肝郁對圍絕經(jīng)期綜合征大鼠認知功能及腦組織氧化應(yīng)激的影響

沈建英，梁文娜，張凌媛，丁珊珊，康 潔，趙 田，陳 燕，劉圣洋，楊 敏，龔 琳

（1.福建中醫(yī)藥大學中醫(yī)證研究基地，福建 福州 350122；2.福建省中醫(yī)健康狀態(tài)辨識重點實驗室，福建 福州 350122）

女性患抑郁癥的比例大約是男性的2 倍［1］，到了圍絕經(jīng)期甚至高達5 倍［2］。女性進入圍絕經(jīng)期后容易出現(xiàn)抑郁、焦慮及健忘等情志異常的表現(xiàn)。前期研究表明，肝氣郁結(jié)是圍絕經(jīng)期綜合征的主要病理過程之一［3-4］。肝失疏泄是導(dǎo)致腦老化的重要因素之一［5-6］，可以通過調(diào)補肝氣及疏肝解郁調(diào)節(jié)機體氧化失衡狀態(tài)或提升端粒酶活性［6-7］，改善學習認知功能，從而延緩衰老進程。近年來關(guān)于應(yīng)激加速衰老的研究逐漸受到越來越多學者的關(guān)注［8］。然而，目前大多數(shù)研究仍使用雄性動物作為研究對象［9-10］，而對雌性動物尤其是圍絕經(jīng)期大鼠的報道相對較少。因此，本研究采用慢性束縛應(yīng)激聯(lián)合孤養(yǎng)法建立圍絕經(jīng)期綜合征大鼠肝郁模型，利用水迷宮實驗來檢測學習記憶能力，評價其抗氧化應(yīng)激能力，從而進一步闡明圍絕經(jīng)期綜合征肝郁對腦衰老進程的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 9 月齡健康SPF 級雌性SD 大鼠32 只，體質(zhì)量（430±30）g，購自上海斯萊克實驗動物責任有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2012-0002。所有動物飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心，動物房溫度控制在（22±2）℃，相對濕度55%～70%，采用8AM/8PM 交替的12 h 照明方式，自由攝食和飲水，正常飼養(yǎng)至12 月齡。

1.2 實驗試劑 促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocor ticotropic hormore，ACTH）、皮質(zhì)酮（corticostrone，CORT）試劑盒（美國CUSABIO 公司，貨號：CSB-E06875r、CSB-E07014r）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司，貨號：A001-3、A003-1）；BCA 蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：P0012S）；冰乙酸（西隴化工股份有限公司，貨號：1270570201600）；95%乙醇（國藥-滬試，貨號：10009164）。

1.3 實驗儀器 SMG-2 型Morris 水迷宮（北京醫(yī)學科學院藥研所）；infinite M200 Pro 型連續(xù)波長多功能酶標儀（奧地利Tecan 公司）；5810R 型離心機（德國Eppendorf 公司）。

2 實驗方法

2.1 造模 采用慢性束縛應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)法建立圍絕經(jīng)期綜合征肝郁大鼠模型。造模期間，對大鼠進行孤養(yǎng)，束縛應(yīng)激時間為6 h（約9：00—15：00），連續(xù)束縛42 d。束縛造模具體方法如下，將大鼠置于特制的束縛筒內(nèi)，束縛器呈管狀，長約20 cm，筒口內(nèi)徑7.0 cm，前端為通氣孔，尾端為可關(guān)閉的蓋子。管壁有若干通氣孔，使大鼠能夠自由呼吸與排泄。采用曠場實驗和糖水偏好實驗來觀察大鼠焦慮樣及抑郁樣行為的改變，并結(jié)合體征變化篩選出曠場實驗水平得分、垂直得分及糖水消耗率明顯下降的大鼠，視為造模成功［11］。

2.2 分組 造模前連續(xù)10 d 觀察雌性SD 大鼠動情周期，篩選出動情周期紊亂的36 只圍絕經(jīng)期綜合征大鼠，同時利用曠場實驗對每只大鼠進行行為學評分，水平運動和垂直運動總得分＜30 分和＞150 分的大鼠予以剔除，選擇各項行為學指標得分相近的圍絕經(jīng)期綜合征大鼠32 只，采用隨機數(shù)字表法按體質(zhì)量分層將大鼠分為對照組（n＝12）和模型組（n＝20）。模型組按“2.1”項下造模方法建立圍絕經(jīng)期綜合征肝郁大鼠模型，對照組以每籠4 只進行群養(yǎng)，除造模及行為測試時段所有動物給予自由進食與飲水。最后造模組篩選出成模大鼠12 只。

2.3 ACTH 及CORT 含量檢測 于造模結(jié)束后，各組大鼠禁食不禁水12 h，依次用2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）進行腹腔注射麻醉后，腹主動脈取血，用EDTA 抗凝劑的采血管收集血液，室溫靜置30 min，于4 ℃下3 000 r/min 離心10 min，分裝后置于-80 ℃冰箱保存。ACTH 及CORT 含量測定按試劑盒說明書操作步驟進行。

