采后黃瓜響應(yīng)低溫脅迫的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

黃泳諺，易景怡，王 斌

韶關(guān)學(xué)院廣東省粵北食藥資源利用與保護重點實驗室/韶關(guān)學(xué)院英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東韶關(guān) 512005

果蔬（水果和蔬菜的簡稱）采收后因脫離了母體，失去了養(yǎng)分供應(yīng)來源，只能依靠自身貯存的營養(yǎng)物質(zhì)維持正常的生命活動[1]。但采后果蔬仍是鮮活的生命體，各種生理代謝活動依然旺盛，在常溫貯藏極易腐爛變質(zhì)，導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)流失甚至失去商品價值，會造成較為嚴重的經(jīng)濟損失和資源浪費[2]。在低溫環(huán)境條件下，病原微生物的活動減弱，采后果蔬的呼吸作用強度下降，內(nèi)源乙烯釋放量減少。因此，低溫貯運被認為是保持采后果蔬貯藏品質(zhì)的最重要技術(shù)之一[3]。但是，許多原產(chǎn)于熱帶亞熱帶地區(qū)的果蔬，對低溫特別敏感，在低溫貯藏期間很容易發(fā)生冷害[4]，極大限制了低溫貯運技術(shù)在這類果蔬中的推廣應(yīng)用。黃瓜（Cucumis sativusL.）是葫蘆科黃瓜屬植物，采后黃瓜對低溫十分敏感，在低于10℃的環(huán)境下貯藏時，即可產(chǎn)生明顯的冷害癥狀[5]。發(fā)生冷害的采后黃瓜在貨架期會腐爛變質(zhì)，造成較大的經(jīng)濟損失。因此，探究采后黃瓜對貯藏低溫響應(yīng)的分子機理，能為改進采后貯運技術(shù)提供理論依據(jù)。

植物應(yīng)答低溫脅迫是一個十分復(fù)雜的調(diào)控過程[6]。關(guān)于植物應(yīng)答低溫脅迫的分子機理，在模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）上研究的比較清楚[7]。對擬南芥的研究顯示，擬南芥主要通過依賴CBF/DREB（C-repeat binding factor/dehydration responsive element binding protein）和不依賴CBF/DREB兩種途徑實現(xiàn)對低溫信號的傳導(dǎo)[8]。在CBF途徑中，低溫脅迫處理能在短時間內(nèi)誘導(dǎo) 3個CBF基因的表達，緊接著 CBF蛋白被活化，直接作用于低溫響應(yīng)相關(guān)基因的啟動子區(qū)域，激活或抑制下游靶基因的表達[9]。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中大約只有12%的低溫響應(yīng)相關(guān)基因依賴于CBF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[10]。此外，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控以及蛋白修飾也可能參與植物對低溫信號的響應(yīng)與傳導(dǎo)[11-12]，顯示植物對低溫信號響應(yīng)的復(fù)雜性。同時，擬南芥是非冷敏感型植物，且處于低溫脅迫條件時仍沒有脫離母體，冷敏型采后果蔬對低溫脅迫的應(yīng)答機理可能很大區(qū)別于仍處于營養(yǎng)生長期的耐冷型植物，比如擬南芥。因此，探究冷敏型采后果蔬響應(yīng)低溫脅迫的分子機理，對于完善和豐富植物低溫脅迫應(yīng)答機理具有重要意義。

隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測序已成為研究植物低溫信號應(yīng)答分子機理的重要方法之一[13-15]。本研究以采后黃瓜為試材，評估了采后黃瓜在低溫貯藏期間的冷害情況，檢測了5℃低溫貯藏的采后黃瓜在72 h以內(nèi)的轉(zhuǎn)錄組變化，并結(jié)合生物信息學(xué)分析的方法，在轉(zhuǎn)錄組層面分析了采后黃瓜響應(yīng)冷害溫度的分子機理。分析采后黃瓜響應(yīng)冷害低溫處理的轉(zhuǎn)錄組變化，能鑒定出耐冷關(guān)鍵基因和關(guān)鍵防御途徑，為耐冷相關(guān)基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試黃瓜的商品名稱為“翠夏”，父母本信息不詳。從種植基地運到農(nóng)貿(mào)市場前，未經(jīng)預(yù)冷處理。將供試黃瓜在2 h內(nèi)從農(nóng)貿(mào)市場運回實驗室，立即挑選果形基本一致、無病蟲害和明顯機械傷的果實，作為試驗樣品。將采后黃瓜分別放置在3個塑料筐中，每個筐中裝22根，共66根。其中，30根（3個重復(fù)，每重復(fù)10根）用于觀察在低溫貯藏期間的冷害發(fā)生情況，另外36根用于取樣分析，每次從中隨機抽取3根。塑料筐裝好黃瓜后，用塑料薄膜保鮮袋密封包裝，貯藏于 5℃的低溫恒溫培養(yǎng)箱中，相對濕度為95%~98%。共貯藏12 d，期間每間隔2 d觀察一次冷害情況。轉(zhuǎn)錄組測序的樣品在低溫貯藏12 h和72 h時收集，以果皮作為分析樣品。果皮用削皮刀削下后，立即用液氮速凍處理，保存于-80℃冰箱。

