白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶1在脂多糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷中的作用及其機(jī)制

陳慧敏 李霞 郎婭婷 盛清浩 呂智美

糖尿病腎病(DKD)是全球腎衰竭最常見(jiàn)的原因之一，影響約1/3的糖尿病患者[1]。DKD是一種以進(jìn)行性腎小球基質(zhì)擴(kuò)張為特征的多階段臨床綜合征，導(dǎo)致腎小球基底膜增厚、系膜擴(kuò)張、腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷和足細(xì)胞丟失[2]。足細(xì)胞是終末分化和高度特化的腎小球上皮細(xì)胞，目前普遍認(rèn)為足細(xì)胞損傷可作為DKD演變的臨床預(yù)測(cè)因子[3-5]。白細(xì)胞介素(IL)-1受體相關(guān)激酶1(IRAK1)是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的一員，與IL-1受體和Toll樣受體(TLR)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)系密切，在先天免疫和炎癥相關(guān)疾病中發(fā)揮重要作用[6-7]。Zhang等[8]研究證實(shí)IRAK1在糖尿病患者及小鼠中表達(dá)水平升高，沉默IRAK1表達(dá)可通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路抑制炎癥和細(xì)胞凋亡減輕腎損傷。Zheng等[9]發(fā)現(xiàn)微小RNA(MIR)-146A-5P可通過(guò)調(diào)控IRAK1靶點(diǎn)抑制腫瘤壞死因子(TNF)受體相關(guān)因子6(TRAF6)/核因子(NF)-κB通路改善急性胰腺炎中的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞自噬。本研究采用脂多糖(LPS)處理人足細(xì)胞以構(gòu)建足細(xì)胞損傷的體外模型，以期研究IRAK1在足細(xì)胞損傷中的作用及分子機(jī)制。

材料與方法

1.材料：永生化人足細(xì)胞系由美國(guó)Peter Mundel教授惠贈(zèng)；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；TRIzol購(gòu)自TaKaRa公司、HiScriptⅡQ RT SuperMix for qPCR、ChamQ SYBR qPCR Master Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；RIPA裂解液、LPS購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；雙抗青鏈霉素混合液、免疫共沉淀試劑盒購(gòu)自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；一抗及辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)自Abcam公司；陰性對(duì)照、IRAK1及TRAF6干擾質(zhì)粒由吉滿生物科技上海有限公司構(gòu)建。

2.方法

(1)LPS儲(chǔ)存液的配制：將1 mg LPS粉末完全溶解于1 ml RPMI-1640完全培養(yǎng)基，得到1 mg/ml的儲(chǔ)存液，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，使其終質(zhì)量濃度為50 ng/ml。

(2)細(xì)胞培養(yǎng)及分組：足細(xì)胞在含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基、37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞密度達(dá)50%～60%時(shí)按LipofectamineTM3000說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒。將足細(xì)胞分為5組，每組1×106個(gè)細(xì)胞：①正常對(duì)照組(control組)：正常培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞48 h;②LPS組：含LPS的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞48 h；③～⑤LPS+空載轉(zhuǎn)染組(LPS+si-NC組)、LPS+IRAK1干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(LPS+si-IRAK1組)、LPS+TRAF6干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(LPS+si-TRAF6組)：分別采用空載質(zhì)粒、IRAK1干擾質(zhì)粒、TRAF6干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染8～12 h后均加LPS溶液培養(yǎng)細(xì)胞48 h。

(3)細(xì)胞總RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)：采用TRIzol法提取足細(xì)胞的總RNA，檢測(cè)RNA濃度及純度后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和體外擴(kuò)增，采用2-△△ct法計(jì)算目的基因(IRAK1、TRAF6 mRNA)的相對(duì)表達(dá)水平。

