表面增強拉曼光譜在食品安全檢測中的應用研究

◎ 黃雅軒，蔡依含，何婉霞，張莉滟，趙 越

（1.南方醫(yī)科大學附屬廣東省人民醫(yī)院/廣東省醫(yī)學科學院檢驗科，廣東 廣州 510080；2.南方醫(yī)科大學 檢驗與生物技術學院，廣東 廣州 510515；3.廣州南方學院 云康醫(yī)學與健康學院，廣東 廣州 510970）

食品是人們賴以生存的基本條件，食品安全直接關系到人們的生命健康，也是國家經(jīng)濟平穩(wěn)發(fā)展的重要基石。全球每年約2 000 萬人因食源性感染死亡，食品安全問題現(xiàn)已成為世界性的公共衛(wèi)生問題[1]。世界衛(wèi)生組織曾指出，食品安全是指食品在按照預期用途進行制備和（或）食用時，不會對消費者造成傷害。食品添加劑、動植物天然毒素、食源性感染如病毒等均可引發(fā)食品安全問題[2]。3 類污染物包括微生物（如細菌、真菌和病毒）、化學物質（如毒素、過敏原和農(nóng)藥）與物理污染物（如塑料、玻璃、金屬和巖石），可在食品供應鏈中污染食品。

目前電化學生物傳感器、病原學培養(yǎng)等方法仍是用于篩選和檢測食源性致病菌的主要方法，但在實際檢測過程中，由于信號干擾、靈敏度不足等因素，限制了對食源性病原體的有效檢出[3]。而現(xiàn)實中檢測部門應準確及時地檢測出食品是否變質及所含有的有害病原體，因此急需探索新的檢測方法，快速檢出其中的污染物。

拉曼光譜（Raman Spectroscopy）作為現(xiàn)代物質分子結構研究的重要方法，被廣泛應用于物質微結構研究。其主要通過拉曼位移確定物質結構，揭示分子生物特征[4]。拉曼位移即分子振動或轉動頻率，每種物質有其特征拉曼光譜。根據(jù)光譜中的拉曼峰創(chuàng)建獨特的振動指紋，可從分子水平上鑒別物質[5-7]。表面增強拉曼光譜（Surface-Enhanced Raman Spectroscopy，SERS）由于局部等離子體共振，顯著提高了拉曼光譜強度，現(xiàn)已廣泛用于食品安全檢測。本文就SERS 技術與其在食品安全檢測中對食源性病原體、化學及物理污染物鑒別的應用新進展、局限性和戰(zhàn)略前景等方面作一綜述。

1 食品中的污染物

1.1 食源性病原體

食源性病原體包括細菌、真菌和病毒，對全球食品安全行業(yè)造成了極大的影響[2]。其中最常見的食源性病原體是沙門氏菌，約有2 463 個血清型，以腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌檢出最多[8]。沙門氏菌感染會引發(fā)嘔吐、腸胃炎、腹瀉和高熱等。大腸埃希菌O157:H7 也會對人體造成極大危害，10%感染者會合并溶血尿毒癥綜合征（Hemolytic Uremic Syndrome，HUS），且致死率達3%～5%[9]。此外，銅綠假單胞菌同樣可引起食源性疾病，每年造成美國各州約400 人死亡。其常對抗菌藥物表現(xiàn)出高耐藥性，在美國引起的51 000 例感染中，有6 000 例感染菌株為多重耐藥菌[10]。李斯特菌亦能通過食品感染人體，且在過去數(shù)十年里，食品行業(yè)中出現(xiàn)了較多由李斯特菌引起的死亡案例。另外，人體攝入被耐甲氧西林金黃色葡萄球菌污染的食物后，1 ～6 h 內(nèi)可出現(xiàn)嚴重的毒素反應，包括惡心嘔吐、腹部不適等[11]。

病毒對食品安全同樣構成重大威脅，與食源性疾病密切相關。因病毒在食物中無法復制，其通過食物傳播的可能性取決于病毒的活力與其對宿主細胞的敏感性。甲型肝炎病毒和諾如病毒常導致食源性疾病，而戊型肝炎病毒、輪狀病毒、星狀病毒等與食源性腸胃炎相關性較低[12]。