1.2 方法

1.2.1 采后黃瓜的冷害指數(shù)、相對電導(dǎo)率和 PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率測定 采后黃瓜的冷害癥狀表現(xiàn)為在果皮出現(xiàn)水漬狀凹陷斑，根據(jù)凹陷斑癥狀占果皮表面總面積的比例，統(tǒng)計并計算采后黃瓜的冷害指數(shù)（chilling injury index, CII）[16]。將冷害指數(shù)分為5級：0級，未產(chǎn)生冷害癥狀；1級，冷害癥狀的面積占單果表面積的比例低于25%；2級，冷害癥狀面積占單果表面積的比例為 26%~50%；3級，冷害面積占單果表面積的比例為51%~75%；4級，冷害面積超過表面積的75%。冷害指數(shù)=∑（級數(shù)×相應(yīng)級數(shù)果實的數(shù)量）/總果實數(shù)量。

采用電導(dǎo)率儀測定黃瓜果皮的相對電導(dǎo)率（relative electrical conductivity, REC）[17]。用不銹鋼削皮刀削取約 1 mm厚度的黃瓜果皮，用0.5 cm孔徑的打孔器制得果皮小圓片，每個重復(fù)20個小圓片。將小圓片放置在50 mL離心管中，用超純水沖洗3次，瀝干小圓片表皮水分。在離心管中加入25 mL的超純水，蓋住離心管蓋子。室溫（25℃）浸泡2 h，測定果皮小圓片滲出物的初始電導(dǎo)值C1。然后將含有小圓片及滲出物的理性在沸水中煮30 min，自然冷卻至室溫（25℃）后，測定滲出物的終止電導(dǎo)值C2。計算公式： REC（%）=100×（C1/C2）。

在測定PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率（Fv/Fm）前，采后黃瓜在黑暗條件下處理30 min，將黃瓜果實橫切成3等份，取中間1段測定黃瓜果皮的PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率。具體測定方法見WANG等[17]的論文。

1.2.2 黃瓜果皮總RNA提取和 cDNA文庫構(gòu)建采用天根生化科技（北京）有限公司的RNAprep Pure多糖多酚植物總 RNA提取試劑盒（產(chǎn)品編號：DP441）提取黃瓜果皮總RNA，操作方法和步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。轉(zhuǎn)錄組測序在北京百邁客生物科技有限公司完成。使用Agilent Bioanalyzer 2100 system檢測黃瓜果皮總RNA濃度和RIN值，總RNA純度使用超微量紫外分光光度計 Nano DropTM儀器檢測。質(zhì)檢合格的總RNA用Illumina TruSeqTM RNA Sample Preparation Kit試劑盒構(gòu)建cDNA文庫，具體方法參照試劑盒說明書進行。構(gòu)建好的文庫用ABI Step One Plus Real-Time PCR System對文庫的有效濃度（＞2 nmol/L為有效濃度）準確定量，以保證cDNA文庫質(zhì)量。質(zhì)檢合格后，用Illumina平臺測序分析[13]。

1.2.3 基因組比對、差異表達基因篩選及富集分析 測序完成后，采用HISAT（hierarchical indexing for spliced alignment of transcripts）方法[18]，以黃瓜基因組數(shù)據(jù)作為參考，進行序列比對及后續(xù)分析，黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫地址：http://www.cucurbitgenomics.org/organism/20。采用DESeq2法比較樣品組間的基因表達差異[19]，獲得差異表達基因集。篩選差異表達基因的標準為：差異倍數(shù)（fold Change, FC）大于等于2.5，且錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate, FDR）小于0.01[13]。FC由2組相比較樣品的表達量得到，F(xiàn)DR通過對差異顯著性P值（Pvalue）校正得到。

