著IL-1β的增加而增加。COX-2是COX中一種誘導(dǎo)酶，在細(xì)胞受到各種因素刺激時迅速合成。多種物理因素及致病因素會導(dǎo)致氣道內(nèi)炎癥反應(yīng)增加，增加的炎癥細(xì)胞會促進(jìn)COX-2的分泌。當(dāng)IL-1β與某些受體結(jié)合后引起COX-2活性增強(qiáng)，進(jìn)而影響氣道的通氣功能。本研究發(fā)現(xiàn)，苗藥吉祥草血清可降低ASMCs IL-1β和COX-2表達(dá)，進(jìn)而降低肺部炎癥，改善COPD。駱彩虹等〔19〕通過對COPD患者研究發(fā)現(xiàn)，患者在治療后血清中IL-1β，COX-2和PGE2含量明顯降低，苗藥吉祥草可有效抑制血清中IL-1β，COX-2和PGE2水平。陳劍波等〔20〕研究發(fā)現(xiàn)，制備小鼠COPD模型后，吉祥草對COPD小鼠的癥狀有明顯的改善，其可能通過對炎癥因子表達(dá)進(jìn)行抑制，進(jìn)而對COPD肺臟病理損害進(jìn)行修復(fù)。

綜上所述，苗藥吉祥草血清可抑制氣道平滑肌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡；對細(xì)胞中炎性因子IL-1β和COX-2表達(dá)也能進(jìn)行有效的抑制。本實驗研究存在一定的不足，僅對細(xì)胞中兩種炎癥因子進(jìn)行了研究，還不夠全面，今后應(yīng)對多種不同的炎性因子進(jìn)行研究，為苗藥吉祥草治療COPD提供理論支持。