1.2 食品中的有害化學物質

農(nóng)藥和毒物是引起食源性疾病暴發(fā)最常見的化學物質。在食品生產(chǎn)過程中，有害的化學物質可能會人為或意外進入食品供應鏈。為了達到改善食品外觀、顏色、延長保質期等目的，某些物質會被有意添加到食品中。其他有害化學物質則可能是在制備、加工和儲存過程中被無意加入。若食品中某些化學物質含量超標，將對人體造成損害。對因其自身性質即可影響健康的化學物質，則應被禁止使用[13]。廣州食品藥品監(jiān)督管理局于2013 年第一季度對市內(nèi)餐館進行抽查，發(fā)現(xiàn)大米及米制品的鎘含量高于建議水平44.4%，引發(fā)全社會的廣泛關注。鎘不是人體必需元素，而是一種環(huán)境污染物，過量攝入將導致鎘中毒，現(xiàn)已被WHO 列為重點研究的食品污染物[14]。除鎘以外，其他有害化學物質對人體造成的損害同樣嚴重，務必要引起高度重視。

1.3 食品中的有害物理物質

有害的物理物質包括木頭、石頭、金屬、塑料、玻璃和昆蟲等，均不應在食品中出現(xiàn)。上述物質可因其自身特點，如大小、形狀、硬度或鋒利度等導致窒息、割傷或消化道刺穿，在我國這類有害物理物質已引發(fā)了重大食品安全事件[15]。在2014 2015 年，我國大陸地區(qū)共發(fā)生了360 起食品異物事件。其中生物類異物（昆蟲等）最為多見，約占43.0%。此外，材料類異物（包括金屬、玻璃、塑料等）、毛發(fā)類異物也較為常見，共占28.5%。在各類形狀大小的異物中，一般以0.5 ～3.0 cm 的尺寸最為多見[16]。

2 表面增強拉曼光譜

每108個光子中僅有一個光子會自發(fā)產(chǎn)生拉曼散射，因而拉曼散射相對較難被識別，極大限制了可獲得的拉曼信號強度[17]。一般可通過提高入射激光功率、使用顯微鏡把激光束集中于特定的微小區(qū)域來提高拉曼激光獲取效率，但這可能會產(chǎn)生樣品光漂白等干擾效果[18]。

印度物理學家拉曼最初發(fā)現(xiàn)，光在介質中傳播時，散射光波長與入射光不同。拉曼散射是對改變頻率光子的研究，可用于確定分子能量。然而，拉曼光譜的實際應用有限，拉曼信號在正常情況下強度較低，而過低的拉曼信號難以被傳感器識別。FLEISCHMAN等[19]于1974 年發(fā)現(xiàn)吡啶分子吸附在粗糙銀電極表面可增強拉曼散射信號。另外，分子吸附于活性載體表面可減少熒光產(chǎn)生，優(yōu)化拉曼信號強度和質量，并增強其穩(wěn)定性。

SERS 是一種超靈敏和高選擇性的分析技術，金屬NPs 或納米結構金屬被大量使用以增強固有微弱拉曼信號[20-21]。有兩種不同的方法可增強SERS 中的拉曼信號，一是電磁增強，即在“熱點”中靠近金屬表面的原生電場被局部表面等離子體激元聚焦；二是將拉曼散射提高到102倍左右，并通過金屬表面和樣品之間的靜電相互作用進行化學放大[22]。根據(jù)不同的SERS 底物，可分成兩組介質，即吸附于固體基質上的金屬納米顆粒與膠體等離子體共振溶液。上述發(fā)展是電磁增強技術廣泛應用的結果。金和銀具有強烈的等離子體反應，常用作SERS 基底。由于金的化學穩(wěn)定性極高，其最適合作為SERS 基底。此外，相關人員還針對其他金屬進行研究，如用于紫外拉曼光譜的鋁[23]。

有標記和無標記的SERS 技術是可用于細菌檢測的兩種方法。拉曼光譜可作為無標記的檢測方法提供由分子振動光譜組成的“分子指紋”[24]。無標記SERS，即直接將細菌及其代謝物黏附于納米結構物質表面。為識別待測物，可直接檢測納米區(qū)域內(nèi)生物分子的特征拉曼光譜。而在有標記的檢測中，需引入拉曼報告分子以產(chǎn)生SERS 信號。為捕獲目標并實現(xiàn)特異性檢測，配體（如抗體、適體或相關分子）常被固定在納米結構物質表面，通過捕獲前后拉曼光譜的變化可用來識別目標[25]。