利用 NCBI非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（ftp://ftp.-ncbi.nih.gov/blast/db/）、GO（gene ontology, http://www.geneontology.org/）、大型蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫（http://pfam.xfam.org/）、蛋白質(zhì)直系同源數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）、KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes, http: //www.genome.jp/kegg）、蛋白質(zhì)序列注釋數(shù)據(jù)庫 Swiss-Prot（http://www.uniprot.org/）等公共數(shù)據(jù)庫注釋基因功能。基于GOseq R軟件中的phyper函數(shù)進行GO分類富集分析，應(yīng)用R軟件進行KEGG通路富集分析[20]。

1.2.4 差異表達基因的表達分析 StringTie通過最大流量算法，采用FPKM（fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped）[21-22]表示基因的表達水平。根據(jù)KEGG通路富集結(jié)果，在北京百邁客生物科技有限公司的在線云平臺（http://www.biocloud.net）上，篩選與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物-病原互作以及苯丙烷合成等途徑中的差異表達基因。

隨機挑選9個代表性差異表達基因，采用熒光定量PCR（qRT-PCR）的方法驗證其表達情況。使用上海翊圣生物科技有限公司的熒光定量PCR檢測試劑盒（產(chǎn)品編號：11201ES03）和美國Bio-Rad公司的熒光定量PCR儀分析9個代表性差異表達基因的表達情況。qRT-PCR反應(yīng)體系為：1 μL 的 cDNA 模板，各 1 μL 的正反向引物，10 μL的PCR Mix和7 μL的RNase free water，總反應(yīng)體積為 20 μL。qRT-PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性15 s、60℃退火20 s、72℃延伸26 s，總共40個循環(huán)。引物信息見表1，以黃瓜ACTIN基因（CsaV3_6G041900.1）作為內(nèi)參基因。

表1 本研究所用引物Tab.1 Primers used in this study

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2016軟件記錄、整理和分析數(shù)據(jù)。差異表達基因的火山圖、GO和KEGG富集分析在北京百邁客生物科技有限公司的在線云平臺（http://www.biocloud.net/）完成，采用 Tbtools軟件繪制差異表達基因的表達熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 5℃低溫貯藏期間采后黃瓜冷害情況

采后黃瓜對低溫敏感，貯藏在10℃低溫及以下溫度時，即可發(fā)生冷害[17]。在 5℃低溫貯藏期間，黃瓜冷害指數(shù)（CII）和相對電導(dǎo)率（REC）隨貯藏時間逐漸增加，PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率（Fv/Fm）逐漸降低（圖1）。0 d時，采后黃瓜沒有出現(xiàn)任何冷害癥狀，但在低溫貯藏 12 d時，CII為1.5。在貯藏12 d時，REC比0 d高58.20%，F(xiàn)v/Fm比0 d低71.63%。說明采后黃瓜在5℃低溫貯藏期間發(fā)生了明顯的冷害，且冷害癥狀隨貯藏時間逐漸加重，在 12 d時出現(xiàn)了嚴重的冷害癥狀。

圖1 5℃低溫貯藏期間采后黃瓜冷害情況Fig.1 Chilling injury of harvested cucumber during cold storage at 5℃

2.2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析

測序包括對照組（0 h）和低溫處理組（12 h和72 h），共3組樣品。每組樣品設(shè)置3個獨立的生物學(xué)重復(fù)，共9個樣品。測序數(shù)據(jù)經(jīng)過組裝、基因組比對后，基因組比對效率介于 85.37%~93.93%之間，均值為90.06%。9個樣品的平均GC含量比例為44.32%，Q30為93.32%。這些結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量很高，可用于后續(xù)的生物信息學(xué)分析。