(4)細(xì)胞總蛋白提取及蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)：提取各組總蛋白，測(cè)定濃度后向10%的聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠上樣孔中加入20 μg蛋白，電泳及轉(zhuǎn)膜后封閉1 h，4 ℃孵育一抗[IRAK1、TRAF6、緊密連接蛋白(ZO)-1、結(jié)蛋白(Desmin)、IL-1β、IL-6、TNF-α、人核因子(NF)-κB抑制蛋白(IKB)-α、NF-κB (p65)、磷酸化NF-κB (p-p65)]過(guò)夜。室溫孵育二抗1 h，洗膜后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光成像，并用Image J軟件進(jìn)行半定量分析表示蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

(5)免疫熒光：細(xì)胞爬片經(jīng)不同處理后，4%多聚甲醛室溫固定，0.1% Triton X-100 破膜，5% BSA溶液室溫封閉，一抗工作液(Desmin、ZO-1)4 ℃孵育過(guò)夜。二抗工作液37 ℃避光孵育1 h，DAPI核染后防熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡觀察拍照。

(6)免疫共沉淀(Co-IP)實(shí)驗(yàn)：提取足細(xì)胞總蛋白，用IRAK1抗體或同種屬I(mǎi)gG抗體與protein A/G磁珠及總蛋白4 ℃緩慢搖晃過(guò)夜孵育，將混有抗體和結(jié)合蛋白的磁珠洗脫,用SDS-PAGE檢測(cè)IRAK1與TRAF6是否結(jié)合。

結(jié) 果

1.control組和LPS組足細(xì)胞IRAK1蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較：LPS組足細(xì)胞IRAK1蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)水平均高于control組(1.39±0.09比0.66±0.08；1.67±0.12比1.06±0.06，P均<0.05)。

2.control組、LPS組、LPS+si-NC組及LPS+si-IRAK1組足細(xì)胞Desmin、ZO-1蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較:control組、LPS組、LPS+si-NC組及LPS+si-IRAK1組足細(xì)胞Desmin、ZO-1蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LPS組、LPS+si-NC組足細(xì)胞Desmin蛋白相對(duì)表達(dá)水平均高于control組，ZO-1蛋白相對(duì)表達(dá)水平均低于control組(P<0.05)。LPS+si-IRAK1組足細(xì)胞Desmin蛋白相對(duì)表達(dá)水平均低于LPS組、LPS+si-NC組，ZO-1蛋白相對(duì)表達(dá)水平均高于LPS組、LPS+si-NC組(P<0.05)。而其余各組間兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1、2及表1。

表1 control組、LPS組、LPS+si-NC組及LPS+si-IRAK1組足細(xì)胞Desmin、ZO-1蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

圖1 control組、LPS組、LPS+si-NC組及LPS+si-IRAK1組足細(xì)胞Desmin蛋白表達(dá)情況(A～D：control組、LPS組、LPS+si-NC組及LPS+si-IRAK1組DAPI核染結(jié)果；E～H：4組Desmin蛋白表達(dá)情況；I～L：4組細(xì)胞核與Desmin蛋白merge結(jié)果；免疫熒光染色，×200)

圖2 control組、LPS組、LPS+si-NC組及LPS+si-IRAK1組足細(xì)胞ZO-1蛋白表達(dá)情況(A～D：control組、LPS組、LPS+si-NC組及LPS+si-IRAK1組DAPI核染結(jié)果；E～H：4組ZO-1蛋白表達(dá)情況；I～L：4組細(xì)胞核與ZO-1蛋白merge結(jié)果；免疫熒光染色，×200)

3.control組、LPS組、LPS+si-NC組及LPS+si-IRAK1組足細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α、IKB-α、p65、p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較：control組、LPS組、LPS+si-NC組及LPS+si-IRAK1組足細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α、IKB-α、p65、p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LPS組、LPS+si-NC組足細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α、p65、p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)水平均高于control組，IKB-α蛋白相對(duì)表達(dá)水平均低于control組(P<0.05)。LPS+si-IRAK1組足細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α、p65、p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)水平均低于LPS組、LPS+si-NC組，IKB-α蛋白相對(duì)表達(dá)水平均高于LPS組、LPS+si-NC組(P<0.05)。而其余各組間兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 control組、LPS組、LPS+si-NC組及LPS+si-IRAK1組足細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α、IKB-α、p65、p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