2.4 水迷宮實驗 分別于造模前5 d和造模第37天上午9：00—11：00 對2 組大鼠進行Morris 水迷宮測試。水迷宮被平均分為4 個象限，站臺置于第3 象限。實驗分為定位航行實驗和空間探索實驗。定位航行實驗歷時共4 d，每天訓練4 次，第1 天將大鼠面向池壁從第1 象限的中點處入水，第2 天從第2 象限的中點處入水，以此類推。觀察并記錄大鼠在60 s 內(nèi)尋找水下平臺的時間，即逃避潛伏期，若60 s 內(nèi)仍未找到平臺，逃避潛伏期記為60 s，并將動物引導(dǎo)到平臺上熟悉環(huán)境并休息10 s，再進行下一次測試，分別計算每天逃避潛伏期的平均值?？臻g探索實驗歷時1 d，于第5 天進行，撤除水下平臺后，將大鼠面向池壁從第1 象限的中點處入水，記錄其在60 s 內(nèi)第3 象限的活動時間及穿越原平臺所在位置的次數(shù)。

2.5 腦組織SOD、MDA 含量測定 腹主動脈取血后立即斷頭，快速將分離下來的全腦組織置于冰盤上，迅速切除前額葉皮質(zhì)并剝?nèi)『ｑR，將組織用凍存管收集，稱重結(jié)束后立即置于液氮中速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用黃嘌呤氧化酶法及硫代巴比妥酸法檢測SOD 和MDA 含量，按試劑盒說明書操作步驟進行。

2.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，組內(nèi)比較采用配對樣本t檢驗，組間比較采用獨立樣本t檢驗；組內(nèi)不同時間點比較采用重復(fù)測量方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié) 果

3.1 2 組大鼠體征及血漿中ACTH 和CORT 含量比較 造模前，2 組大鼠皮毛色澤光亮，精神狀況良好，活動反應(yīng)靈敏。造模后，對照組大鼠體征無明顯變化，模型組大鼠則表現(xiàn)出食欲下降、糞便稀軟、反應(yīng)遲鈍、精神萎靡、焦躁不安、偶有嘶叫等現(xiàn)象。同時，模型組大鼠血漿的ACTH 和CORT 含量較對照組均明顯升高（P＜0.01），見圖1。

圖1 2 組大鼠血漿ACTH 和CORT 含量比較

3.2 2 組大鼠糖水消耗率和礦場實驗得分比較 與對照組比較，模型組大鼠造模后糖水消耗率明顯下降（P＜0.01），曠場實驗水平和垂直得分也明顯下降（P＜0.01）。見圖2、圖3。

圖2 2 組大鼠糖水消耗率比較

3.3 2 組大鼠水迷宮實驗逃避潛伏期比較 在基線水平，隨著訓練次數(shù)的增加，模型組大鼠的平均逃避潛伏期逐漸縮短。造模結(jié)束后，模型組的平均逃避潛伏期較對照組顯著延長（P＜0.01），見圖4。

圖3 2 組大鼠曠場實驗水平和垂直得分比較

圖4 2 組大鼠水迷宮實驗逃避潛伏期比較

3.4 2 組大鼠空間探索實驗中在第3 象限的平均停留時間比較 造模結(jié)束后，與對照組比較，模型組大鼠空間探索實驗中在第3 象限的平均停留時間明顯縮短（P＜0.01），見圖5。

圖5 2 組大鼠空間探索實驗中在第3 象限的平均停留時間比較

圖6 2 組大鼠海馬和前額葉皮質(zhì)組織SOD 活 力 和MDA 含 量 比 較

3.5 2 組大鼠海馬和前額葉皮質(zhì)組織SOD 活力和MDA 含量比較 與對照組比較，模型組海馬及前額葉皮質(zhì)組織SOD活力明顯下降（P＜0.01），MDA 含量明顯上升（P＜0.01）。見圖6。

4 討 論

女子以肝為先天，肝功能失調(diào)、情志異常是加速機體衰老的重要原因之一［12］。本研究進一步探討了肝郁對圍絕經(jīng)期綜合征大鼠腦衰老進程的影響，結(jié)果表明，慢性束縛應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)法可以復(fù)制圍絕經(jīng)期綜合征肝郁大鼠模型，對學習及空間記憶能力造成明顯的損傷，海馬和前額葉腦組織抗氧化應(yīng)激能力顯著下降。提示肝郁會在一定程度上加速圍絕經(jīng)期綜合征大鼠腦衰老的進程，這也與國內(nèi)學者提出“肝失疏泄致腦老化”的假說［5］及國外學者提出腦衰老的應(yīng)激學說［13］相一致，從而進一步豐富了“因郁促衰”的相關(guān)理論假說。