2.3 低溫處理12 h對黃瓜轉(zhuǎn)錄組的影響

通過火山圖可以直觀地查看基因在不同樣品間表達水平的差異，以及統(tǒng)計學(xué)的差異顯著性。與處理前（0 h）相比較，5℃低溫處理12 h導(dǎo)致1500個基因差異表達，其中706個基因表達上調(diào)，794個基因表達下調(diào)（圖2A），表明采后黃瓜在轉(zhuǎn)錄組層面對脅迫低溫作出了快速響應(yīng)。分別采用KEGG通路富集和GO功能分類富集的分析方法，分析了受低溫處理影響的差異表達基因的功能。KEGG通路富集分析的結(jié)果顯示，植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（plant hormone signal transduction）通路富集的差異表達基因數(shù)量最多，且該通路的q值最低，其次是苯丙氨酸代謝（phenylalanine metabolism）和苯丙烷素生物合成（phenylpropanoid biosynthesis）（圖2B）。GO功能分類富集分析結(jié)果顯示，在生物過程（biological process）分類下，差異表達基因被顯著富集在以 DNA為模板的轉(zhuǎn)錄調(diào)控（regulation of transcription, DNA-templated）和蛋白磷酸化（protein phosphorylation）2個過程中；在細胞組份（cellular component）分類下中，被顯著富集的差異表達基因主要與細胞膜（membrane）和細胞核（nucleus）有關(guān)；在分子功能（molecular function）中，差異表達基因的功能主要與DNA結(jié)合（DNA binding）和轉(zhuǎn)錄因子活性（transcription factor activity）功能有關(guān)（圖2C）。KEGG和GO富集分析的結(jié)果表明，采后黃瓜響應(yīng)低溫脅迫可能是一個十分復(fù)雜的生理過程，涉及到植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、苯丙烷類化合物合成、蛋白磷酸化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細胞器組分和形態(tài)變化等。

圖2 低溫處理12 h的轉(zhuǎn)錄組變化Fig.2 Transcriptomic changes following 12 h of cold treatment

2.4 低溫處理72 h對黃瓜轉(zhuǎn)錄組的影響

與低溫處理0 h相比，5℃處理72 h導(dǎo)致7799個基因差異表達，其中 3995個基因表達上調(diào)，3804個基因表達下調(diào)（圖3A），表明較長時間的低溫處理在轉(zhuǎn)錄組層面誘導(dǎo)了更廣泛的反應(yīng)。KEGG通路富集分析的結(jié)果顯示，苯丙氨酸代謝、植物病原菌互作（plant-pathogen interaction）和光合作用天線蛋白（photosynthesis-antenna proteins）3個KEGG通路的富集可靠性最高（圖3B）。GO功能分類富集分析結(jié)果顯示，在生物過程分類下，差異表達基因被顯著富集在跨膜轉(zhuǎn)運（transme-mbrane transport）、蛋白泛素化（protein ubiquitination）和蛋白磷酸化 3個過程中；在細胞組分分類下，被顯著富集的差異表達基因主要與細胞膜和細胞質(zhì)（cytoplasm）等細胞器有關(guān)；在分子功能分類下，差異表達基因的功能主要與ATP結(jié)合（ATP binding）和蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性（protein serine/threonine kinase activity）功能有關(guān)（圖3C）。KEGG和GO富集分析的結(jié)果表明，蛋白磷酸化修飾和泛素化降解可能與采后黃瓜耐冷性密切相關(guān)。因為脅迫低溫會使蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，使蛋白喪失原有功能[5]。此外，植物與病原菌互作有關(guān)的基因也被顯著富集，表明抗病相關(guān)基因可能在采后黃瓜適應(yīng)低溫脅迫過程中扮演重要作用。

圖3 低溫處理72 h的轉(zhuǎn)錄組變化Fig.3 Transcriptomic changes following 72 h of cold treatment

2.5 低溫處理72 h與處理12 h間黃瓜轉(zhuǎn)錄組的差異

12 h與 72 h不同時長的低溫處理組間共有6523個基因差異表達。與 12 h處理相比，3430個基因在處理72 h時表達上調(diào)，3093個基因表達下調(diào)（圖4A）。表明低溫持續(xù)誘導(dǎo)了采后黃瓜在轉(zhuǎn)錄組層面的變化，盡管采后黃瓜在低溫處理72 h時已經(jīng)表現(xiàn)出了一定程度的冷害癥狀。KEGG通路富集分析的結(jié)果顯示，氨基酸合成（biosynthesis of amino acids）通路富集的差異表達基因數(shù)量最多，但該通路的q值大于0.50（圖4B）。富集結(jié)果可靠性最高的4個KEGG通路分別是苯丙氨酸代謝、卟啉與葉綠素代謝（porphyrin and chlorophyll metabolism）、植物病原菌互作和光合作用天線蛋白（圖4B）。說明72 h的低溫脅迫處理可能已經(jīng)對采后黃瓜光合作用系統(tǒng)造成了損害，再次表明冷害低溫誘導(dǎo)的抗病相關(guān)基因表達可能與采后黃瓜耐冷性有關(guān)。GO功能分類富集分析結(jié)果顯示，在生物過程分類下，差異表達基因被顯著富集在跨膜轉(zhuǎn)運和蛋白磷酸化2個過程中；在細胞組分分類下，被顯著富集的差異表達基因主要與細胞膜、細胞質(zhì)和葉綠體（chloroplast）等細胞器有關(guān)；在分子功能分類下，差異表達基因的功能主要與ATP結(jié)合、蛋白激酶活性（protein kinase activity）和水解酶活性（hydrolase activity）功能有關(guān)（圖4C）。與低溫處理12 h相比，采后黃瓜冷害在5℃處理72 h時已經(jīng)發(fā)生，表明細胞膜、細胞質(zhì)和葉綠體等細胞器的完整性受損，胞內(nèi)水解活性增加，物質(zhì)的跨膜運輸加快。圖1B的結(jié)果也反應(yīng)，采后黃瓜在5℃貯藏72 h（3 d）細胞膜透性增大。

