UPLC-MS/MS法測(cè)定不同生長(zhǎng)年限鉤吻莖中6種生物堿的含量

王河山，諶賽男，許 文，王英豪，吳水生*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.道地藥材國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100700）

鉤吻Gelsemium elegansBenth.為馬錢(qián)科鉤吻屬植物，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，亦稱(chēng)胡蔓藤、斷腸草、大茶藥、豬人參等。全株入藥，味辛、苦，性溫，有大毒，具有祛風(fēng)攻毒、散結(jié)消腫、止痛的功效［1］。主要分布于福建、廣西、廣東等地，是我國(guó)傳統(tǒng)的藥用植物，也是世界著名的劇毒藥物［2］，因其毒性大，民間多以外用為主。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，吲哚類(lèi)生物堿是鉤吻的主要化學(xué)成分，也是其毒性的主要來(lái)源［3］。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已從鉤吻中分離出了17 種生物堿，其中含量最大的是鉤吻素子（Koumine），其次為鉤吻堿甲（Gelsemine）；毒性最強(qiáng)的是鉤吻素己（Gelsenicine），胡蔓藤堿甲（Humantenmine）次之［4-5］；而如何減毒增效以提高臨床應(yīng)用也取得了一定進(jìn)展［6-8］。研究表明，鉤吻莖質(zhì)量占全草的80%，其中老莖中鉤吻堿甲、鉤吻素子、鉤吻素己3 種成分總含量高于嫩莖［9］。

資源調(diào)查發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地的鉤吻在長(zhǎng)勢(shì)上存在明顯差異，不同生長(zhǎng)年限的鉤吻也有一定的差異，特別表現(xiàn)在葉片的表面形狀和大小以及莖的木質(zhì)化程度、粗細(xì)、顏色等方面［10］。文獻(xiàn)已有對(duì)鉤吻不同部位和產(chǎn)地的生物堿含量進(jìn)行報(bào)道［11］，但是關(guān)于不同生長(zhǎng)年限的考察報(bào)道甚少。近年來(lái)，超高效液相色譜（UPLC）串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜（QqQMS/MS）因其分離速度快、靈敏度高、測(cè)定準(zhǔn)確性可靠等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用在中藥及復(fù)方的分析中［12-13］。目前有關(guān)液質(zhì)聯(lián)用分析鉤吻藥材質(zhì)量的研究報(bào)道還比較少［14-15］。根據(jù)前期對(duì)鉤吻研究，課題組評(píng)價(jià)了HPLC 外標(biāo)法測(cè)定不同產(chǎn)地鉤吻莖中胡蔓藤堿丙等6 個(gè)生物堿含量，但分離速度慢、耗時(shí)長(zhǎng)［16］。因此，本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-MS/MS 法對(duì)6 種生物堿即胡蔓藤堿丙、鉤吻堿甲、鉤吻素子、鉤吻素己、鉤吻綠堿、胡蔓藤堿乙進(jìn)行定量分析，比較不同生長(zhǎng)年限鉤吻的生物堿含量，以期建立快速、簡(jiǎn)易、準(zhǔn)確、高效的鉤吻成分定量分析方法［17-20］。為鉤吻的種植、采收、加工、研究等資源利用提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters I-Class 超高效液相色譜串聯(lián)Micro MS 三重四級(jí)桿質(zhì)譜（美國(guó)Waters 公司）；TCM15D 高速離心機(jī)（寧波拓普森科學(xué)儀器有限公司）；225D-1CN 型十萬(wàn)分之一分析天平（德國(guó)Sartorius 公司）；SF180C 型中藥粉碎機(jī)（湖南中誠(chéng)制藥機(jī)械廠(chǎng)）；KQ2200 臺(tái)式超聲波清洗器（蘇州江東精密儀器有限公司）；Milli-Q 超純水儀（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 試藥 4 批不同生長(zhǎng)年限鉤吻莖藥材，在福州市國(guó)家森林公園（26°29′01″N，119°16′44″E，H：212 m）同一鉤吻植株上進(jìn)行標(biāo)記，并連續(xù)4 年進(jìn)行采樣，采集的部位以標(biāo)記處為準(zhǔn)，盡量使莖的采集部位保持一致，于每年同一時(shí)間采集1 次。經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與鑒定教研室楊成梓教授鑒定為馬錢(qián)科鉤吻屬植物鉤吻Gelsemium elegansBenth.的莖。