慢性應(yīng)激或糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid，GC）過高均會加速大腦的衰老進程，并最終導(dǎo)致腦損傷。皮質(zhì)酮（CORT）是嚙齒動物中最主要的GC，對海馬神經(jīng)元的伸長、分化及其生理功能有直接的影響。臨床研究也發(fā)現(xiàn)，GC 含量高的患者記憶力受損明顯［14］，MDD 患者常伴有認知障礙，其癥狀與AD 患者相似［15］。另外，長期注射GC 會損傷皮層及海馬，導(dǎo)致海馬體積減小［16］。水迷宮實驗?zāi)茌^準確地反映大鼠的空間學習記憶能力，其中定位搜索實驗是用來測試記憶保持能力，空間搜索實驗用來測試空間學習能力。本研究發(fā)現(xiàn)，造模結(jié)束后模型組大鼠在定位航行實驗中的平均逃避潛伏期顯著延長，在第3 象限的平均停留時間顯著縮短，提示肝郁對圍絕經(jīng)期綜合征大鼠的學習及空間記憶能力造成比較明顯的損害。BODNOFF 等［17］比較了皮質(zhì)酮持續(xù)注射3 個月對不同月齡大鼠空間記憶力的影響，發(fā)現(xiàn)中年大鼠出現(xiàn)明顯的空間記憶障礙，而青年大鼠則幾乎不受影響，說明了隨著年齡增長，HPA 軸持續(xù)亢進對中年大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)造成的損傷可能更為嚴重。但是，也有研究發(fā)現(xiàn)GC 的急性或短暫分泌能夠促進學習過程，增強學習及空間記憶能力，對防止神經(jīng)系統(tǒng)退化和衰老有積極的作用［18-19］。因此，應(yīng)激時程或GC 注射持續(xù)時間的長短均可能會對大鼠空間學習記憶產(chǎn)生不同的影響，增齡及持續(xù)的慢性應(yīng)激可能是肝郁導(dǎo)致圍絕經(jīng)期綜合征大鼠空間記憶力下降的重要因素。

科學家們對腦老化的機制進行了許多推測，自由基學說占有一席之地，該學說認為機體代謝過程中產(chǎn)生的一些自由基會對細胞內(nèi)生物大分子產(chǎn)生氧化損傷反應(yīng)，損傷的累積可逐漸引起細胞功能的衰退，導(dǎo)致腦老化的發(fā)生。隨年齡增長體內(nèi)自由基水平隨之增高，由其誘導(dǎo)產(chǎn)生的某些有害物質(zhì)也增多，而對自由基的防御功能卻逐漸下降。在增齡和慢性應(yīng)激等損傷條件下，HPA 軸負反饋機制失調(diào)，機體的氧化和抗氧化防御系統(tǒng)失衡，自由基的產(chǎn)生大于清除，由其誘導(dǎo)產(chǎn)生的某些有害物質(zhì)逐漸增多，就會造成腦內(nèi)產(chǎn)生廣泛的神經(jīng)化學及形態(tài)學改變，最終導(dǎo)致大腦器質(zhì)性損害，而與情緒、認知密切相關(guān)的邊緣系統(tǒng)尤其是海馬和前額葉皮質(zhì)最容易受到影響［20-21］。長期慢性應(yīng)激可能會導(dǎo)致中樞神經(jīng)可塑性下降［22-23］，誘發(fā)大量自由基的產(chǎn)生，導(dǎo)致胞質(zhì)內(nèi)脂褐質(zhì)增多，腦老化過程加速，從而出現(xiàn)認知功能障。SOD 具有明顯的抗氧化作用，能有效地消除衰老的啟動因子即超氧陰離子自由基，在保護腦功能、延緩衰老方面發(fā)揮著重要的作用。MDA是自由基損傷不飽和脂肪酸生成的過氧化終產(chǎn)物。也有類似的研究報道不同的慢性應(yīng)激方式均可導(dǎo)致腦組織SOD活性明顯下降，MDA含量顯著升高［21，24］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠前額葉皮質(zhì)及海馬組織的SOD 活力均顯著下降，MDA 含量顯著升高，提示肝郁會導(dǎo)致圍絕經(jīng)期綜合征SD 大鼠腦組織的抗氧化應(yīng)激能力下降，側(cè)面反映了肝郁可能會在圍絕經(jīng)期自然衰老的基礎(chǔ)上進一步加速腦衰老的進程。因此，模型組大鼠海馬及前額葉皮質(zhì)抗氧化應(yīng)激能力下降可能是導(dǎo)致圍絕經(jīng)期綜合征大鼠認知功能障礙，促進腦組織衰老的重要原因之一。

綜上所述，肝郁造模會導(dǎo)致圍絕經(jīng)期綜合征大鼠認知行為及抗氧化應(yīng)激能力顯著下降，從行為學及自由基的層面說明了肝郁會加速圍絕經(jīng)期綜合征SD 大鼠腦衰老的進程。該研究從實驗角度提示長期慢性應(yīng)激導(dǎo)致的肝郁可能嚴重影響著圍絕經(jīng)期女性的身心健康并加速機體衰老，進一步闡明慢性應(yīng)激加速圍絕經(jīng)期綜合征大鼠腦衰老的具體機制，將對臨床延緩圍絕經(jīng)期女性腦衰老具有十分積極的指導(dǎo)意義。