3 SERS 在食品安全檢測中的應用

3.1 檢測食品中的病原菌

一些研究已通過拉曼光譜技術對食源性病原體在物種層面上進行分類，標記與無標記SERS 技術已用于細菌和病毒的識別。常用3 種不同的無標記SERS方法檢測細菌，即細菌菌體鑒定、代謝產(chǎn)物鑒定和DNA 鑒定。而食源性疾病的診斷常涉及細菌檢測，檢測方法主要包括將細菌與膠體納米顆粒充分混合，將細菌菌體直接放置在固體SERS 底物上，以及將膠體納米顆粒直接組裝到細菌表面。

通過結合SERS 技術、SIMCA 軟件和銀納米顆粒，F(xiàn)AN 等[26]設計了一種通過磷酸鹽緩沖液（PBS）檢測7 種食源性病毒的技術。SUN 等[27]于2017 年創(chuàng)建了SERS 間接法來識別禽流感病毒（AIV），但在所有禽流感病毒株中，該法僅適用于H3N2型病毒。該方法需形成包括流感免疫球蛋白G（AIgG）、具有高SERS 活性Fe3O4/AuNPs 的類三明治結構，其中通過把AuNPs 與底物結合使其便于識別。該化合物由Fe3O4/AuNPs 與AuNPs 復合物、H3N2流感病毒亞型A與AuNPs 結合而成。通過產(chǎn)生磁場并在將化合物放在鋁箔上之前添加Fe3O4/AuNPs，從而將病毒從化合物中分離出來。

WEI 等[4]通過SERS 成功識別出3 種食源性病原體，包括沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌O157:H7。該實驗通過10 mL 銀膠體納米顆粒重懸細菌，使其濃度為107CFU·mL-1，并置于785 nm 激光下檢測。基于光譜數(shù)據(jù)，研究者發(fā)現(xiàn)銀膠體納米顆?？勺鳛榫哂懈哽`敏度的SERS 活性底物?；阢y顆粒圓柱納米槽網(wǎng)絡（Cylindrical Nanotrough Networks，CNNs）技術，ZHANG 等[28]通過對所測得SERS 光譜的主成分分析（PCA），成功實現(xiàn)了對兩種大腸埃希菌的鑒別。LIAO 等[29]基于硅納米線陣列（SiNWs）研發(fā)了一種用于捕獲和區(qū)分細菌的新型生物介質。SiNWs-Au@Ag 底物對飲用水中的細菌表現(xiàn)出極強的捕獲能力，即在40 min 內(nèi)分別捕獲8.6 106cells/cm2的大腸埃希菌和5.5 106cells/cm2的金黃色葡萄球菌。結合激光誘導擊穿光譜（LIBS）和有標記SERS技術，可對飲用水中的細菌進行有效檢測。為了能夠特異且快速地在60 min 內(nèi)檢測牛奶中的大腸埃希菌，ILHAN 等[30]將SERS 技術與免疫分析相結合，檢出率可達90%，且通過該法獲得的結果與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相一致。

3.2 檢測食品中的有害化學物質

傳統(tǒng)的光譜檢測技術包括冷原子吸收光譜、原子熒光光譜和熒光分光光度法，上述方法均會涉及昂貴的儀器，且需要制備高精度的樣品以及較長的檢測時間。而SERS 作為一種新型快速檢測技術，能提供較多關于化學物質的光譜信息，且具有靈敏度高、無水干擾等特點，便于常規(guī)應用。

采用拉曼光譜技術可檢測有害的食品添加劑，SUN 等[31]通過低成本的三聚氰胺泡沫材料（MF）作為SERS 底物，發(fā)現(xiàn)該底物對食物中的羅丹明B 和堿橙II 具有極高的靈敏度。其中羅丹明B 和堿性橙II 具有潛在致癌性、致突變性和心臟毒性，過量攝入會導致急性或慢性中毒。另一項研究使用具有掃描高光譜能力的拉曼成像設備，通過結合光譜線性相關的混合分析技術，在小麥粉存在其他未知污染物（如l-抗壞血酸、過氧化苯甲酰和偶氮二甲酰胺）的情況下檢測出在多數(shù)國家被禁用的面粉改良劑溴酸鉀[32]。