4.control組、LPS組、LPS+si-NC組及LPS+si-TRAF6組足細(xì)胞Desmin、ZO-1蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較:control組、LPS組、LPS+si-NC組及LPS+si-TRAF6組足細(xì)胞Desmin、ZO-1蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LPS組、LPS+si-NC組足細(xì)胞Desmin蛋白相對(duì)表達(dá)水平均高于control組，ZO-1蛋白相對(duì)表達(dá)水平均低于control組(P<0.05)。LPS+si-TRAF6組足細(xì)胞Desmin蛋白相對(duì)表達(dá)水平均低于LPS組、LPS+si-NC組，ZO-1蛋白相對(duì)表達(dá)水平均高于LPS組、LPS+si-NC組(P<0.05)。而其余各組間兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖3、4及表3。

圖3 control組、LPS組、LPS+si-NC組及LPS+si-TRAF6組足細(xì)胞Desmin蛋白表達(dá)情況(A～D：control組、LPS組、LPS+si-NC組及LPS+si-TRAF6組DAPI核染結(jié)果；E～H：4組Desmin蛋白表達(dá)情況；I～L：4組細(xì)胞核與Desmin蛋白merge結(jié)果；免疫熒光染色，×200)

圖4 control組、LPS組、LPS+si-NC組及LPS+si-TRAF6組足細(xì)胞ZO-1蛋白表達(dá)情況(A～D：control組、LPS組、LPS+si-NC組及LPS+si-TRAF6組DAPI核染結(jié)果；E～H：4組ZO-1蛋白表達(dá)情況；I～L：4組細(xì)胞核與Desmin蛋白merge結(jié)果；免疫熒光染色，×200)

表3 control組、LPS組、LPS+si-NC組及LPS+si-TRAF6組足細(xì)胞Desmin、ZO-1蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

5.control組、LPS組、LPS+si-NC組及LPS+si-TRAF6組足細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α、IKB-α、p65、p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較：control組、LPS組、LPS+si-NC組及LPS+si-TRAF6組足細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α、IKB-α、p65、p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LPS組、LPS+si-NC組足細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α、p65、p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)水平均高于control組，IKB-α蛋白相對(duì)表達(dá)水平均低于control組(P<0.05)。LPS+si-TRAF6組足細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α、p65、p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)水平均低于LPS組、LPS+si-NC組，IKB-α蛋白相對(duì)表達(dá)水平高于LPS組、LPS+si-NC組(P<0.05)。而其余各組間兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 control組、LPS組、LPS+si-NC組及LPS+si-TRAF6組足細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α、IKB-α、p65、p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

6.control組、LPS組及LPS+si-IRAK1組足細(xì)胞TRAF6蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較：LPS組足細(xì)胞TRAF6蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)水平均高于control組(1.87±0.23比1.12±0.17；1.79±0.09比1.15±0.10，P<0.05)。LPS+si-IRAK1組足細(xì)胞TRAF6蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)水平均低于LPS組(0.93±0.21比1.87±0.23；0.87±0.16比1.79±0.09，P均<0.05)。

7.Co-IP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IRAK1與TRAF6結(jié)合情況：陽(yáng)性對(duì)照條帶證明足細(xì)胞可表達(dá)IRAK1、TRAF6蛋白；免疫沉淀(IP)IgG未見(jiàn)結(jié)合條帶,證明實(shí)驗(yàn)中不存在與IgG的非特異結(jié)合；IP IRAK1條帶表示利用蛋白IRAK1進(jìn)行沉淀實(shí)驗(yàn)，IRAK1與TRAF6均被沉淀，由此證實(shí)IRAK1與TRAF6之間存在相互作用。見(jiàn)圖5。

圖5 Co-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果(a:陽(yáng)性對(duì)照；b:IP IgG；c：IP IRAK1)