圖4 低溫處理72 h與12 h組間的轉(zhuǎn)錄組差異Fig.4 Transcriptomic differences between 72 h and 12 h of cold treatment

2.6 與植物激素信號有關(guān)的差異表達基因在低溫處理期間的表達變化

由于低溫處理12 h誘導(dǎo)的差異表達基因最顯著富集到植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，暗示著低溫脅迫處理通過影響植物激素含量傳遞信號。因此，分析了與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的差異表達基因在響應(yīng)低溫脅迫處理期間的表達模式。如圖5所示，低溫處理影響50個與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的基因差異表達，這些差異表達基因的表達模式可大體分為4種類型（圖5）。有些差異表達基因在脅迫低溫處理后，表達被12 h低溫處理明顯誘導(dǎo)，但在處理72 h時，其表達量又有所下降，但仍比0 h高，比如CsaV3_1G039360基因；有些差異表達基因的表達量持續(xù)被低溫處理所誘導(dǎo)，比如CsaV3_2G002930基因的表達隨處理時長而逐漸增強；有些差異表達基因只被12 h的低溫處理所誘導(dǎo)，比如CsaV3_7G000720基因；另一些差異表達基因的表達顯著被12 h和72 h的低溫處理所抑制，且隨處理時長增加，抑制效果越明顯，比如CsaV3_5G000620基因。以上結(jié)果表明，與植物激素信號有關(guān)的差異表達基因，參與了采后黃瓜對低溫脅迫信號的快速響應(yīng)和傳遞。

圖5 與植物激素信號有關(guān)的差異表達基因的表達模式Fig.5 Expression pattern of DEGs related to plant hormone signal

2.7 與苯丙烷素合成有關(guān)的差異表達基因在低溫處理期間的表達變化

在不同時長的低溫處理中，與苯丙烷素合成或者苯丙氨酸代謝途徑有關(guān)的基因顯著富集。為此，重點分析了與苯丙烷素合成和苯丙氨酸代謝相關(guān)的差異表達基因在低溫處理期間的表達模式。表達熱圖的結(jié)果顯示，在5℃低溫處理期間，共鑒定到了63個苯丙烷途徑的差異表達基因。其表達模式可大致分為3種，一些差異表達基因被2個不同時長的低溫處理所誘導(dǎo)；一些基因的表達被一種處理所誘導(dǎo)，卻被另一種處理所抑制；一些差異表達基因的表達被低溫處理抑制（圖6）。其中，31個差異表達基因被至少1種時長的低溫處理強烈誘導(dǎo)。比如，CsaV3_3G030410基因在12 h的表達量顯著高于 0 h和 72 h，而 CsaV3_6G039700基因在72 h的表達量顯著高于0 h和12 h。6個差異表達基因（CsaV3_7G031600、CsaV3_7G008590、CsaV3_6G039660、CsaV3_5G033660、CsaV3_3G032630和 CsaV3_1G013520）在12 h時的表達量顯著低于0 h和72 h。26個差異表達基因的表達被 2種時長的低溫處理所抑制，且處理時間越長，對表達的抑制效果越明顯，比如CsaV3_3G019500和CsaV3_3G047080基因。表明低溫處理影響苯丙氨酸代謝和苯丙烷素生物合成等過程，可能通過影響苯丙烷途徑相關(guān)基因的表達，誘導(dǎo)苯丙烷素類物質(zhì)的合成與積累。

圖6 與苯丙烷素合成有關(guān)的差異表達基因的表達模式Fig.6 Expression pattern of DEGs related to phenylpropanoid biosynthesis