對(duì)照品鉤吻堿甲、胡蔓藤堿丙、鉤吻素子、鉤吻素己、鉤吻綠堿、胡蔓藤堿乙（北京賽百草有限公司）；乙腈（色譜純，德國(guó)Merck 公司）；甲醇（色譜純，上海麥克林生化科技有限公司）；甲酸（色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱ACQUITY UPLC BEHC18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫：0～0.5 min，2%A；0.5～1.5 min，2%～20%A；1.5～3.0 min，20%～30%A；3.0～4.0 min，30%～45%A；流速：0.25 mL/min；柱溫：45 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧（ESI）離子源的正離子模式，毛細(xì)管電壓為3.5 kV，脫溶劑氣流為氮?dú)?，二?jí)錐孔萃取電壓為3.00 V，碰撞氣體為氬氣，流速為800 L/h，脫溶劑溫度200 ℃，錐孔氣流為氮?dú)?，流?0 L/h，掃描方式為多反應(yīng)檢測(cè)模式（MRM）。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 取胡蔓藤堿丙、鉤吻堿甲、鉤吻素子、鉤吻素己、鉤吻綠堿和胡蔓藤堿乙對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加入甲醇分別制備200.2、226.0、232.0、232.0、212.0、202.0 μg/mL 的單一對(duì)照品母液，分別精密量取各母液適量，用50%甲醇稀釋配置成單一對(duì)照品儲(chǔ)備液，系列濃度的各個(gè)混標(biāo)濃度經(jīng)母液稀釋后得到。

2.2.2 供試品溶液制備 取鉤吻莖藥材粉碎，過(guò)50目篩得到鉤吻粉末。取鉤吻干燥粉末0.2 g，精密稱(chēng)定，置具塞三角瓶中，精密加入50%甲醇-0.1%甲酸水溶液25 mL，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用50%甲醇-0.1%甲酸水溶液補(bǔ)足失重，搖勻，12 000 r/min離心10 min，0.22 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。稀釋10 倍（即100 μL 提取液加900 μL 的2%乙腈溶劑）后測(cè)定。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 質(zhì)譜測(cè)定方法 采用正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）定量模式，6 種生物堿的質(zhì)譜分析條件參數(shù)見(jiàn)表1。通過(guò)鉤吻的UPLC-MS/MS 總離子流色譜圖，可見(jiàn)鉤吻混合標(biāo)準(zhǔn)品和供試品按上述色譜及質(zhì)譜條件下分析，6種分析物均分離良好。見(jiàn)圖1。

表1 6 種生物堿的質(zhì)譜分析條件參數(shù)表

2.3.2 線(xiàn)性和范圍 取各對(duì)照品儲(chǔ)備液，用50%甲醇稀釋配制系列梯度濃度的對(duì)照品混合溶液，測(cè)定前按1∶10 稀釋后依法測(cè)定峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，以6 種生物堿濃度（X）為橫坐標(biāo)，作線(xiàn)性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)，并以信噪比S/N＝10 為定量限（LOQ），以信噪比S/N＝3為檢測(cè)限（LOD），見(jiàn)表2。

表2 6 種生物堿檢測(cè)的回歸方程、線(xiàn)性范圍、相關(guān)系數(shù)、LOD 和LOQ

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密量取線(xiàn)性最低濃度點(diǎn)、低、中、高QC 混合對(duì)照品溶液1 μL，1 d 內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，并連續(xù)6 d 測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算其濃度，結(jié)果見(jiàn)表3，其日內(nèi)和日間精密度RSD 范圍為1.70%～3.10%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本品按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，分別于0、2、6、10、12、24 h 的時(shí)間間隔依法測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算濃度，結(jié)果見(jiàn)表3，其RSD范圍為3.26%～4.20%，說(shuō)明樣品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 稱(chēng)取同一批鉤吻樣品6 份，按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，依法測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算其含量，結(jié)果見(jiàn)表3，其RSD 范圍為2.37%～9.92%，說(shuō)明方法重復(fù)性良好。

2.3.6 回收率試驗(yàn) 稱(chēng)取重復(fù)性實(shí)驗(yàn)同批次已知含量的鉤吻樣品6 份，各0.1 g，精密加入低、中、高3 個(gè)濃度的6 種對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，依法測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算其含量，結(jié)果見(jiàn)表3，其回收率平均為98.66%～104.69%，RSD＜6%，說(shuō)明方法回收率良好。

表3 6 種生物堿檢測(cè)的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和回收率（n＝6）

2.3.7 樣品含量測(cè)定 分別精密稱(chēng)取不同生長(zhǎng)年限的鉤吻莖干燥粉末0.2 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)樣2 μL，測(cè)定峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算其含量，結(jié)果見(jiàn)表4。1～4 年6 種生物堿總量的均值分別為1.533、2.688、3.886、4.552 mg/g。隨著生長(zhǎng)年份增長(zhǎng)，鉤吻堿甲、鉤吻素子、鉤吻素己、鉤吻綠堿、胡蔓藤堿乙的含量均有所增加，6 種生物堿總量也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。