控制蟲害數(shù)量和促進植物生長是農(nóng)業(yè)中使用殺蟲劑的兩個目標。農(nóng)藥濫用導致藥物遺留可能會對人體健康產(chǎn)生不同程度的影響。福美雙作為一種殺蟲劑，常在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中被廣泛使用。XIONG 等[33]利用纖維素納米纖維（CNF）作為底物，制備了CNF/AuNP 納米復合材料，用于快速、準確鑒定蘋果汁中的福美雙。該研究采用銨離子對CNF 進行陽離子化處理，并通過靜電作用使其與檸檬酸鹽穩(wěn)定金納米顆粒（AuNPs）結合形成均勻的納米復合材料。

為治療各種感染性疾病，抗菌藥物被廣泛應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖和畜牧業(yè)。DHAKAL 等[34]于2018 年建立了一種直接有效的基于銀膠體納米顆粒的SERS 方法，用于檢測流食中四環(huán)素（TC）的殘留。該研究通過SERS 技術對不同濃度的水TC 溶液和牛奶TC 溶液進行分析，發(fā)現(xiàn)兩種溶液的TC 殘留量均為0.01 ppm。

3.3 檢測食品中的有害物理物質

微塑料存在于環(huán)境中，當其出現(xiàn)在食品和飲料中會對人體健康造成一定影響。SERS 與網(wǎng)格石基質結合可用于識別小于360 nm 的聚甲基丙烯酸甲酯和聚苯乙烯微塑料。強烈的熱點由格子石基質產(chǎn)生，而格子石基質則是由金制成的復雜的反金字塔狀腔室網(wǎng)格，SERS 還可用于對水中的微塑料碎片及一些雜質，包括熒光和微觀顆粒進行鑒別[35-36]。LV 等[37]將SERS與銀膠體基底結合使用，在純水和海水中分別鑒定出了由聚丙烯、聚苯乙烯和聚乙烯構成的微塑料，大小從100 nm 到10 μm 不等。PRATA 等[38]采用微拉曼光譜技術對白葡萄酒中塑料顆粒進行檢測，發(fā)現(xiàn)26 瓶中有24 瓶被檢測到至少一種微塑料。

4 結語

拉曼光譜作為一種快速、無損、安全的分析技術，現(xiàn)已在食品安全、醫(yī)療保健等多領域中得到成功運用[39-40]。有研究表明，拉曼光譜在準確區(qū)分病原菌方面已優(yōu)于基質輔助激光解析電離飛行時間質譜[41]。其可對食品中的有害物質，包括病原體、環(huán)境污染物、塑料顆粒、農(nóng)藥、食品添加劑等，進行快速準確的鑒別，且樣品前處理簡便、重現(xiàn)性好。但將其廣泛應用于食品行業(yè)，仍有較多問題尚待解決，如食物成分的復雜性，不同分子間的相互影響導致定量分析的精密度降低等。而為保證對特定分子檢測結果的準確性，可采用的方法主要有增強底物特異性，使用合適的適體或抗體，通過靜電相互作用增強帶電化合物的吸附和識別能力等。

再者由于一些污染物可能滲入組織，將難以通過原位檢測或表面采樣進行完全提取和精確識別。為計算和確定目標分析物樣品的實際濃度，可建立描述穿透速率和時間之間關系的模型。還可探討將SERS 與激光誘導擊穿光譜相結合，增強識別能力，實現(xiàn)對病原體的精確檢測。此外，還需解決熒光對檢測過程的影響，其可降低底物的敏感性，并可能導致原位檢測出現(xiàn)偏差。目前石墨烯或氧化石墨烯對不同納米粒子及分析物具有有效的亞納米隔離層功能，可將信號波動維持在較低水平，減少熒光干擾，保證拉曼信號的準確度。

SERS技術在食品安全檢測中的應用具有廣闊前景，未來仍需加強對新技術的研發(fā)，以提升對食品污染物的檢測能力，更好地保障人們的飲食安全和生命健康。