2.8 與植物與病原菌互作有關(guān)的差異表達基因在低溫處理期間的表達變化

72 h的低溫處理顯著影響與植物-病原菌互作有關(guān)基因的表達，表明植物-病原菌互作可能參與采后黃瓜對低溫脅迫的適應(yīng)過程。共鑒定到了 76個與植物-病原菌互作有關(guān)的差異表達基因，其在低溫處理期間的表達模式如圖7所示。差異表達基因的表達模式大體可分為2種類型，低溫處理誘導(dǎo)抑制 21個差異表達基因的表達，卻誘導(dǎo) 55個差異表達基因的表達。比如，CsaV3_1G045860基因的表達量隨低溫處理時長而逐漸降低，但CsaV3_3G040820基因的表達量隨處理時長而逐漸增強。被低溫處理顯著影響的差異表達基因主要是與鈣離子信號有關(guān)的基因，以及一些受體類的蛋白激酶、熱激蛋白（heat shock protein）、NADPH 氧化酶（respiratory burst oxidase homolog, RBOH）和WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因。被低溫處理所誘導(dǎo)的差異表達基因數(shù)量明顯多于被抑制的，且72 h的低溫處理對差異表達基因的誘導(dǎo)作用更強（圖7）。表明低溫處理誘導(dǎo)了更多抗病有關(guān)基因的表達，其表達可能是采后黃瓜應(yīng)對低溫脅迫的重要機制。

圖7 與植物與病原菌互作有關(guān)的差異表達基因的表達模式Fig.7 Expression pattern of DEGs related to plant-pathogen interaction

2.9 差異表達基因的qRT-PCR驗證

為檢驗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準確性和可靠性，從差異表達基因中，隨機挑選了9個代表性基因，采用qRT-PCR法驗證其表達[13]。在轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果中，3個差異表達基因（CsaV3_3G012390、CsaV3_3G022370和CsaV3_5G027300）在低溫處理12 h時表達量顯著增加，在72 h時表達量又降低（圖8A~圖8C）。5個差異表達基因（CsaV3_3G022290、CsaV3_6G037780、CsaV3_3 G034870、CsaV3_3G036040和CsaV3_4G004700）的表達量隨處理時長而顯著增加（圖8D~圖8H）。1個差異表達基因（CsaV3_6G044400）的表達在低溫處理12 h時被抑制，卻在處理72 h時再次被激活（圖8I）。如圖8所示，盡管同一差異表達基因在轉(zhuǎn)錄組和 qRT-PCR分析結(jié)果中的差異倍數(shù)不完全一致，但其表達趨勢是高度一致的。證明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準確性與可信性很高，通過分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)得到的結(jié)論是可靠的。

圖8 qRT-PCR驗證差異表達基因Fig.8 Representative gene expression validated by qRT-PCR

3 討論

采后黃瓜對低溫敏感，在低溫貯藏期間很容易發(fā)生冷害[23]。采后黃瓜的冷害癥狀主要表現(xiàn)為果皮出現(xiàn)水漬狀凹陷斑，冷害嚴重程度與貯藏環(huán)境溫度高低以及低溫脅迫持續(xù)時間有關(guān)[17]。本研究中，采后黃瓜在 5℃溫度下貯藏時產(chǎn)生了明顯的冷害癥狀，表現(xiàn)為冷害指數(shù)和相對電導(dǎo)率增加，PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率降低。冷害指數(shù)以及相對電導(dǎo)率與冷害嚴重程度正相關(guān)，冷害指數(shù)和相對電導(dǎo)率越大，采后黃瓜冷害越嚴重。Fv/Fm值與冷害程度負相關(guān)，F(xiàn)v/Fm值越大，光合作用系統(tǒng)完整性好，冷害癥狀越輕[13]，盡管采后黃瓜在貯藏期間光合作用較弱。表明可同時通過監(jiān)測冷藏黃瓜的冷害指數(shù)、相對電導(dǎo)率和 PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率的變化，聯(lián)合評估采后黃瓜的冷害情況。