表4 鉤吻不同生長(zhǎng)年限樣品中6 種生物堿的含量測(cè)定（±s） mg/g

表4 鉤吻不同生長(zhǎng)年限樣品中6 種生物堿的含量測(cè)定（±s） mg/g

編號(hào)S1 S2 S3 S4年限1年莖2年莖3年莖4年莖胡蔓藤堿丙0.156±0.007 0.845±0.031 0.359±0.009 0.255±0.008鉤吻堿甲0.499±0.022 0.743±0.017 1.009±0.044 1.325±0.029鉤吻素子0.475±0.020 0.385±0.015 1.039±0.028 1.145±0.061鉤吻素己0.058±0.004 0.235±0.005 0.216±0.015 0.269±0.014鉤吻綠堿0.169±0.006 0.189±0.012 0.663±0.031 0.691±0.017胡蔓藤堿乙0.176±0.008 0.295±0.011 0.600±0.035 0.867±0.027

3 討 論

通過(guò)篩選不同色譜柱，比較測(cè)定方法的速度、準(zhǔn)確性、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和回收率等，最終色譜柱ACQUITY UPLC BEHC18在各方法學(xué)考察中均表現(xiàn)穩(wěn)定，故選擇為最優(yōu)色譜柱。此外，在流動(dòng)相系統(tǒng)選擇上，參考許文等［20-21］對(duì)三葉青主要成分測(cè)定，分析了乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-水-0.1%醋酸銨水、甲醇-0.1%甲酸水和甲醇-0.1%醋酸銨水共4 套流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果表明乙腈-0.1%甲酸水流動(dòng)性系統(tǒng)對(duì)6 種鉤吻生物堿的分離度最佳。另外，通過(guò)6 種生物堿的離子質(zhì)譜裂解圖發(fā)現(xiàn)，色譜分離上雖然胡蔓藤堿丙和鉤吻堿甲或鉤吻素己和鉤吻綠堿未能明顯基線(xiàn)分離，但是其在質(zhì)譜定量通道MRM 上互不干擾，故兩者均可以準(zhǔn)確定量。通過(guò)Mass Tune 針對(duì)待測(cè)6 種生物堿成分質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，考察了最佳的毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、碰撞能量，優(yōu)選最佳的MRM 模式定量離子對(duì)。本試驗(yàn)建立的超高液相色譜法同時(shí)測(cè)定不同生長(zhǎng)年限鉤吻中6 種生物堿成分的定量分析方法，為快速、簡(jiǎn)易、準(zhǔn)確綜合鉤吻的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了參考依據(jù)。

對(duì)不同生長(zhǎng)年限的鉤吻生物堿含量測(cè)定結(jié)果表明，1～4 年生鉤吻莖中除胡蔓藤堿丙外，鉤吻堿甲、鉤吻素子、鉤吻素己、鉤吻綠堿、胡蔓藤堿乙等5 種生物堿類(lèi)成分含量隨著鉤吻生長(zhǎng)年限的增加而增長(zhǎng)，并且從6 種生物堿總量來(lái)看，隨著生長(zhǎng)年限的增加，其亦呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)。因此，得出初步實(shí)驗(yàn)結(jié)論：鉤吻隨著生長(zhǎng)年限的增長(zhǎng)，生物堿類(lèi)成分含量增加，有利于藥效成分的富集。

本研究建立的超高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定鉤吻不同生長(zhǎng)年限（1～4 年）中6 種生物堿成分含量。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，檢測(cè)方法均符合分析要求，同時(shí)更簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確、高效，大大縮短了高效液相色譜外標(biāo)法測(cè)定鉤吻生物堿成分的時(shí)間。本次測(cè)定結(jié)果顯示，不同生長(zhǎng)年限（生長(zhǎng)年份為1～4 年）的鉤吻，在所測(cè)定的6 種生物堿中，除胡蔓藤堿丙外，其他5 種生物堿類(lèi)成分的含量均隨鉤吻的生長(zhǎng)年份增長(zhǎng)而增加，生物堿總量也呈逐年上升的趨勢(shì)。該結(jié)果表明鉤吻的總生物堿含量在鉤吻的生長(zhǎng)過(guò)程中呈現(xiàn)不斷的富集，從藥用植物種植、生產(chǎn)及臨床應(yīng)用上進(jìn)行考慮，老莖的品質(zhì)可能優(yōu)于嫩莖，為鉤吻的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了指導(dǎo)依據(jù)。