討 論

DKD是糖尿病最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，也是慢性腎臟病的主要原因，最終可致終末期腎病甚至死亡[10-11]。足細(xì)胞已被證實(shí)是DKD中腎臟損傷的重要靶點(diǎn)，在維持穩(wěn)態(tài)方面面臨特殊挑戰(zhàn)[12]。足細(xì)胞損傷的特征是特異性蛋白下調(diào)，包括nephrin、WT1及ZO-1[13]；Desmin是一種細(xì)胞中間纖維，足細(xì)胞受損時(shí)在腎小球中高度表達(dá)，也是足細(xì)胞損傷的典型指征[14]。本實(shí)驗(yàn)利用LPS處理足細(xì)胞后，其ZO-1、Desmin蛋白異常表達(dá)，證明成功構(gòu)建DKD足細(xì)胞損傷的體外模型。

大量證據(jù)表明，IRAK1是免疫信號(hào)通路的核心，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，如惡性腫瘤、代謝紊亂(如糖尿病)、感染和非傳染性免疫疾病[15]。本研究中LPS組足細(xì)胞IRAK1蛋白和mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著升高，為研究足細(xì)胞損傷提供了新方向。盡管DKD傳統(tǒng)上被認(rèn)為是一種非免疫性疾病，但越來(lái)越多的臨床和動(dòng)物模型研究表明，先天免疫系統(tǒng)的激活和炎癥機(jī)制在DKD的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[16]。本實(shí)驗(yàn)中LPS組足細(xì)胞炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α、p65、p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)水平高于control組，LPS+si-IRAK1組足細(xì)胞上述指標(biāo)均低于LPS組，表明LPS誘導(dǎo)足細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，敲低IRAK1可調(diào)控NF-κB通路進(jìn)而抑制炎性因子釋放而影響細(xì)胞功能，證明IRAK1在DKD的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。

NF-κB信號(hào)通路參與免疫、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[17]，且與細(xì)胞中其他信號(hào)通路組成包含正、負(fù)調(diào)控的完整信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[18]。TRAF6作為E3 泛素連接酶，可激活I(lǐng)κB 激酶(IKK)，導(dǎo)致IκBα降解和P65核易位，是NF-κB信號(hào)激活的信號(hào)傳感器[19]。本實(shí)驗(yàn)中LPS組足細(xì)胞TRAF6蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)水平均高于control組，且LPS+si-TRAF6組足細(xì)胞ZO-1、IL-1β、IL-6、TNF-α、p65、p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)水平均低于LPS組，證明TRAF6通過(guò)NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)炎癥過(guò)程，與Gao等[20]研究結(jié)果一致。為了探討IRAK1與TRAF6之間的調(diào)控關(guān)系，我們敲低IRAK1后檢測(cè)足細(xì)胞TRAF6蛋白和mRNA相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果顯示，LPS+si-IRAK1組足細(xì)胞TRAF6蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)水平均低于LPS組，表明TRAF6受到IRAK1的調(diào)控，且Co-IP實(shí)驗(yàn)證實(shí)二者存在結(jié)合。因此我們推斷，LPS誘導(dǎo)足細(xì)胞后，IRAK1通過(guò)與TRAF6結(jié)合并調(diào)控其活性，進(jìn)而靶向NF-κB通路，導(dǎo)致足細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

然而，本研究仍存在一定局限性，僅探討了IRAK1在足細(xì)胞損傷體外模型中的作用和機(jī)制，并未涉及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分，我們將在未來(lái)進(jìn)一步探討。

綜上所述，IRAK1是DKD足細(xì)胞損傷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要組成部分。沉默IRAK1表達(dá)可通過(guò)TRAF6/NF-κB信號(hào)通路抑制炎癥反應(yīng)從而改善腎臟損傷，IRAK1/TRAF6/NF-κB環(huán)可能為DKD的分子機(jī)制探討提供新見(jiàn)解，從而為治療DKD提供新的理論依據(jù)。