植物激素作為重要的信號分子，在傳遞脅迫信號過程中具有重要作用[24]。乙烯（ethylene,ETH）、茉莉酸（jasmonic acid, JA）與脫落酸（abscisic acid, ABA）與植物逆境脅迫密切相關(guān)，許多研究的結(jié)果表明，這3種植物激素均參與植物對低溫脅迫的響應(yīng)[25]。本研究中，鑒定到了 3個與ABA信號有關(guān)的低溫響應(yīng)差異表達基因。其中，低溫處理誘導(dǎo) 2個 ABA受體基因PYL9（CsaV3_3G008140）和PYL4（CsaV3_3G033450）表達，抑制了PYL8（CsaV3_5G000620）表達（圖5），表明在采后黃瓜適應(yīng)低溫脅迫過程中ABA參與了對低溫脅迫信號的傳遞。鑒定到了 4個與ETH信號有關(guān)的差異表達基因，低溫誘導(dǎo) 2個ETF1B（ethylene-responsive transcription factor 1B）（CsaV3_2G012870 和 CsaV3_3G012170）和1個ETH不敏感突變體EIN3（ethylene-insensitive 3）（CsaV3_2G002930）表達，2個乙烯受體基因ER2（ethylene receptor 2）（CsaV3_3G012390）和ER1（CsaV3_2G009260）的表達只被12 h的低溫處理所誘導(dǎo)，且72 h的低溫處理抑制ER2基因表達。EIN3蛋白可通過與 F-box蛋白 EBF1/2（EIN3-binding F-box 1/2）結(jié)合，激活CBF表達，并增強植物低溫耐受性[26]。在番茄（Lycopersicon esculentum）和煙草（Nicotiana tabacumL.）中，過表達乙烯響應(yīng)因子ERF2（ethylene responsive element binding factor 2）能促進內(nèi)源乙烯的合成[27]。表明乙烯信號參與了采后黃瓜對低溫脅迫的響應(yīng)，誘導(dǎo)的乙烯信號途徑相關(guān)基因與低溫應(yīng)答密切相關(guān)。此外，4個與 JA信號有關(guān)的基因（protein TIFY）（CsaV3_3G030830、CsaV3_1G041270、CsaV3_1G007260和 CsaV3_6G007840），在低溫處理后表達量發(fā)生了顯著變化。低溫處理12 h均誘導(dǎo)這4個TIFY基因的表達，但在處理72 h時，TIFY-10A（CsaV3_1G041270）和TIFY-6B（CsaV3_1G007260）的表達量顯著低于0 h時的表達量。在植物中，TIFY蛋白是JA信號的抑制子，負調(diào)控JA反應(yīng)[28]。低溫處理能誘導(dǎo)JA合成，外源 JA處理也能增強植物的抗冷性[29]。表明短時的低溫處理通過激活TIFY基因表達，抑制了JA信號反應(yīng)，激活JA信號反應(yīng)可能需要更長時間的低溫處理。

油菜素內(nèi)酯（brassinolide, BR）、赤霉素（gibberellin, GA）、吲哚乙酸（indole-3-acetic acid,IAA）和生長素（auxin, AUX）是植物生長類激素，現(xiàn)有的研究證實，這4種激素也參與植物對低溫的響應(yīng)與調(diào)控[30]。本研究中，共鑒定了 17個與AUX信號有關(guān)的差異表達基因，其中6個是AUI（auxin-induced protein）基因，11個是AUR（auxin-responsive protein）。4個AUR基因（CsaV3_1G030930、CsaV3_6G040760、CsaV3_2G015590和CsaV3_1G045520）的表達均被不同時長的低溫處理所誘導(dǎo)，卻抑制 4個AUR基因（CsaV3_7G022810、CsaV3_6G047000、CsaV3_6G013600和CsaV3_2G015380）表達，3個AUR基因（CsaV3_7G000720、CsaV3_3G012650和CsaV3_3G007730）的表達在 12 h時被誘導(dǎo)，卻在72 h時被抑制，表明AUX十分復(fù)雜地參與低溫信號的傳導(dǎo)。低溫處理誘導(dǎo)2個GA受體基因GR-1C（gibberellin receptor 1C）和GR-1B（CsaV3_1G039360和CsaV3_7G028420）的表達，表明低溫處理激活了GA信號途徑。與0 h相比，BKI1（brassinolide kinase inhibitor 1）（CsaV3_2G027990）在12 h時表達上調(diào)，72 h卻抑制其表達，BZR1（brassinazole-resistant 1）的表達模式剛好與BKI1基因相反。在植物中，BKI1負調(diào)控BR信號[31]，BZR1正向調(diào)控 BR信號[32]。表明BR信號傳導(dǎo)反應(yīng)被短期低溫處理所抑制，BR信號可能是其他信號的下游事件，比如ETH和ABA信號。此外，低溫處理還誘導(dǎo)一個IAA合成酶基因（CsaV3_3G018080）的表達，表明低溫處理促進了IAA的生物合成，誘導(dǎo)的IAA可能參與低溫信號的傳導(dǎo)過程。

植物體內(nèi)含有種類和含量豐富的次生代謝產(chǎn)物, 其具有抗細胞毒性、抑菌、抗氧化等多種生物活性[33-34]。研究表明，酚類物質(zhì)在采后果蔬抵御低溫脅迫過程中發(fā)揮重要作用，而苯丙烷途徑是合成酚類物質(zhì)的主要通路[35]。本研究中，低溫處理誘導(dǎo)的差異表達基因被顯著富集在苯丙氨酸代謝和苯丙烷素合成途徑中。苯丙氨酸是合成大部分酚類物質(zhì)的初始化合物[36]。本研究中，KEGG富集分析共鑒定到了 43個與苯丙氨酸代謝有關(guān)的差異表達基因，其中27個被低溫顯著誘導(dǎo)，16個在低溫處理后表達量下降。表明低溫處理促進了苯丙氨酸代謝活性，為酚類化合物合成提供了充足前體物質(zhì)。49個差異表達基因與苯丙烷素合成有關(guān)，其中，低溫誘導(dǎo)34個相關(guān)基因的表達，卻抑制15個相關(guān)基因的表達。被低溫誘導(dǎo)的差異表達基因數(shù)量明顯多于被抑制的，表明低溫處理激活了苯丙烷生物合成途徑。誘導(dǎo)苯丙烷類物質(zhì)的生物合成和積累，可能是采后黃瓜應(yīng)對低溫脅迫的重要機制。

植物與病原菌互作相關(guān)基因表達與植物耐冷性密切相關(guān)[37]。低溫處理顯著誘導(dǎo)鈣信號相關(guān)基因表達，且鈣信號與一氧化氮（nitric oxide, NO）、活性氧（reactive oxygen species, ROS）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPK）信號協(xié)作，共同調(diào)控植物耐冷性[38]。本研究中，76個與植物-病原菌互作有關(guān)的基因在低溫處理后差異表達。其中，38個差異表達基因是鈣信號相關(guān)基因，4個是RBOH基因（CsaV3_1G038860、CsaV3_5G002350、CsaV3_1G002910和CsaV3_3G043480），1個是NO信號相關(guān)基因（CsaV3_5G005200），4個是WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因（CsaV3_3G008610、CsaV3_1G00 4720、CsaV3_3G033350和CsaV3_1G044520），4個是熱激蛋白基因（heat shock protein, HSP）（CsaV3_3G017490、CsaV3_1G038710、CsaV3_1G038690、CsaV3_3G017480），4個是病程相關(guān)基因（CsaV3_1G045860、CsaV3_7G026140、CsaV3_2G009890和 CsaV3_3G010840）。低溫處理誘導(dǎo)絕大多數(shù)的與病原菌互作有關(guān)的差異表達基因，且誘導(dǎo)強度隨處理時間而加強；僅個別基因表達被低溫處理抑制，比如低溫處理只抑制 6個鈣信號相關(guān)基因的表達。表明低溫處理誘導(dǎo)了與病原互作有關(guān)基因的表達，誘導(dǎo)抗病相關(guān)基因表達可能有助于采后黃瓜適應(yīng)低溫脅迫。

此外，GO功能分類富集的結(jié)果顯示，低溫誘導(dǎo)的差異表達基因的功能還與蛋白磷酸化和泛素化、跨膜轉(zhuǎn)運、亞細胞器組分、DNA和 ATP結(jié)合活性等有關(guān)，表明采后黃瓜響應(yīng)并對低溫脅迫作出抗性，是一個復(fù)雜的反應(yīng)過程，涉及蛋白磷酸化修飾和泛素化降解、細胞器形態(tài)和組分改變、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、能量代謝平衡等多種分子和生理活動。

綜上所述，脅迫低溫導(dǎo)致冷害指數(shù)和相對電導(dǎo)率增加，PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率降低，表明可通過監(jiān)測這 3個指標變化判斷采后黃瓜冷害情況。與JA、ETH、ABA等植物激素信號感受有關(guān)的差異表達基因被短時的低溫處理誘導(dǎo)，表明植物激素信號參與低溫信號響應(yīng)與轉(zhuǎn)導(dǎo)。低溫處理誘導(dǎo)了許多苯丙烷合成基因的表達，表明誘導(dǎo)苯丙烷類物質(zhì)的合成積累，可能是采后黃瓜適應(yīng)低溫脅迫的重要防御機制。低溫處理誘導(dǎo)了大量與病原菌互作有關(guān)基因的表達，表明低溫誘導(dǎo)的抗病相關(guān)基因表達與采后黃瓜耐冷性有關(guān)。研究結(jié)果為采后黃瓜響應(yīng)低溫脅迫的分子機理提供了新見解。